用克雷伯氏菌批式流加发酵法生产1，3—丙二醇

食品与发酵 工业 Food and Fermentation Industries Vo1．27 No．7 用克雷伯氏菌批式流加发酵法生产 1，3一丙二醇 刘海军 王钊锋 张代佳 修焉龙 1(大连理工大学生物系，大连．116012) 2(大连 民族学院化工系．大连，116600) 摘 要 适过对克雷佶 氏茵在 7L发酵罐 中压氧问戢发酵 可泊生产 1．3一可二酵 的实验研 究， 建王 了一种与 pH 调寺相偶联 的批 式统舻丁油发酵策略。考 察了不司甘油蝗持 浓度条件 下 的流加方式置不同若养方式对 1，3．丙二醇产率的影响。鲑果表 ，甘 油质量分数维持 在 2％ 的漉加方式有利于 1，3-丙二酵 的发酵 生产，其在 30．5 h由÷ 耗 甘沽 280 g．碍到 1．3．丙二 醇 152．6 g．摩尔转化率 65．5％，生产 强度 0．91g／L·h。 关键词 克雷，自氏苗 批式施加 甘、自 1．3一酉二醇 pH调蓝 1，3-丙二醇 (1，3一propaned~ol，简称 1，3一 PD)是一种重要的化工原料，可用作溶剂 、抗 冻剂或保护剂、精细化工原料以及新型聚酯 (如 PTT)和聚氨酯的单体ll J。PTT即聚对 苯二 甲酸丙二酯，是一种新型 的聚 酯材 料。 它与聚对苯二甲酸乙二酯(PET)和聚对苯二 甲酸丁二酯(PET)相比具有更优 良的特性， 如尼龙样的弹性恢复，在全色范 围内无需添 加特殊化学品即能呈现 良好 的连 续 印染特 性，抗紫外、臭氧和氰氧化合物的着色性 ，抗 内应力，低水吸附，低静电以及 良好的生物降 解性能等。这些特性显示出 PTT美好的工 业化前景，它不仅可以作为新型合成纤维 在 地毯和纺织 品方面有着广阔的应用前景，而 且在工程热塑性塑料领域也有巨大的应用潜 力，因此 P1vr将成为 PET、PBT、尼龙 66等 聚合物的强劲竞 争对手[23。 目前，1，3一丙二 醇的工业化生产主要是化学合成法。微生物 发酵法尚处 于实验 室研 究开 发 阶段 。但 从长远发展及环境保护角度来看．微生物法 更具有生命力。与其他微 生物发酵 一样，底 物与多产物抑制同样是微生物发酵法 生产 1，3一丙二醇的主要限制因素，由此导致发酵 液中产品浓度低等问题 · 。发酵液中 1，3一 丙二醇的浓度过低，势必造成产品分离成本上 升，从而导致 1，3一丙二醇总的生产成本升高。 本文基于上述原因，在厌氧间歇发酵批 式实验基础上，建立了一种简便、可行的提高 发酵液中 1，3-丙二醇浓 度的批式流加发酵 策略。通过与 pH调控相偶联进行流加底物 发酵，使发酵液 中甘油含量保持在一十较低 的浓度，有效的减少了底物抑制作用，控制了 生物量 的过 度增 加，大 大提高 了发酵 液 中 1，3一丙二醇的浓度．为进 一步工业化生产研 究奠定了基础。 1 实验材料 与方 法 1．1 实验材料 实验所用菌种为克雷伯 氏菌，购 自中国 普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，编 号 1．1736。培养基 ：种子与发酵培养基均 采 用文献[6]培养基。 1．2 实验方法 方法 ：用比色法检测生物量，即以蒸 馏水为空 白测定发酵液在 650nm下的光 密 度值 (OD值)；甘油的分析方法是改进的高 第一作者 ：硕士研究生。 国家 自然科学基金(No 29806002)~山东大学微生物国家重点实验室开放基金资助项 目 收稿时间：2000一l【I 27、改回时间：2001—02 20 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 27卷 第 7期 刘海军等 ：用克雷怕氏菌批 式流加发酵法生产 1，3-丙二醇 碘酸氧化法 ；1，3一丙二醇、乙酸和乙醇则用 气相色谱法分析 J。 培养方法 ：间歇发酵和批式流加发酵 2 种形式。间歇发酵分 为 2步，首先进行种子 培养，将冰箱保藏菌种接于装液量为 200 mL 的 500mL种子瓶中，于摇 床上 37℃、150 r／ min厌氧培养过夜；间歇发酵在 7L自控 pH 发酵罐中进行，装液量 为 4 I ，甘油初始质量 浓度为 2％．温度和搅拌转数恒定为 37℃和 250 r／min，发酵过程 中向 内通 N，维持 厌氧 条件，用 2．5mol／LNaOH控制 pH7．1。 批式流加发酵的种子培养与发酵培养初 始条件同间歇发酵。首先采用初始质量浓度 为 2％的甘油发酵培养基进行菌体生长，待 菌体生长至对数期．发酵液中甘油 消耗至一 定量时开始流加甘油。流加采用与 pH调控 相偶联的策略 根据 间歇发酵实验得到的甘 油消耗与碱消耗量 的关 系，调节流加泵的流 量与加碱泵 的流量相匹配，使发酵液 中甘油 质量浓度控制在一定范 围内，发酵最后将甘 油全部消耗掉。实验装置如图 1所示。 图 L 批式流加 实验装置图 2 结果 与讨论 2．1 间歇发酵结果 用克雷伯氏菌以初始质量浓度为 2％的 甘油在 7 L发酵 罐 中进行 了 5批 次 间歇发 酵，发酵曲线如图 2所示，实验结果如表 1所 示。从图 2中可以看到，在发酵前 3 h菌体 处于生长适应期，生长速度较慢，甘油消耗速 度也很低；从第 3 h开始，菌体生长进入对数 期，发酵速度也 明显加快，直到第 13 h发酵 结束，菌体仍处于生长旺盛期。由图 中可以 明显看 出，只有在菌体生长旺盛时甘油消耗 速度才较快，1，3-丙二醇 、乙酸、乙醇的生成 速度也加快，这说明要得到较高 的 1，3-丙二 醇浓度就必须维持菌体正常的生长代谢，但 同时还要尽 量减少菌体生长所消耗的甘油 量，尽可能使甘油以最大产率转化为 1，3-丙 二醇。表 1所列的间歇发酵实验中可得到， 每消耗 1mL 2 5mol／L的 NaOH，相应的甘 油的消耗量为 0 37～0．47 g。这说明发酵液 中甘油消耗量与碱加入量之间存在着一定的 比例关 系，因此 我们可以通过调 控 pH的方 式来控制发酵液中甘油的质量浓度。 表 1 甘油初始浓度为 2％批式发酵结果 批 捉 l 2 3 4 5 12 13 5 13 13．5 13 8 35 6 53 8．31 7 61 8 06 41 8 32 7 41．6 38 1 40．3 50 5 39．5 50 3 46 1 48．8 0．66 0 48 0 64 0．56 0．62 213．1 169 5 177 4 181．3 171．2 反应 时 间／h 1．}H]终质量旅度／g-L 1．3-PD对甘油 质量转化率／％ 1．3-PD对甘油 摩尔转化率／％ 生产强度，g(L·h)。。 喊消耗量／r【LI 发酵时 ，h 图 2 初始甘油浓度为 2 96间歇发酵 曲线 2．2 批式流加发酵结果 根据间歇实验结果，参照文 献了一 种与 pH调控相偶联的流加甘油发酵策略。 ㈨ 鲫 蛐 ㈨ ．． _．营 《自 维普资讯 http://www.cqvip.com 食品与发酵上业 Food and Fermentation Industrie-~ Vo[．27 No．7 即与加碱泵并联一个加料 泵，通过调节 2个 泵之间的流量 比来控制发酵液中甘油的，以 维持发酵液中甘油恒定。我们进行 了甘油维 持在 2％、0．5％及 0．1％～0．3％等水平流加 发酵实验。这其中又通过改变发酵培养基组 成，进行了流加发酵，考察了不同发酵培养基 对甘油消耗、生物量增长及 l，3一丙二醇生成 的影响。实验结果如图 3，表 2所示。 表 2 批 式滤加发酵实验结果 批 次 。 1 2 3 4 发酵 时 间／h 30 5 26．8 31．5 27 甘油消耗量／2 280 328 215 195 甘油终质量最度，rL一 51．2 65．6 47 8 41．1 1．3 PD终质量准度／ L 27．75 2s．07 19 69 15．68 ： 0 的 54．2 38．2 41．2 38．2 质量转化率／％ ⋯ 。 的 65 ．5 4㈤ 49．9 4¨ 唯 尔转化 率／％ ⋯ ⋯ 。⋯ ‘⋯ ‘ (L·h)一 0．91 0．94 0．63 0 67 注 ：批次 1为甘油质量浓度维持在 2％漉加发酵实验 ； 批随 2为用 葡 萄糖 作 辅 助 底 物 甘 油 质 量 浓 度维 持 在 0．5％；批随 3为甘油质量浓度维持在 0 1％～0．3％；批次 4为无铵发酵培养基甘油质量浓度维持在 0．1％～0 3％。 l【I 1【l0 2n 0 舯 ．{) 帅 n 发酵时 m 图 3 批式流加发 酵曲线 从实验结果可以看出，以甘 油质量浓度 维持在 2％水平的流加发酵实验结果最好， 其消耗甘油总量为 280 g。1，3-丙二醇终质 量浓度为 27．75 I ，1，3-丙二醇对甘油的摩 尔转化率达到 r 65．5％，生产强度为0．91g／ (I ·h)。生物量也基本保持恒定。其与 2％甘 油质量浓度的间歇发酵相 比，1，3-丙二醇的 终质量浓度提高了 3．32倍，生产强度提高了 1．37倍。比较而言，以葡萄糖作辅助底物的 流加发 酵结 果，虽 然甘 油消耗量最高，但其 1，3-丙二醇产率并 不高，只有 46．25％。而其 生物量增长幅度较大，可见添加葡萄糖作辅 助底物有利于菌体生长，造成发酵液中菌体 生长消耗过多的甘油，使得 1，3-丙二醇产量 降低。其他 2批实验 的结果也不很理想。甘 油消耗与 1，3-丙二醇产率都不高，生物量增 长却高于批次 1。 在实验过程中，我们观察到，该菌种的生 长代谢周期在 31h左 右，而其发酵旺盛期 在 8～25h之间。因此，在菌体生长代谢旺盛期 时，就应该保证底物微过量的状态，这样既能 抑制菌体的过量增长，又能使底物消耗与产 物生成速度都加快，从而提高发酵液 中 1，3一 丙二醇的质量浓度。另外，发酵液 中除产物 1，3-丙二醇外，其他副产物的积累也会对 菌 体生长代谢起到抑制作用，相对而言，底物抑 制作用不很明显，所以应该加强对菌种 自身 能力的改造 ，提高其抗高产物浓度抑制的能 力，以达到高产的目的。 ． 由于本文中所采用的菌种为原始菌种． 其发酵能力与国外某些文献报道的结果相 比 还相对较低。但其除了能在厌氧条件下发酵 甘油生产 1，3-丙二醇 外，在好氧条件下也能 得到相近的结果，至今 尚未见文献报道。 3 结 论 与 pH调控相偶联的流加甘油发酵生产 1，3-丙二醇的策略是可行 的，能有效 的提高 发酵液 中 1，3-丙二醇的质量浓度，抑制生物 量的过度增长，从 而使甘油消耗较多地生成 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 27卷 第 7期 刘海军等 ：用克雷伯氏苗批式流加发酵法生产 1，3一丙二醇 7 1，3一雨二醇。比较理想的流 加策略是 ：发酵 培养基甘油初始浓度为 2％，发酵第 5h开始 流加甘油，质量浓度维持在 2％水平。 参 考 文 献 1 修志龙 ．现代化工，1999(3)：33～35 2 张从容 化工商品科技．1999(2)：17～l9 3 Deckwer W 13．FEMS Micmbio]ogy Reviews， 1995(16)：143～ 149 4 Zeng A P et a1．In Fuels and Chemicals from [Sioma&*(Edited by Saha B C and Woodward J )， Amenean Chemical Society，1997．Pp 265～279 5 United State Parent，5．1108，473，Apr 16 1991 6 U nited Stare Patent．5，599．689．Feb 4．1997 7 United States Pharrnacopoeia(UsP)，1995． P713～ 714 8 Biebl H． M enzel K． Zeng A P et al Appl Microbiol Bio~eehno]，1999(52)：289～297 9 BiehI H．Marten S App] Micmbiol_Biotech— no1．1995(44)：15～ 19 10 Reimanm~．BiebI H ． BioteehnoI Lett．． 1996(18)：827～832 11 G0nze]B，YooseI S．Deckwer W D Appl MicmbioI Biotechnd ，1991(36)：289～294 Fermentative Production of 1，3-Propanediol bv K bsiella pneumoniae in Fedbatch Culture Liu Haijun Wang Jianfeng Zhang Daijia Xiu Zhilong 1(Biotechnology Department，Dalian University of Technology，13ahan．116012) 2(Chemical Engineering 13epartment，Dalian National Institute．Dalian，116000) ABSTRACT A fedbatch strategy WaS developed coupling the feeding of glycem1 to pH contco1 through the experimental research of 1．3-propanediol production in 7 I fermentor by Ktebsiella pneumoniae under anaerobic condition．The influences of severa1 fedbateh strategies under differ— ent glycero1 concentrations in vessel and different culture methods were studied．Experimental re— sults showed that the fedbatch strategy of 2％ glycero1 concentration in fermentor is propitious to production of1，3-propanedio1．W hen 280 g of glycerolwaS usedfor 30．5 hours，152．6g of1，3一 propanediol obtained During this fermentation process。 the 1，3-propanedio1 yield was 65．5％ (mol／mo1)and the overal1 productivity of 0．91 g／(L·h)could be reached． Key words Klebsielta pneumoniae，fedbateh culture，glycerol， 1，3-pm panediol，pH contto1 ● ● I● {● ● ’-● ⋯ ～ ⋯ ● ● I·● ● I一 ⋯ ⋯ ● I— ● _ ● 1● ● I● ● ⋯ _，● {·● ● I-● ● 一 ● ● I● 市场动 态 2000年美国节食软饮料韵10名品牌 维普资讯 http://www.cqvip.com