Alcalase蛋白酶降解大豆胰蛋白酶抑制剂的研究

食品 与发酵工业 Pood and Fermentation Industries Vol 27 No．1 Alcalase蛋白酶降解大豆胰蛋白酶抑制剂的研究 杨晓泉 陈 中 黄纪昆 (华南理工大学食品与生物工程学院，广州 ．510641) 摘 要 研 究了不同酶解条件下(pH值 、温度 、时问、加酶量和潺加巯基还原 剂)．碱性 内切蛋 白酶 Alralase对大豆蛋自和大豆胰 蛋 自酶抑制 荆的降解 作用。研 究结果 明，AIcal~ 可 同 时降解大豆蛋 白和胰蛋 自酶抑制 。谈酶解 夏应 的最适条件为：pH8．0、温度 60℃ 、最适加酶 量 10／zl2g蛋 自(约 0．02832AO／g蛋 自)．薅加 N~,SO3为 (Na2SO3)：0．3％．木解 时问 4 h。 在此条件下．残留胰蛋 自酶抑制 活性为对照的 20％．可溶性蛋 自音量可达 27mg／mL，游 离氧 基酸含量 为7．1mg／mI ，大豆蛋 自的水解度 为 8．9％。 还讨论 了Alcalase蛋 自酶降解大豆蛋 白生成小肤的最佳 l曼应条件。 关蕾调 大豆蛋 自 胰蛋 白酶抑制剂 Alcalase 大豆蛋白的氨基酸配 比合理，生物价及 蛋白净利用率接近动物蛋白。且不含胆固醇， 是公认理想的食用蛋白资源。但是大豆蛋 白 也存在胰蛋 白酶抑制剂(STI)等多种营养限 制因子，限制 了人体对 大豆蛋 白的 吸收利 用⋯。长时间及 强烈的 热处理虽 可部分钝 化抑制剂活性，但也破坏 了大豆蛋 白的限制 性氨基酸L2l。事实上，蛋 白酶抑翩剂大 多具 有高度耐热的特性，用加热方法不能彻底钝 化豆类蛋 白的 STI活性 。我们从花 生种子 中提取纯化了一种高度耐热耐酸的胰蛋 白酶 抑制剂，发现花 生胰蛋 白酶 抑制剂经 100℃ 水浴 2h仍有 85％的残 留活性 _3]，有报道称 大豆 胰 蛋 白酶 抑 制 剂 在 150℃ 处 理 仍 有 7．6％的残 留活性⋯4。 酶解是大豆蛋白改性的重要方法之一。 限制性酶解不仅可提高大豆蛋白的溶解性 、 乳化性、发泡性和消化吸收率，而且可产生一 些具有生理功效的小肽 ]，因而成为 9o年代 以来大豆蛋白改性的热点 问题。但是 目前人 们对大豆蛋白酶解过程中 sTI钝化或降解 的情况仍不甚明了。在前期实验中，我 们采 用不同的内切蛋白酶(包括术瓜蛋 白酶、胃蛋 白酶和枯草杆菌蛋白酶)降解花生蛋白酶抑 制剂，发现惟有枯草杆 菌蛋 白酶 (subtilisin) 可在常温下部分降解氧化态花生胰蛋白酶抑 制剂，井彻底水解还原态的胰蛋 白酶抑制剂， 证明蛋白酶抑制剂的氧化／还原状 态与其蛋 白酶水解 敏感性 有关 J¨。本文 的 目的是 研 究主要活性成分为枯草杆菌蛋 白酶 A的工 业酶—— caJase对大豆蛋 白和胰 蛋 白酶抑 制剂(STI)的降解作用，重点研究 Alcalase降 解 STI及生成大豆小肽的最适反应条件。 1 材料与方法 1．1 实齄材料和化学试剂 脱脂大豆粉购 自黑龙江三江食品公司。 牛胰蛋白酶、大豆胰蛋白酶抑制剂和苯甲酰一 DL一精氨酸一对硝基 苯胺 (BAPNA)购 自 Sig— rgha公司。Alcalase 2．4L碱性内切蛋白酶(红 棕色半 透 明液体，密度 1．18 g／mL，活力 为 2．4AU／g，按 DMC方法测定 )购 自丹麦 No— vo Nordisk公司。 1．2 大豆蛋白的确解 -第一佧者：博士．副教授。 国家 自蒜科学基金(29806~08)和教育部骨干教师基金资助 收稿时闻：20O0—03—07，改回时间：20O0—05—09 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 27卷 第 1期 橱晓泉等：Atcalase蛋白酶降解大豆胰蛋白酶抑l制荆的研究 19 称取 8．6g大豆脱脂粉．分别加入 5OmI 不同 pH值的 50 mmol／l 磷 酸缓 冲液，在反 应液中加入质量分数为 0．3％的 Na2s( ，并 加入不同浓度的 Akalase蛋白酶，分别在 4O、 5O、6O及 70℃振荡水浴 l～4 h，反应液迅速 抽滤 澄 清，取 200,uI 反应 液．加入 10 L p(SDS)=100 g／I SDS终 止反应，以 1：10 (v／v)比例加入玲丙酮(一4O℃)，迅速沉淀 蛋 白，按 1．3进 行蛋 白酶水解 产物 的 SDS- PAGE电泳分析。另一组反应液迅速 加热至 90℃，保持 10min灭酶 ．1O000g离心 25min， 取上清液按 1．4测定残 留胰蛋 白酶抑制剂的 活性，按 1．5测定蛋 白质水解度、游离氨基酸 含量。 1．3 SDS-PAGE电泳分析 反应液加入等体积 的 50 mmol／L Tris- HCl缓 冲 液 (pH6．8含 p(SDS)：50 g／L SDS；体积分数为 10％的 8_m ；体积分数为 20％的甘油 ；p(溴酚兰 )=0．2g／L溴酚兰 )。 SDS-PAGE按 Laemmli_6 方法。浓缩胶 浓度 4％，分离腔浓度 12．5％。25mA恒流电泳 6 h。电泳结 束 后，凝 胶 用 p(考 马 斯兰 R一 250)：2．5g／L染色．体积分数 30％的 甲醇 和体积分数 10％冰乙酸脱色。 1．4 麓蛋白一抑制搠活性测定 残留胰蛋白酶抑制剂活性测定按 Smith 等 】的方 法并加 以简 化。其中胰蛋 白酶 活 性测 定 以 苯 甲酰．DL-精 氨 酸一对硝 基苯 胺 (BAPNA)为底物。牛胰蛋白酶 (250 u／n珥) 500 溶 于 200止 50 retool／L Tris-HCI (pH7．5含 20mmol／L CaCl2)缓冲液，加入 1 mL1retool／LBAPNA，37℃水浴 10min，加 入200／zL体积分数为30％的醋酸终止反应， 测定 410nm吸收值。取 1mL反应液与牛胰 蛋白酶溶液混合后(以抑制 50％～60％为 宜)于 37℃水浴 10rain，测定反应液 的 410 nnl吸 收值。以 未加反 应 液的处 理 为对 照 样 STI的残留活性 (％)=[(反应液 】0一 对照样的 ～1o)／胰蛋白酶 0)]。 1．5 蛋白曩漕■性和水并度漏宅 总蛋白含量按微量凯氏定氪法测定。经 酶解后的可溶性 蛋 白含量 (mg／mL)按双缩 脲法测 定，以牛血 清 白蛋 白(BSA)为标准。 蛋 白质溶解性用可溶性蛋 白含量表示。游离 氨基酸含量(rag／m! )按 甲醛滴定法测定，以 甘氨酸为标准。蛋 白质水解度(DH)=游离 氨基酸含量／总蛋 白含量 J。 2 结果与讨论 2．1 大豆蛋 白的醴解 Atcalase蛋 白酶 由地衣芽孢杆菌生产而 得，该酶的有效成分枯草杆苗蛋白酶 A是一 种碱性 内切蛋 白酶，主要 催化 部位是 丝氨 酸L4J。我 们用 SDS-PAGE方法 测 定 了 AI． calase蛋白酶对 大豆蛋 白和大豆胰蛋 白酶抑 制剂的降解作用(图 1)。发现在添加质量分 数 0．3％ Na2SO3的条件下，Atcalase降解大 豆蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂的最适条件为 pH8．0、温度 60℃、最适加酶量为 10 L／g蛋 白。在此条件下，大豆蛋 白和大豆胰蛋 白酶 抑制剂被 降解为低分子量的多肽(图 1处理 3)。而降低 pH值(处理 2)、减少酶 解时间 (处理 4)、提 高酶解温度(处理 5)、减少加酶 量(处理 6)可降解大豆蛋 白 1ls和 7S蛋 白． 但不能彻底 降解大豆胰蛋 白酶抑制剂，其中 pH值和温 度对该酶 解反应 的影响最大，而 7O℃处理 明显钝化了 Atcatase蛋 白酶的活性 (图 1)。说明该酶对 pH值和温度比较敏感。 在前期实验 中，我们发现 subtilisin降解花生 胰蛋 白酶抑制剂的最适温度为 3O～40℃[ ， 低于 Atcalase降解大豆胰蛋 白酶抑制剂的最 适温度。说 明Atcalase蛋白酶与单纯的 sub． tilisin不完全相同．但也可能源于花生胰蛋白 酶抑制剂与 STI在性质上的差别。 2．2 醴解对大豆麓蛋白醇抑制活性的钝化 本文利用 BNPNA法测定了不同处理条 件下 Atcalase蛋白酶水解对大豆蛋 白的胰蛋 白酶抑制活性的钝化作用(图 2～5)。 图 2～5显示对大 豆蛋白进行 AicMase 酶解处理可钝化大豆蛋白的麒蛋自尊抑制活 维普资讯 http://www.cqvip.com 食品与发酵工业 Food and Fermentetion Irldtmtries Vo1．27 No．1 图 l Alealase降解大豆蛋 白和 大豆荻蛋 白酵 抑制剂的 sDs．PAGE分析 1一大豆蛋白《未加酵 )；2一酵解 pH6 0．其余同3；3一酶 解条件为 pi-18．0、60℃ ，4h、加酵量 10~L／II蛋 白；4一酵 解时间为 1 h．其余同 3；5一酵解媪度为 40E，其余同 3； 6一酵解温度为 70℃．其余 同 3；7一加酵量为 2．5~L／II 蛋白．其余同 3；8一加酵量为 15 g蛋白．其余同 3 49 一 大豆 蛋白酵 抑制利。每十 处理均 加 入质量分 散 为 0．3％的 Na2SO~。 100 《 80 赡 4q 60 辱 40 鼬 蕾1 20 0 图 2 酵解时间对大豆胰蛋 白酵 抑制活性 的影响 100 《 80 !I坚 6O = 盖 40 蕾1 20 0 0 20 4U 邮 80 羞 度 ／℃ 图 3 酵解温度对大豆荻蛋 白酵 抑制活性 的影响 性，其撮适酶解条件与 SDS-PAGE测定的结 果相吻合，但各种处理只能将大豆蛋白的胰 蛋白酶抑制活性钝化约 60％～70％(添加质 量分数 0．3％的 N 2003)，延长酶解时间，增 加加酶量并不能将大豆蛋白胰蛋白酶抑制剂 (STI)完全钝化(图 2、图 5)。这种现象和大 豆蛋 白溶液在 80"C热钝 化时延长时间所得 到的效果相似[2l。有研究表明，低频超声处 理可将豆奶中 STI活性降低 70％．但延长超 声处理时间并不能继续降低 STI的活性[9I。 l0o 芝 80 4 jIg q 60 §40 鬃 20 0 l0o 芝 80 1Ig 4q 60 星 0 鬣 20 0 4 6 洲 8 1O 图 4 pH值对大豆胰蛋 白酵 抑制活性的影 响 图 5 加酵量对大豆荻蛋白酵抑制活性 的影响 大豆蛋白的胰蛋 白酶抑制剂根据氨基 酸序列 同源性 分 为 Kunltz及 Bowman-Birk 抑制剂(KTI与 BBTI)两类．其 中 KTI约占 大豆 蛋 白总量 的 1．4％，BBTI约 含 0．6％． KTI与 BBT1分别 含有 2个和 7个二硫 键L4J。由于二 硫键在 稳定蛋 白质结构方面 起关键作用，因此 BBTI比KTI对热 、酸和酶 解的处理 不敏感⋯4。本文 比较 大 豆蛋白酶 解的 SDS-PAGE 电泳 图谱 和胰 蛋 白酶抑制 剂活性测定结果，认为 Alcalase蛋 白酶主要 降解大 豆的 KTI抑制剂，而对 BBTI的降解 效果较差。此外，本文发现提 高温度 (70℃) 反而降低了 Aleaiase蛋白酶对 STI的钝化效 果，说明高温会使该酶失去活性。 我们的研 究发 现 8ubtilisin降解 STI纯 品的撮适温度为 35～55℃,pH值 8 、酵活 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 27卷 第 1期 扬晓泉等 ：Alcala~蛋 白酶降解大豆脯蛋 白酶抑制剂的研究 2l 力 40000Iu／mI 及 ≥40min的 反应 时 间_J Alcalase蛋白酶降解 STI的最适 温度 略高于 subtilisin。说 明 Alcalase蛋白酶与单 纯的 subtilisin不完全相同。A1cala~e蛋白酶 同时也含有其它类型的蛋白酶。 2．3 酶解对大豆蛋 白溶解性和水解度的影 响 本文研究了大 豆蛋白经 Alcalase蛋白酶 降解 后 的溶解性 和水解 度。研 究发 现 A1． calase蛋白酶处理可明显提高大豆蛋 白的溶 解性，但水解度较低(表 1、2)。其最适酶解 条件与Alcalase蛋白酶降解 STI的最适酶解 条件相吻合。即当酶解条件为 pH8．0、60℃、 4h、加酶量 1O L／g蛋白时，可溶性蛋白含量 可达 27rag／mL，游离氨基酸含量为 7．1m mL，水解度为 8．9％。结合 SDS-PAGE结果 (图 1)可知。这时大豆蛋白主要 产生各种低 分子量的小肤。 表 1 时间和疆度对一解后可溶性置白、蕾一鼻基曹含量和水解度的影响 时 间／h 温 度／℃ 1 2 3 4 40 50 60 70 可涪性蛋白／廿1g·mL。。 21 6 24．7 26．5 27．0 21．8 26．0 27．0 1B1 游离鲁【基酿／rim·rⅡL。。 2．B 2．9 6．1 7．1 3．8 6．6 7．1 1 5 水懈 度／％ 3 5 3．6 7．6 8．9 4．8 8．2 8．9 1．9 表 2 pH值和加一■对酶孵后可溶性置白、游一奠基酸含量和水解度的影响 pH值 加酶t'／止 ·g。。蛋白 6 7 B 9 2．5 5．0 l0 15 可溶性蛋白／w,·mL 21．0 24．2 27．0 26．6 1B．7 22．4 27 0 28．9 罅离氨基酸／w,·mL 3．3 6．4 7．1 7．1 3．0 4．9 7 1 7．4 求解度／％ 4 1 8．0 B．9 8．9 3．B 6．1 B．9 11．1 研究表明，人体吸收 小肽的能力要大 于 对游离氨基酸 的吸收 J。而适用 于婴儿食 品的大豆分离 蛋白的最 佳水解度为 10％ ～ 20％。具此 水 解度 的 大豆 蛋 白在 等 电 pH 4．3的情况下仍保 持 良好的溶解性 ，消化吸 收率比未水解的大豆分离蛋白的消化吸收率 高 10％左右 J。一般而言，内切蛋白酶 (内 肽酶)生成 氨基酸的能力较低。本文的结果 表明，AIcalase水解大豆蛋白的水解度一般低 于 10％，增加酶解时间和加酶量不能继续增 加水解度。因此 Alcalase适用于大 豆肤的生 产。本文的研究显示，可通过改变酶解条件 控制大豆肤的生成量。例如将酶解 pH值 由 8．0降 为 6．O；或 将 酶 解 温度 由 60℃ 降 为 40℃，水解度 可 由 25％ ～27％降为 13％～ 17％(表 1、2)，大豆肤 的生成量也明显增 加 (图 1)。如何控制酶解条件，产生一些具 有 生理功效的 小肤将是 今后进 一步研究的方 向。 ● 考 文 献 1 Friedman M ．Nutritional an d Toxicological Aspects 0f Food Safety．New York：Plenum Press． 1984．1O一 18 2 Kwok K C．Niranjan K J．Food Sci．Tech ， l995．30：268— 272 3 扬晓泉。文方德等 ．营养学 报，1998，20：246 — 252 4 Birk Y．【nt．J．Pept Res．．1985．25：1l3～ 118 5 Bautista J J．Agric．Food Chem．，1996，44： 967～ 971 ． 6 Laemmli U K．NaruTe．1970。227；680～681 7 Smith C，M egen W V，Hitchcock C et a1．J．Sc1．Food Ag c．，1980，31：341-348 8 赶新淮 ．食 品科学 ．1994．11：25～28 9 杨汝德．梁汉华，郭乾初 ．华南理工 大学学 报．1998，26：66—71 l0 陈中 华南理工大学博士论 文，1999．p58 维普资讯 http://www.cqvip.com 22 食I 发酵 l：业 Ftxxl snd Fcrmenlatio~lndustrit．~ Vol 27 N[)_1 Hydrolysis of Soyprotein and Trypsin Inhibitor by Alcalase Yang Xiaoquan Chen Zhong Huang Jikun (Del~rtment of Food Science．Souih China Univershy 0r Technology-Guangzhou，510641) ABSTRACT Hydrolysis of defatted soybean meal and inactivation of soybean trypsin inhibitor by Alealase in difierefit cond itions(pH time，temperature，enzyme dosage and NazSO3 added)w蠲 studied by SDS-PAGE and BAPNA method respectively．The results showed that the optimum conditions of this reaction were：pH8．0，60℃，Alealase added at 10 vLtg proteins(0．02832 AU／g proteins)and 0．3％ o~(NazS(h)added．After hydrolysis at this condition，the residue ac· tivity of soybean trypsin inhibitor decreased to 20％．the concentration of soluble protein，free amino acid(FAA)and hydrolysis degree(DH)were reached their maximum 27 nag／mI ，7．1 mg／mI and 8．9％ respectively．The paper also discussed the preparation of small peptides from so yprotein by Alcalnse hydrolysis． Key words so y pro tein，try ps in inhibitor，Alealaso 政耒、法藐、协准 国家将大力扶持食品工业发展 国束计 委、经 贾委近 日发布 了<当前 国京重点鼓 j西发展的产业、产品和技术 目录>，其 中涉及食 品 面 的有 3O隶种。该 目录将是国京引导改变投碍结构及 审批报 懵项 目的主要依据之一。 在食品方面．‘目录>鼓励 发展 的产 业、产品和技 术包括 ：动植物优 良品种繁育 ；奶 业；商品粮 油 糖 等 农产 品基地 建设 ：l水产 品 生态养殖 ：农产 品储 藏、保 群 、加工及纬告利用 ；农、渔、畜、糖等产 品源加 工及 懵 谭利用设备制造；粮食、赍糖、食用 油等 主要商品的现 代化仓储设施建设等方面。 此外．诚 目录是在 1997年 国家计 委颁布 的试行 目录的基础上．根据在执行过程存在 的问题及 国内外 市场环境 的蹙化 ．广泛征求有关部门 、地方和企业 意 见后制定出来 的。其确定 的原则是：当前和夸后一 个 时期有较 大的市场需求．发展前景广 阔．有利于开拓 国内市场 ：有较 高的技 术音 量．有利 于促 进企业设 备 更新和产 业技 术进步，提 高竞争力；国内存在从研 究 开发到宾现产业化 的技 术基 础，有利于技 求创新．形 成新 的经济增长 点；符合可 持续发展战略，有利于 节 约资源和改善生态环境；供给能力相对滞后，提高其 供给能力。有利于促 进经济 结构 的合理化，保持国 民 经济持 续快速健康 发展。 信 _I窗 产品名待 原 盐 机制糖 乳制 品 罐 头 2000年 1～10月份全国食品工业主要产品产量 产量／万 t 2681．77 503．30 66．63 135．04 同比增长／％ 12．40 — 22．90 28．10 l1．40 产品名祢 自 酒 啤 酒 软饮料 产 量／万 t 355．03 2009．38 1 314．26 同比增长／％ 1 40 8 50 l7 90 维普资讯 http://www.cqvip.com