MTT法分析肺泡MФ上清促纤维母细胞生长活性

MTT法分析肺泡MФ上清促纤维母细胞生长活性 MTT法分析肺泡MФ上清促纤维母细胞生 长活性 《免疫学杂志》1993年第9卷第2期127 ?,l,c TT法分析肺泡Mj2『上清促纤维母细胞生长活性 一 陈非邓鸿邓玉兰黄太无丁桂风龙振州 石疫学教研室北京100083)R,一3 摘要本文对MTT比色法用于检测肺泡巨噬蛔胞上清对纤维母细胞的促生长活性的条件进 行 了探讨结果明对于实验所选用的三种纤维母细胞.即NIH3T3细胞,』,胚肺纤维母细胞,大 鼠肺纤 维母细胞,在细胞浓度为1×10,一5X10’/m1之间,和经低血清浓度(0.4Fcs)培养4—5天 后,MTT 比色法能较为敏感地反映出矽肺太鼠肺泡巨噬细胞上清对三种纤维母细胞的促生长效应. 关键词MTT鱼盘璧!.韭壁堡望 病理状态下肺间质的广泛纤维化可能与 肺局部单核巨噬细胞的功能异常密切相关. 然而关于单核巨噬细胞对肺问质纤维母细胞 (F{broblast,FB)的增殖行为究竟起促进还 是抑制作用,文献报道的结果常有矛盾.在矽 肺状态时,肺泡巨噬细胞(Alveolar Maerophage,AM)的功能出现异常,其台成 并释放的生长因子样物质增加已被公认…, 但这种异常活性的细胞水平的检测,尤其是 其对FB促生长活性的检测,在方法学上尚 不够理想.本文报道的实验通过MTT(噻唑 蓝)比色法,对检测矽肺大鼠肺泡巨噬细胞上 清促F]3生长活性的条件作了初步探讨,现 报道如下. 材料和方法 一 ,动物和试剂雄性Wistar大鼠,由 本校实验动物中心提供;DMEM,RPMn64O 培养基,胎牛血清(FCS)均购自Gibeo公司; MTT[3(4.5-dimethythiazol一2一y1)2.5 dlphenyltetrazoliumbromide]购自Sigma. =,矽肺动物模型的建立,肺泡巨噬细胞 灌洗与培养见文献0_3_. 三,纤维母细胞培养NIH3T3细胞引 ,卫生都科研基金资助课题 自美国ATcc,维持于含5FCS的DMEM 培养液中,按常规方法进行传代培养.人胚胎 肺和大鼠肺FB均采用组织块培养技术”. 蔺言之,无菌取出肺脏.予无血清RPMI1640 洗净血污,去除气管及支气管树,在平皿中剪 切成麋状,尔后将其均匀涂布于25cm组织 培养瓶底,(Falcon,BcctonDiekison&Co. USA)在37_c5cO2孵箱中倒置2h后向 每瓶内加入完全RPMI1640培养基1一l_5 mI,使其刚够覆盖住组织块表面,24h后换入 新鲜培养基4—5ml,以后每周换液2—3次. 一 周以后FB长成交汇层,原组织块自动由 瓶壁游离出,在数次换液过程中去除.将交汇 层的FB予0.25胰蛋酶消化后进行传代培 养. 四,纤维母细胞增殖分析将预定细胞 浓度的NIH3T3细胞,第三至第五代的人胚 肺和大鼠肺FB在96孔平底组织培养板 (Falcon)中培养预定时间后,加或不加经序 列稀释的AM培养上清,每孔液体总量 200~I;血清浓度调至含FCS2,培养20h 后加入MTT至每孔终浓度0.5mg/ml,(用 前于PBS中配成5mg/ml贮备液);继续培 养4h后轻吸出培养板中液体,每孔加入 128《免疫学杂志’1993年第g卷第2期 100/~l酸化异而醇(含0.04NHCI),震荡10 — 20t,溶解被还原的MTT结晶l在酶标仪 上检测波长为570nm的光密度值 (OD570nm),用不含细胞,只含培养液和 MTT的孔进行光密度凋零在一些实验中, 将细胞对照孔的光密度值参考为零在另一 组平行实验中,采用H—TdR掺入法进行对 照 结果 一 ,MTT比色法中最佳FB最度的选择 MTT被活细胞内脱氢酶还原成躜的能力 与细胞数量星正相关,但在一定体积内随着 细胞密度的增加,细胞增殖的接触抑制以及 对有限营养成份的竞争,造成上述关系的非 线性化图1结果表明,对于NIH3T3细胞 而言,细胞浓度在1×10一5×10./ml(即每dR法 所反映的主要是与s期细胞数有关. 二,FB最佳受试状态分析由于FB在 通常的培养状态下群体中的细胞分别处于不 同的细胞周期时相,因而对外来刺激的反应 能力表现不一.为了使细胞获得同步化生长, 我们对三种FB分别进行了低血清浓度(O. 4FCS)耐受试验,以期选择最佳受试状态, 即能使所有细胞最大限度地进入GO期,保 持最低自发增殖状态,而又具备对新加入的 促生长物质有较好的回复增殖能力.结果如 图2所示.对于NIH3T3细胞,在每孔细胞 C—xIO’ :? 1II??lTl五J 培养峙一 图2NIH3T3细胞最佳受试状态分析 正方形为MTT比色法的OD570nm值I圆形为’H. TaR掺入法的CPM值f空白代表血清辛盘度为0.4% Fcs}全黑代表培养的最后24小时血清浓度改为 10FCS(n=6) 数为1×1O’,血清浓度为0.4FCS时培养5 天(中间不换液)后,大部分细胞均进入静止 状态但如在此时换成1OFCS继续培养 24小时,其仍有较好的回复增殖能力如果 超越这一时间,相当部分的细胞进入濒死状 态,表现为OD570nm值和H-TdR接入的 CPM值的急速下跌.因此,对于NIH3T3细 胞,其对促增殖活性测定的最佳受试条件为 0.4FCS培养5天,略长于以前所作的 0.1BSA无血清耐受试验”.与此类似,实 验提示人胚肺和大鼠肺FB的最佳受试条件 为0.1FCS培养3—4天. 三,肺泡M上清对FB的促生长效应 分析图3结果分别比较了正常与矽肺大 ‘免疫学杂志,199:$年第9卷第2期l29 鼠AM在体外无血清培养24小时后其对3 种FB的促生长活性.由图3可知,正常大鼠 AM上清对3种FB均无明显的促生长活 性,而矽肺大鼠AM上清则有明显的促进3 种FB的增殖的能力.这一结果与采用传统 的’H-TdR掺入法所得结果相近(见图4),稍 有不同的是当矽肺上清浓度较高时(>1? 4).’H.TdR掺入的CPM值较低(图中未显 示),其原因目前还难于说明. oD.To叫 0.’8 o” 040 0.3e 0.08 ? 2?B?32?128 上清稀释度 图3矽肺’空白)和正常(全黑)大鼠AM上清对 3种FB的促生长效应分析(MTT比色法.细胞 对照的OD值参考为O).?,NIH3T3细胞I口大 鼠肺FB101人旺肺FB(n一6) 册Ix10. 8 ? I 2 人胚尊走鼠肆K】H?0 ,B,B 田4’H?TdR掺入法检测AM上清对3种FB 的促生长活性,上清稀释度为1;16.?,FB对照I , 正常鼠AM上清I口矽肺鼠AM上清.’’,P <0.001 讨论 MTT比色法用于测定淋巴细胞增殖活 性和TNF(肿瘤坏死因子)的杀伤活性已早 有报遭【,但用于测定AM上清对FB的促 生长活性则尚属首次,其在方法学上与其在 其它实验中的主要差别在于实验条件的重新 选择与评估. 测定细胞增殖水平的常用方法是同位素 标记技术,其中以H?TdR掺入法最为常用, 其主要缺点是同位素污染,费时,步骤繁复. 而MTT法的最大优点正是弥补了H—TdR 法的不足.MTT被还原成躜的数量直接与 指示细胞中活细胞数量有关,因此,只要选择 出适宜的实验条件如指示细胞密度,生长状 态等,就能较好地反映出某种物质对细胞增 殖能力的影响程度.我们的结果表明当指示 细胞处于旺盛生长状态或密度超出1×10./ ml一5×10’/ml这一区间时,矽肺大鼠AM 上清对FB的促生长活性难以被检出,且常 会有互相矛盾的结果(实验观察资料).矽肺 状态时AM能促进FB的增殖,但这种促增 殖活性可能是一种IL一1以外的物质所为,我 们最近对大鼠AM的无血清6小时培养上 清的HPLC分析表明;矽肺时AM能产生一 种分子量在5.5—8.0KDa范围的促FB生 长物质,而正常大鼠AM上清中则缺少这种 物质(另文发表),其进一步的生物学特性正 在探讨.MTT比色法尽管具有弥补H?TclR 法的缺点,能检测AM上清对FB的促增殖 活性.但在实际应用过程中尚有一些难以克 服的不足之处,主要是敏感性不如H.TdR 法,不能反映出细胞数量的微小变化.其有在 细胞数量产生0.5倍以上的变化时才会有较 显着的差异;其次,该法还不能象;H.TdR法 能反映出细胞周期的变化.因此不能用于检 测在细胞数量发生变化以前的细胞周期时相 的变化}最后,由于MTT法依赖于MTT被 细胞内脱氢酶的还原作用,因此对于一些细 胞如淋巴细胞,胸腺细胞等,其胞浆内酶含量 130《免疫学杂志》1993年第9卷第2期 相对较少,应用就受到更大的限止. (本教研室刘白博士转赠四月胎龄人胚胎肺脏 特此致谢). 参考文献 1.LuganoEM.efat.AmRevRespirDis1984F129t767 2.Gr~tterHL,eta1.JPathologyl986}1”E263 s.雠非.尊.中华微生蛔学与免痉学杂志1992Fl2981 4.阵非等.中国免疫学杂志1991F7=355 5.阵非等.免班学杂志1999F297 6G…LM,et.J1mmu”01/vle~h6a1984}70=257 (1992年8月2Z日收靖1992年12月22日回) MTTColormeticAssayinDetectionofPromotingGrowthEffectof SilicosisRatAlveolarMacrophageSupernatantsonFibroblasts ChertFei,DengHongyie,DengYulan,1-fuangDawu,DingGuifeng,LongZhenzhou (DepartmentofImmunology,BengMedicalUniversity,Beijing100083) AbstractThepresentstudyinvestigatedthemethodofMTTcolorraeticassayinthedetectiollofpro. rootinggrowthe{{ectofsilicosisratsalveolarmacrophages’supernata~tsonfibroblasts.Threetypesof 矗. broblastwereusedinthisexperiment.TheresultsindicatedthattheoptimalgrowingstatesofNIH3T3cells. ratlungandhumanembryolungfibroblastsforthismethodisthatthesecellawererespectivelyculturedin 0.4FCSf0rfourtotqvedaysandtheoptimalce]lconcentrationiS1×10’一5×10’/mI.Uriderabovecondi. t[ons,thepromotinggrowtheffectofsilicosisratalveolarmacrophagesupernatantsonfihroblastscande. tectedsertsitively. KeysMTTcolormeticassay~Alveohrmacrophage,Fibroblast