高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的分离与制备

纠 ． 喜， 琛 ， 精 细 化 工 1994年第 11眷 0 高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯 (EGCG)的分离与制备 戚向阳。 谢笔钧u 慰望 ( 。五 学古 蓠孚， 攫，邮蝙430070) c J 绿茶的乙醇浸提藏经过淮缩、脱色和革取 ，得到茶多酚粗品．用葡聚糖凝胶 LH--20屡斩柱和箭备 型 HPLC分离提纯 儿茶素组分 EGCG，结构鉴定结果证明所获得的 EGCG其纯 品达到色谱纯缀。 荼儿茶素为荼多酚的主要组分，且大部分 于酯型儿茶素，即 EGCG和表儿茶素没食子 陡酪(ECG)，二者含量约占 70 以上。’。国内 91,x~儿茶素的提取、分离及其生物活性进行了 较广泛的研究，业 已证实儿茶素不仅具有抗氧 ft、捕集体内赫离基、抗衰老、抗辐射、减肥降血 脂等方面的功效，而且还有防癌、抗癌作用，因 此．它具有重要的药用价值“ 。据 日本流行病 学调查结果证实。 ，在盛产绿茶的静冈县，癌症 死亡率低于全国平均水平。从急性毒性测定和 微粒试验结果证明儿茶素属实际无毒级。 ，是 一 -娄非常有发展前途的天然抗癌 、抗衰老药物 。 代国的茶叶资源非常丰富，每年低质茶叶滞销 约 5万 t，因此，深度开发利用茶叶资源的研究 拜有重要意义 。 有关文献⋯ ，茶多酚的提取主要采用 以下途径：有机溶剂浸提一氯仿脱色素、脱咖啡 困一乙酸乙酯萃取一浓缩 、干燥。儿茶素的分离 一 股是用桂层析或高效液相色谱法 ，但所报 道的分离方法大都使用多种有机溶剂，致使溶 利回收困难。作者在此基础上，用比氯仿毒性 小、效果更好的有机溶剂脱色素和脱咖啡因，同 时通过操作较简便且溶剂消耗费用低的柱层析 和 HPLC色 谱 法 分 离 提纯 ，可 获得 高纯 度 EGCG。 和实验方法 1 材料 表业部“八五’重点谭糖．硬士研究生毕业． 绿茶茶叶末由湖北五峰荼厂提供。 2．实验方法 (1)茶多酚制备 称取一定量茶叶末，用乙 醇浸提 ，抽滤 ，滤维经旋转蒸发器浓缩后 ，脱包 和脱咖啡因，水层用乙酸乙酯萃取数次 ．回收乙 酸乙酯 ，得茶多酚粗品 (2)儿茶素的柱层析分离 取一定量茶 多酚 ，用 40 丙酮水溶液溶解后上桂。桂层析 条件：桂尺寸 l、6×80cm，柱填料葡聚糖凝胶 LH一2O，洗脱剂 4O ～8O 丙酮水溶维 ，紫外 检测波长 276~n，泵速 04(10ml／30min)，用部 分收集器收集。 (3)EGCG 的 HPLC 分 离、纯 化 取 5．O0og经桂层析得到的酯型儿茶素组分，溶解 于 10ml28 甲醇水溶液中，注入 HPLC制备桂 进行色谱分离，回收流动相甲醇 ，冷冻干燥得 EGCG纯品。HPLC条件：柱型 Shim—PACK PREP— ODS20mm (I．D．)× 250mm，柱 温 4O℃．流动相 28 甲醇，流速 8ml／min．检测器 UVZ80nm，进样量 0．20ml。 (4)HPLC分析儿茶素各 组分的含量。 将待测组分用 25 甲醇水溶液溶解 ，接下述条 件 分 析；柱 型 Zorbax—ODS PAK C．。 4．6ram(1．D．)×250mm，柱 温 40℃，流 动 相 25 甲醇 ，流速 lmltrain，检测器 UVZ80nm，根 据峰面积计算各个组分的相对百分含量。 (5)茶多酚含量的测定 分光光度法。 。按 一 维普资讯 http://www.cqvip.com 苹 4期 精 细 化 工 EGC(；计算茶多酚的含量。 t6)JL茶素各组分的定性分析 纸上层析 法 ”。 (7)紫外分析 将待测样品溶解于水中，用 Shimadzu uv一265FW 紫外分光光度仪分 析。 (8)红外分析 样品用溴化钾压片法作红 外光谱分 析 。 (9)核磁共振分析 由华中师范大学测试 ·{一心测定 (10)元素分析 由武大化学系分析测试。 结果与讨论 1．茶多酚的提取与制备 (1)浸提溶剂对秦多酚浸出量的影响 从图 l可知，用 70 丙酮或 80 乙醇水溶 液浸提茶叶．效果较好。但用丙酮溶液浸提，脂 济性物质易浸出，不仅难以干燥且溶剂不易回 收 。 图 l 不同搐剂对茶多酚提 出量的影响 茶叶 末 1．00E，爱攫攻 粘 3攻 ．覆 袍时 间 2h，溶 剂 量，茶 叶 tV，埘 ，= 4 I 1． (2)溶剂用量及谩提次数的选择 由图 2、图 3可知，荼多酚浸出量随着溶剂 ffJ量和浸提次数的增加而增大。但当溶剂体积 越过茶叶重量的 3倍，提提次数多于 4次时，即 使再增加溶剂用量或浸提次数，茶多酚的浸出 !i}亦无明显增加。 0 5 | 曼0．3 《 O．2 1：l 2 l 3‘l 4 l 5 1 6；1 禧荆( )，蓑叶( ) 图 2 格剂用量对茶多酚浸出量的影响 茶 叶末 1．0 t己 醇浓度 80 ，茬提 趺 齄 1捷 ．授 提 时 闸 m 6 {o．5 曼0 4 《 O 3 I 2 3 4 5 伏数 图 3 浸提趺数对茶多酚浸出量的影响 蕞 叶末 5．O螗 ，慢 提时 问 lh．乙醇摊 窟 8c) 僻 荆 量 ，茶叶 量( ／聃)=3 l 1． (3)菸多酚中色素及咖啡 因的击除 茶叶中除了茶多酚，还含有 邑素及咖啡因。 文献报道。”一般是用氯仿脱色素和脱咖啡因 ， 为了寻找效果好、安全性高的脱色素及脱咖啡 因的溶剂和材料，比较了离子型树脂 、氯仿、三 氯乙烯、2号溶剂和控制 pH值等方法脱色素和 脱咖啡因的效果，发现用 2号溶剂能达到氯仿 的脱色效果且脱咖啡因的效率可达到 85 以 上，而这种溶剂的毒性远远低于氯仿 ，使用安全 性高且较氯仿容易回收。 采用正交试验，研究了 2号溶剂脱咖啡因 的条件 ，结果见表 1。由表 1可知，A、c两因子 对 2号溶剂脱咖啡因的效果有显著影响．根据 K 、K：、K 值大小，A、C两因子取三水平较好 ， B因子其水平可任选。 E^ 0 《 维普资讯 http://www.cqvip.com 精 !Ⅲ 化 工 1994年第 1l告 丧头世计 A B C D 宴 验 结 果 萃取藏量 萃取时问 萃取趺越 A 丽 相分离效果 (rain) 《272rim) (V ，Vt1 l lfl|Z) 1(1 】 1(1次) 0．186 乳化严重 Z lfl|2) Z( 】 zf2次) 2 D．155 乳化严重 l{l|Z) 3(3 ) 3f3次) 0．129 乳化严重 2{l|1) l{l ) 2{2次 ) 0．135 分屡较 易 2(1-1) 2{ ) a(a次 ) l 0．120 分层较 易 6 2(1‘1】 3(3 ) l(1次) 0．169 分层较易 7 3(2‘l】 l(1 ) 3(3次 】 2 0 l04 分 屠署 8 3(Ztl】 2(2 ) l(1次) 0．151 分屡 暑 3(2‘l1 3(3 】 2(z次) 0．112 分屠 易 Kt 0．4ZS I)．S06 0．4l8 K u．426 0．428 K， O．4lI) 0 353 0．42S R1 O．n343 O．01~533 札 ∞ 33 注；蕞佯为 l1)-00g萘叶末烃 80 己醇椿演{曼捷后，抽薄·回收己醇-用承定喜至 100m (4)乙酸 乙酯革取 苯多酚 茶叶提取物经脱色和脱咖啡因后，还含有 较多的非儿荣素物质，需进一步分离、纯化。本 研究选用乙酸乙酯进行萃取、提纯，其萃取条件 见表 2。由表 2可知，A、B、c三因子水平的变化 对萃取效果影响的显著性依次为 B>A>C，考 虑到指标值越大越好 ，A、B两因子取三水平较 好 ，C因子可任选。 表 2 己酸己醢萃取萧多酚的条件 丧头 A B C D 宴 齄 结 果 茔墼 量 萃取趺越 糖蔼时问 I葶品量 相分离效果 tVl，Vi) l I(1-1) l(1次) 1(1 ) 0．362 少许乳化 1(1t1) 2(2趺 ) 2( ) O．4l8 步 许乳化 l【l I) s(3墩1 3 ' 少许乳化 2f2|1) 1fl趺) 2(2 ) 【)39Z 易分屡 S 2‘2l1) 2t2文) a‘ ) O．435 暑分 层 2(2-1) 3‘3趺 ) l(1 ) 0．45【’ 易分屡 3(3t1) 1(1改 ) 3f ) 0．4l0 易升 甚 3f3I1) z(z趺 】 lfl 】 1]．485 导分层 3{3|1) 3{3趺 ) 2{2 】 489 易分 层 K ， 0．405 0 388 0．426 0．429 2 0．4Z6 O．433 0．426 ， 0．455 O．458 0．426 0．43O R1 0 05 O．07 0．007 O．004 讫 茶怿为 ln n g茶叶甩沸承煮沸 ∽m 后，抽谴 ，甩承定喜至 10Om 维普资讯 http://www.cqvip.com 筑 蛐 辅 细 化 工 ·43· 槛据上述提取条件重复三次实验，每次取 菜叶求 50．oog．茶多酚的得率、含量见表 3。 矗 3 蒂多酚的得率及纯度 得率 蕞_多册 分量 咖啡园 量 ” 品 f ) f ) f ) 善瞬 韫品 l2．53士J．80 75．43士0．283 5．30士0．392 往：蕞时中莱 多野含量 17 65％ 咖啡囡含量 s．64％’承 讣 蚺 9．8O ． 2．儿茶素的桂层析分离 儿茶素各组分 的化学结构和性质相近．采 flj一般方法很难分离。文献报道 通常以硅 脞、三 铽化二铝、聚酰胺、葡聚糖凝腔 LH～20 歧亲永性多孔聚合物 T0yopear[HW一40F为 丰=l=填 料用于 儿茶 素的分离．其 中葡聚糖凝胶 【．Ij一2O及 Toyop~aTI HW 一40F的分离效果 较 妤 但 T．Ozawa“ 用 Toyopearl HW 一40F 忻柱分离儿茶素以丙酣按浓度梯度进行洗 脱 ．淋洗剂易出现气泡，影响分离效果+操作不 控 制，而 Saijo Ryoyasu 利 用葡聚糖凝 胶 I ll--20柱分离儿茶素使用甲醇、正己烷、乙酸 乙哺等多种有机溶剂作为洗脱剂 ，且经过重复 fI：层折及重 结晶 方法方 可得}1I纯 度较 高 的 ECCG。这种分离方法繁琐、费时。 本研究选用葡聚糖凝胶 LH一20及丙酮洗 脱利分离儿茶素，可得到纯度较高的酯型儿茶 嚣。用联析拄[1 6(1．D．)×80cm~做分离条件 验，取 5．oog荼多酚粗品，用 3ml40％弼酮水 溶液精胄拜，上柱 ，用不同浓度的丙酮 水溶液进行 讹脱．发现用 40 丙酮水溶液作为洗脱剂分离 儿茶素，效果较好 ，但所需时间较长，且出现严 呕拖尾，收集后损失大，得率低，见囤 4所示。用 50 ．60 及 80 丙 酮 水 溶 液进 行 洗脱 ，分 离 敏 均不好。 4O 丙酮水溶液洗脱所得尹I的洗脱液 进行纸联析定性分析，结果见表 4。由表 4可 {=Il，Ⅲ黼壤糖凝胶 LH一20柱分离儿茶索，各组 分冼脱的顺序依次为：非酚类物质，非酯型儿茶 紊，酯型儿茶素．从表 4还可看出 c峰及前面 的拖尾部分井非单一组分，但都属于酯型成分， 因此．为缩短分离所需时间 ，减少儿茶素在分离 过程中因氧化而 l起的损失，当与 A、B两峰对 应的部分用 40 丙酮水溶液洗脱完毕后，改用 80 丙酮水溶液快速洗脱，合并洗脱液，称为 c 组分，而与 A、B两峰相对应的洗脱液分别为 A 组分和 B组分 。 圈 4 葡聚糖凝胶 LH一20柱分离儿茶紊 住尺寸 ：1．6(I D )×8‘km． 流脱 灌 t 40 雨 酮水 溶 淮． 上 性烊品 量 t 5．00g． 表 4 纸上层析分析柱层析分离的组分 斑点显色酌强弱及相对逝置 管 号 EGC GC EC+C EGCG EcG l3 l5 20 36 45 - + 莱多酚粗 品 注 ：+ +十——显 邑揠强 ++——显色较强 I +——显色鞍弱． 按以上柱层析条件分离儿茶素重复实验三 次，每次上拄用量 5．oog，A B、C三组分的得率 分别 为 9．04 ，10．25 、52．44 。 由A、B、C三组分的 HPLC分析图谱(囤 5 ～ 7)可知，B组分为混合物，A组分为单一成 维普资讯 http://www.cqvip.com 精 细 化 工 1994年第 l1告 分 ．其质量分数为 95．37 ，而 C组分为两种物 质的混合物，其中一部分为 A组分。由以上的 ‘}析结果可知．茶多酚粗品经过柱层折分离，酯 塑成分存在于 A、c两组分中，A组分的纯度较 高，C组分中舍有大量的 A组分 图s A组分的高教藏相色谱图 图 6 B组分的高效械相色谱 图 图 7 C组分的高艘液相色谱图 图 8 高教液相翩备图谱 3，高纯度 EGCG的制备 用 HPLC进一步分离纯化柱层析分离得 到的 c组分，结果见圈 8。圈 8与文献报道的 HPLC制备图谱。 一致．据文献报道。 。峰 I为 EGCG，峰 I为 ECG。 4．结构鉴定 将制备型 HPLC分离得到的峰 I收集物 进行结构鉴定。 (1)HPLC分析 由图 9可知，经分离、纯 化的收集物可达到色谱纯级，其保留时问 7．~4min，与文献报道 EGCG的保 留时间相符 合 。 (2)元素分析 由表 5可知，待测样品的 C、H、O分析值与 EGCG C、H、O组成的理论 值完全相符。 表 5 元素分析结果 C H LJ 宴测值( ) 58．站 3．1B8 蚰．48 理论值 ) 57．64 ．93() 38．43 (3)紫外分析 样品水溶液的紫外光谱分 析见图 l0，其最大吸．收波长为 273．4nm，与文 维普资讯 http://www.cqvip.com 前 4期 精 细 化 工 献报道。 ”EGCG的紫外吸收峰 273．0nm相符。 (4)红外光谱分析 红外光谱分析结果(见 旧 11)表明，该物质在 1690cm 处有一较强的 一 伸缩振动吸收峰，在 ll9O～1240cm-’处有 一 组较强 的 一 非对称 伸缩 振动 吸 收 峰 ，在 I^5o～l600cm 处有苯环骨架特征振动吸收 峰，其 1R光谱图与 EGCG图谱 ”一致。 (5)拉磁共振 分析 (’HNMR) 文献报 道 +EGCG的桉磁共振图谱 为 6№ccos．~coppm3． 00(1H )．5．11(1H )。5．53(1H)，6．05．(2H )，6． 65(2H)，7．09(2H)。由图 l2可知测定结果与文 献报道相符。但在 ~ppm2．06处还出现一个较 强的质子峰，呆溶剂 中杂质即氘代 丙酮试剂中 戏留质子所产生的化学位移所致 。 根据 以上 的 鉴 定结 果 可 知，该 物 质 为 EGCG 结构式如下： 圈 9 高教藏相色谱图 综 台分析以上的宴验结果可知，柱层析分 离得到的 A、B、c三组分中，A组分为 EGCG， C组分为 EGCG和 ECG两者的混合物。 用柱层析分离得到的 EGCG进行动物抗 癌初步试验，证明 EGCG抑制艾氏腹水肿瘤的 效果优于茶多酚粗品。 图 lO 紫外光谱图(溶剂 ·水) ⋯ 图 l】 红纠、光谱图(KBr压片’ 圈 l2 棱磁共振分析图谱 参 考 文 献 [I]中华^民井和国进出口商品幢验总局绾 成品蓑幢驻 ．235 ～ z52，中国财敢经济出版桂{I981) (z)安徽农学 院主蝙 ．茶 叶生物化学 ．49～53．农 业出版 杜 (19B8) 维普资讯 http://www.cqvip.com · 【6 · ， f摹，孝 ， ， 、f ， I膏 细 化 工 l994年 第 1l卷 J[磨]R．M．西尔弗断坦等著 ．有帆化合物的光谱鉴定 ．179 ～ 1 80．科学 出版 杜(1982) ({]越慰望等．油唐 然抗氧化州的研究．华中表业大学学报 ． 6(j)．3ja～ 324(1987) Cf,]眦 lj 等 ．茶 业试验 研究报 告 (日)．3．65～74(1989) (- ]珠 宗憋 ．国 外篆叶研 究现状 ．茶 叶文摘 ．5、6．1～7(1988) 嶷也 t九 等 ． ip Kogeikagakn aishi．63“)．845～ {7 c 19 9) ]S lIu Ryoyasu．Agrie．Blot．Chem ，蛐 【7】．1967~ 70(1982) 们L Min]-Isiu~a．中国农 业 化学 会志 ．22ti～2)．i28(198t) 『11]T．O~1w；i．A．gric．1ti ．Chum ，46(7)．1079(1982) jt]日本 公开特 许公报 6I)一13 780 (1鲫3年 8月 l1日收 犒) [作者简介)戚向阳．女，24岁．1992年毕业于华 【r牝业大学食品科技暴食品化学专业 。顸士学 位。现分 列华l1】农业大学食科系任教师． ISoLATIoN AND PREPARATIoN OF HIGH PuR}TY EPIGALLOCATECHIN GALLATE(EGCG) Qi Xiangyang，Xie Bijun，Hu Weiwang (1tuazhong A~ric“ IIIT~~University．W nhaa．^ f． ‘fJ【le 430070l ABSTRACT In this paper．we reported a method for isolation and purification of catechins from tea polyphenol in green tea． The polyphenol waa obtained from green tea by soaking it with 8o ethyl alcohol·then using No．2 solvent for decolorization and de— caHeinatlon and extracting eateehins in the aqueous layer with EtAc．The content of cate— chins was 75．43 ，the product percent was l2．53 ． Catechins was sepa rated by automatic column chromatography using a column packed with Sephadex LH ——20．then further separated and purified by preparative HPLC． Responding to the first peak of preparative HPLC， it was chromatographically pure EGCG identified hy UV ，IR HPLC．‘HNM R and element analysis． 2一(a一甲基一2，4，5一三甲氧基苄基) 苯甲酸的合成研究 鱼望茎 安艟大学化学幕，台耙．邮缩 230039) 门 2 j (乙 f 研究了2-‘ 甲基一2·4·5一三甲氧基苄基)苯甲酸的合成．对合成的两种新化合物的结构．做了元索分 圭}}、红外光谱和核戳共振谱鉴定． 2一(a ffj基一2．4．5一三甲氧基苄基)荤甲酸可 撇为进一步合成新的多环化合物的中问体。所 ． 合成该化合物 ．对于研究新的多环化合物的 舟成、结构、性质和应用都有重要的意义。许多 广 抗菌素 常具有多环结构。作者合成 目标 物．是采用苯醌为原料与醋酸酐反应，合成 1， 2·4一苯三酚三 乙酸酯 l l与硫酸二甲酯反应 ． 生成 l·2，4一三甲氧基 2。2与邻苯二 甲酸酐起 傅氏反应．制得 2-(2．麟5一三 甲氧基苯 甲酰)苯 甲酸 3．3与格氏试剂甲基溴化镁反应．合成 2． (2-4-5 三甲氧基苯亚 乙基 )苯内酯 4。后者在 氢氧化钾溶液中与锌粉反应，即制得 目标物 5。 其反应方程式如下 ； 维普资讯 http://www.cqvip.com