巨噬细胞株分泌的RCAS1对正常小鼠骨髓单个核细胞凋亡的影响
巨噬细胞株分泌的RCAS1对正常小鼠骨髓
单个核细胞凋亡的影响
?
26?
文章编号:1007—6611(2008)01—0026—03
山西医科大学学报(JShanxiMedUniv)2008年1月,39(1
巨噬细胞株分泌的RCAS1对正常小鼠骨髓单个核细胞凋亡的影响
聂芳娜,张伟华,张秀莲,范星火,陈玮,侯素敏,刘晨(山西医科大学第一临床医学院血液
科,太原030001;通讯作者,E—mail:zwhuaa@yahoo.com)
摘要:目的研究巨噬细胞株分泌的RCAS1对正常小鼠骨髓单个核细胞(BI~MNC)凋亡的影响.方法RT-PCR方法
检测巨噬细胞株RCAS1基因表达,10例正常小鼠骨髓基质细胞RCAS1基因表达作为正常对照组.流式细胞术检测8例经
巨噬细胞株培养上清作用后正常小鼠BMMNC的凋亡,8例经正常小鼠骨髓基质细胞培养上清作用后正常小鼠BMMNC的
凋亡作为正常对照组.对8例巨噬细胞株RCAS1的表达强度与8例经巨噬细胞株培养上清作用后正常小鼠BMMNC的凋
亡率进行相关
.结果?巨噬细胞株RCAS1mRNA的表达强度为(1.98?0.24),明显高于正常对照组(0.84?0.21)
(P<0.01).?巨噬细胞株培养上清作用后正常小鼠BMMNC的凋
亡率为(16.66?1.97)%,明显高于正常对照组(2.10?
0.25)%(P<0.01).?巨噬细胞株RCAS1mRNA的表达强度与巨噬
细胞株培养上清作用后正常小鼠BMMNC的凋亡率呈
正相关(r=0.95,P<0.01).结论巨噬细胞株高表达RCAS1,RCAS1对
正常小鼠BMMNC有促凋亡作用.
关键词:凋亡;基因表达;巨噬细胞株,RCAS1
中图分类号:Q255文献标识码:A
EffectofRCAS1sec~tedbymacrophagecelllinesontheapoptosisofnormalbonemarrowmononuclearcells
NIEFang-na,ZHANGWei—hua,ZHG?u—lian,FANXing—huo,C旺
NWei,H[)lSu—min,LIUChen(DeptofHematology,
FirstClinicalMedicalCollege,Sha~rriMedicalUniversity,TaiyuanDjo0Oj,China;Correspondingauthor,E-mail:z~huaa
@y~hoo.corn)
Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectofRCAS1secretedbyrnacrophagecelllinesontheapoptosisofbonemari~w
mononuclearcells(BMMNC)innormalmice.MethodsExpressionofRCAS1mRNAinmacmphagecelllineswasmeasuredby
reversetranscriptasepolymerasechainreaction(RTPCR),and10casesofbonemalTowstromalcellsinnormalmicewerenormal
controls.TheapoptosisofnormalBMMNCstimulatedbysupematantofmacr
ophagecelllineswasmeasuredbyflowc~ometw,and
8easesofnormalBMMNCstimulatedbysupernatantofbonein&rI~wstromalcellsinnormalmicewerenormalcontrols.Thecorrda—
tionofexpressionintensityofRCAS1mRNAinmacrophagecelllinesandapoptosisofnormalBMMNCstimulatedbysupernatantof
macrophagecelllineswasanalyzed.Results?
ExpressionintensityofRCAS1mRNAsecretedbymacrophagecelllines(1.98?
0.24)washigherthanthatofnormalcontrols(0.84?0.21)(P<0.01).?
TheapoptosisofnormalBMMNCstimulatedbysuper—
natantofmacrophagecelllines(16.66?1.97)%wasalhigherthanthatofnormalcontrols(2.10?0.25)%(P<0.01).?Ex—
pressionintensityofRCAS1mRNAsecretedbymacrophagecelllin~swaspositivelycorrelatedwiththeapoptosisofnorm~BMMNC
stimulatedbysupematantofmacrophagecelllines(r=0.95,P<0.01).ConclusionTheresultsindicatethatRCAS1playsa
pro-apoptoticroleonBMMNCofnormalmice.
Keywords:apoptosis;geneexpression;macrophagecelllines,RCAS1
[].ExpMed,2006,209(3):277—283.
[2]AmandaC,SeemD.Advancesinthebiology.diagnosisandhost—
pathogeninteractionsofparvovirusB19[J].MedMicrobiol,2004,
53:459—475.
[3]姜泊,张亚历,周殿元,等.分子生物学常用实验方法M].1
版.北京:人民军医出版社,2000:66—68
[4]祝丙华,许金波人细小病毒B19检测方法研究进展[J].国际
基金项目:山西省高校科技研究开发基金资助项目(20041006)
病毒学杂志,2006,13(1):16—19
L5JTakanoT,YamadaK.QuantificationofhumanparvovirusB19
DNAbyreal—timepolymerasechainreaction[J].Pediatrlnt,
2007,49(2):459—462
作者简介:武丽娜,女,1980—09生,在读硕士.
[收稿日期:2007—10—15]
山西医科大学学报(JShanxiMedUniv)2008年1月,39(1
Sonada等[1]在1995年建立了一种新的人类子
宫颈鳞癌细胞系SiSO,随后Sonada等_2j的研究又
发现了一类表达于SiSO细胞上的新的肿瘤相关抗
原(receptor—bindingcancerantigenexpressed012
SiSOcells,RCAS1).许多学者发现RCAS1在肿瘤
逃避免疫监视[3j中起重要作用.近年来,国外有
学者发现骨髓巨噬细胞表达R01,且R01对
红系形成集落有促凋亡作用.本实验测定了小鼠
骨髓巨噬细胞株RCAS1基因表达及其对正常小鼠
骨髓单个核细胞凋亡的影响,进一步探讨RCAS1
在骨髓造血中的作用.
1
和方法
1.1小鼠及小鼠骨髓巨噬细胞株来源近交系
BALB/c小鼠(H一2d,MLSb)40只,8周龄,雌雄不
限,购于山西医科大学寄生虫学教研室.小鼠骨髓
巨噬细胞株Aria一1购于中科院上海细胞研究所.
1.2主要试剂及仪器SK一1250,M—MuLV逆转录
酶均购自立陶宛Fermentas公司.G—actin由上海生
物工程技术服务有限公司合成.AnnexinV—FITC
凋亡检测试剂盒购于Sigma公司,批号:42191.小
鼠淋巴细胞分离液购于天津灏洋生物有限公司.
流式细胞仪(美国B—D公司,Calibur型).
1.3小鼠骨髓巨噬细胞株培养,传代及正常小鼠
骨髓基质细胞培养巨噬细胞株以l×10个细胞/
每瓶(4m1)置于37?,5%co2饱和湿度下培养.
约1d巨噬细胞全部贴壁生长汇合成单层后,用
0.25%胰蛋白酶消化细胞进行传代,共l0瓶.收
集上清备用,贴壁细胞待测.
取10只正常小鼠骨髓细胞,采用全骨髓培养
法以1×10.个/ml置于37?,5%co2饱和湿度下
培养.培养至14d时细胞贴壁(贴壁细胞即骨髓基
质细胞)并汇合成单层,计数贴壁细胞为l×10个/
每瓶(4m1),共l0瓶.收集上清备用,贴壁细胞待
测.重复三次.
1.4RT-PCR方法检测RCAS1表达用SK.1250
试剂提取l×10个骨髓基质细胞及巨噬细胞总
RNA,应用紫外分光光度计测定其浓度和纯度.
R01上游引物为5,(T(;A1vrA1vrCGTC一
,I,GTCCCTA一3,下游引物为5一ACA1vrCC—
CATTCCCTCCT一3,G—actin上游引物5一CTA—
CAATGA0r,TGCGTG,r(GC一3,下游引物为5一
CAGG_1?CAGACGCA(A1;GC一3.PCR体系
50l,含10×PCRBuffer5tA,25mmol/LMgCl24
?
27?
l,10mmol/LdNTP1tA,cDNA
10l,
primerl(25t~mol/L)0.5tA,primer2(25t~mol/L)
0.5tA,Taq酶2l,ddH2027tA.PCR反应条件
为:94?30S,54?30S,72?30S,共35个循环.
取10l扩增产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳,电压
10V/cm,应用紫外照相机记录结果.R01的扩
增长度为104bp,G—actin的扩增长度为270bp.
1.5流式细胞术检测BMMNC的凋亡取20只
正常小鼠骨髓细胞,用淋巴细胞分离液分离出
BMMNC后,加入24孔培养板(每孔含细胞约1×
10个),1rnl/孑L,每孔设3个复孔.分两组:一组加
入巨噬细胞株培养上清(体积比为2:5)作为实验
组,另一组加入正常小鼠骨髓基质细胞培养上清
(体积比为2:5)作为正常对照组,然后置于37?,
5%co2饱和湿度下培养3d.重复三次.将1×
10个BMMNC加入碘化丙锭(PI)及AnnexinV—
FITC各5l,室温(20oC)避光孵育15min,再加入
400tA缓冲液1h内应用流式细胞仪检测.采用对
数方式获取荧光信号,通过Cellquest软件获取细胞
并分析.
1.6统计学分析所有资料处理用SPSSl1.5版软
件包进行分析,检测结果以?S表示,经方差齐性
检验后,采用t检验比较两组问差异.相关分析采用
双变量pearson相关分析.P<0.05有统计学差异.
2结果
2.1巨噬细胞株R01mRNA的表达水平用
RT—PCR方法检测巨噬细胞株RlmRNA的表
达水平,l0例正常小鼠骨髓基质细胞作为正常对
照.结果显示:巨噬细胞株均有RCAs1rnRNA的
表达,表达强度为(1.98?0.24);10例正常小鼠骨
髓基质细胞均有RCAS1mRNA的表达,表达强度
为(0.84?0.21),巨噬细胞株组明显高于正常对照
组(P<0.O1).见图1.
2.2巨噬细胞株培养上清作用后正常小鼠BMM—
NC的凋亡用流式细胞术检测巨噬细胞株培养上
清及正常小鼠骨髓基质细胞培养上清作用后正常
小鼠BMMNC的凋亡.结果显示:8例巨噬细胞株
培养上清作用后正常小鼠BMMNC的凋亡率为
(16.66?1.97)%明显高于8例正常小鼠骨髓基质
细胞培养上清作用后正常小鼠BMMNC的凋亡率
[(2.10?0.25)%,P<0.O1].
2.3R1mRNA表达强度与细胞凋亡率的相
关性巨噬细胞株RCAS1mRNA的表达强度与巨
?
28?
BP
1o0
3o0一RCAS1(104bp)3-actin(270bp)山西医科大学学报(JShanxiMedUniv)2008年1月,39(1
图1巨噬细胞株组及正常小鼠骨髓基质细胞组RCAS1
mRNA产物电泳结果
Fig1ElectrophoresisresultsofRCAS1mRNAproductsin
2groups
噬细胞株培养上清作用后正常小鼠BMMNC的凋
亡率呈正相关(r=0.95,P<0.01).
3讨论
巨噬细胞由于其活跃的生物学功能,尤其是其
在免疫应答和机体防御中的重要作用,而一直受到
重视,是体内功能最为活跃的细胞之一.巨噬细胞
除具有吞噬,抗原提呈作用外,还有分泌功能.巨
噬细胞可分泌多种活性物质如IL,1,IL-12,TNF—a,
溶酶体酶及补体成分.近年来,Mutsushima等l_6j学
者用免疫组化染色的方法发现RCAS1主要位于骨
髓中巨噬细胞的胞质中.当培养物中RCAS1的含
量增加时,红系形成集落将经受凋亡,包括线粒体
跨膜电位的消失及caspases8和caspases3的激活,
且RCAS1引起的促凋亡效应独立于Fas途径.
Suehiro等l_7j学者研究发现,巨噬细胞经脂多糖刺激
后,RCAS1表达明显增加,RCAS1可引起表达
RCASl受体的红系祖细胞凋亡.
不论是存在于肿瘤细胞还是表达在正常组织
细胞上,RCAS1均能够使表达RCAS1受体的免疫
细胞或其他细胞凋亡,而引起病理或生理的改变.
过去多年对于RCAS1的研究主要集中在肿瘤及妊
娠l_80l等方面,对其在血液学方面的研究较少.
为了研究巨噬细胞株分泌的RCAS1对正常小
鼠骨髓单个核细胞凋亡的影响,以探讨巨噬细胞对
正常骨髓造血的作用,我们检测了巨噬细胞株
RCAS1的含量,结果显示巨噬细胞株RCAS1的含
量明显增加,并发现巨噬细胞株培养上清作用后正
常小鼠骨髓单个核细胞的凋亡率明显增加,且巨噬
细胞株RCAS1mRNA的表达强度与巨噬细胞株培
养上清作用后正常小鼠骨髓单个核细胞的凋亡率
二者呈正相关.以上结果表明巨噬细胞株分泌的
RCAS1对正常小鼠骨髓单个核细胞有促凋亡作用,
且正常小鼠骨髓单个核细胞的凋亡与巨噬细胞分
泌的RCAS1有明显的剂量依赖关系.提示巨噬细
胞及其分泌的RCAS1对骨髓造血有抑制作用.
参考文献:
[1]SonadaK,NakashimaM,SaitoT,a1.Establishmentofanew
humanutteringcervicaladenocarcinomacellline,SiS0,andits
reactivitytoanticancerreagents[JJ.IntJOncol,1995,6:1099—
1104.
[2]SonodaK,NakashimaM,KakuT,eta1.Anoveltumor—associa-
tedantigenexpre_ssedinhumanuterineandovariancarcinomas
J』Cancer,1996,77:1501—1509.
[3]OkadaK,NakashimaM,KomutaK,eta1.Expressionoftumor-
associatedmenlbraneantigen.RCAS1.inhumancolorectalcarci—
nomasandpossibleroleinapoptosisoftumor--infiltratinglym--
phocytes[J].ModPathol,2003,16(7):679—685
[4jTsujitaniS,SaitoH,HonbohT,eta1.Prognosticsignificanceof
receptor-bindingcancerantigenexpressedonSiSocells
(RCAS1)expressioninrelationtocadherinexpressioninpa—
tientswithcolorectalcarcinoma[J].DisColonRectum,2007,50
(8):1241—1249.
[5jToyoshinmT,NakamuraS,KumamaruW,etalExpressionof
tumor-associatedantigenRCAS1anditspo~ibleinvolvementin
immuneevasioninoralsquamouscellcarcinoma[J_.JOral
PatholMed,2006,35(6):361—368.
[6jMatsushimaT,Nakashin1aM,OshimaK,eta1.Receptorbind—
ingcancerantigenexpressedonSiSocells,anovelregulatorof
apoptosisoferythroidprogenitorcells[J]Blood,2001,98(2):
313—321.
[7]SuehiroY,MutaK,NakashimaM,eta1.Anovelmechanismin
suppressionoferythropoiesisduringinflammation:acrucialrole
ofRCAS1[J]EurJHaematol,2005,74(5):365—373.
[8]TsujitaniS,SaitoH,OkaS,etalPrognosticsignificanceofRC-
AS1expressioninrelationtotheinfiltrationofdendriticcellsand
15qnphocytesinpatientswithemphagealcarcinoma[J].DigDis
Sci,2007,52(2):549—554
[9]NakabayashiH,NakashimaM,HaraM,eta1.Clinico-pathologi—
calsignificanceofRCAS1expressioninglion~s:apotential
mechanismoftumorimmuneescape[J].CancerLett,2007,246
f1—2):182—189.
[10]AceK,HirakiA,YamazakiK,eta1.ElevatedplenralfluidRC-
AS1isadiagnosticmarkerandoutcomepredictorinlungcancer
72. patients[J].ImJOncol,2006,29(1):65—
作者简介:聂芳娜,女,1982—02生,硕士.
[收稿日期:2007—10—22]