人类基因有效DNA浓度定量检测操作步骤

1 人类基因有效 DNADNADNADNA浓度检测操作流程 1.目的 介绍使用实时 PCR技术对基因有效 DNA浓度进行定量、质控。辅助 EGFR/KRAS/BRAF基因突变检测试剂盒的使用。 2.实验材料 试剂 供应商 人类基因有效 DNA浓度定量检测试剂盒(荧光 PCR法) 厦门艾德生物医药科技 有限公司 实时荧光 PCR仪 – PCR96孔板或八联 PCR反应管 – 3.方法 注意：每次实验均使用新鲜配制的基因组 DNA标准品。 3.1制备 2.5 ng/μL标准DNA：吸取 2 μL基因组 DNA（40 ng/μL）至 30 μL超纯水中，振荡混匀。 3.2用 20 μL标准 DNA和 20 μL超纯水中制备 2倍梯度稀释的标准品， 每次加样后都应混匀。 浓度（ng/µL） 每反应加入总 DNA量（ng） 2.5 12.5 1.25 6.25 0.625 3.125 0.312 1.5625 3.3按照表 1制备预混液。所有样品(DNA样品、标准品、阴性对照)应 当做两复孔或三复孔以提高标准曲线和定量结果的准确性。 3.4分装 45 µL预混液至八联 PCR反应管中。 3.5加入 5 µLDNA样品、标准品、水(NTC，/阴性对照)至八联 PCR反 应管内。 表 1 预混液配制 各组份名称 体积/反应 (µL) 反应混合液 45 Taq酶 0.25 DNA 5 3.6上 qPCR仪(MX3000P/MX3005P或其它品牌) 打开MXPro软件，选择 Quantitative PCR(Multiple Standards) 输入样品编号 4.数据分析 4.1 在 Setup界面将标准品设置成“Standard”。 4.2 输入相应的浓度值。如下图： 4.3 选择“Analysis”，“Standard Curve”。 标准曲线的相关系数 R2应大 于 0.95。 4.4 选择“Text report”。 1111 2222 3333 A Sample1 Sample9 0.312 B Sample2 Sample10 0.625 C Sample3 Sample11 0.625 D Sample4 Sample12 1.25 E Sample5 Sample13 1.25 F Sample6 Sample14 2.5 G Sample7 Sample15 2.5 H Sample8 0.312 NTC 2 4.4导出定量结果。 4.5阴性对照收集到荧光信号，说明实验中发生了交叉污染，数据无效， 需重复实验。 4.6根据样品的 DNA含量，DNA稀释 0.4ng/µl。按照 ADx-EGFR试剂 盒操作步骤进行 EGFR基因突变检测。 人类基因有效DNA浓度检测操作流程 1.目的 2.实验材料 3.方法 注意：每次实验均使用新鲜配制的基因组DNA标准品。 4.数据分析