Leber遗传性视神经病变线粒体DNA突变的研究

中国优生与遗传杂志2007年第 15卷第8期 ·23· Leber遗传性视神经病变线粒体 DNA突变的研究 郑梅玲，贺江梅 ，张桂林 。化爱玲 ，张月莲 (山西医科大学第一医院生育研究室，山西太原 030001) 摘 要 ：目的 探讨 Leber遗传性视神经病变患者的线粒体 DNA突变类型及特点。方法 分别应用等位基因特异性 PCR (MSP—PCR)、聚合酶链反应 一限制性片段长度多态性 (PCR—RFLP)和聚合酶链反应 一单链构象多态性 (PCR— SSCP)联合 DNA测序的方法，对 12个家系中21位临床症状疑诊为 LHON的患者及其 19住无明显眼疾的母 系亲属进行线 粒体DNA。结果 40例受检者中35例发生11778位点突变，2位成员有3460位点突变，有 1例发现有4258位点突变 (A—G)。结论 11778是LHON患者常见的突变住点，3460突变少见，新发现的突变位点4258可能是新的继发突变或基 因多态性。 关键词：Leber遗传性视神经病变；线粒体 DNA突变；等住基因特异性 PCR、限制性片段长度多态性；单链构象多态 性；DNA序列分析 中图分类号：R394．23 文献标识码：A 文章编号：1006—9534(2007)08—0023—02 The study of mtDNA mutation in Leber hereditary optic neuropathy．ZHENG Mei—ling，HE Jiang —mei，ZHANG Gui— ling，HUA Ai—ling，ZHANG Yue—lian、 (Department ofMedical Genetics，First Hospital，Shanxi Medical University，Taiyuan， 030001，China) Abstract：Objective：To investigate the mtDNA mutation type and features in Leber hereditary optic neuropathy(LHON)pa- tients．Methods：Blood samples from 12 fam ilies，which include 21 patients and 19 healthy maternal members，were simultaneously analyzed using mutation specific primer polymerase chain reaction(MSP—PCR)，restriction fragment length polymorphisms(PCR— RFLP)technique，polymerase chain reaction combined single s~and conformation polymorphism (PCR—SSCP)and DNA sequen- cing．Results：There were 35 members who habored 1 1778 mutation，and two of 40 subjects happened 3460 mutation、Only one 4258(A—}G)mutation was f0und in all samples． Conclusion：1 1778 mutation is overwhelming majority in LHON patients。3460 mutation is relatively minor．The novel mutation(4258)may be a original secondary mutation point or single nucleotide polymorphism in norm al individuals． Key words：Leber hereditary optic neuropathy；Mitochondrial DNA mutation；Mutation spec~ prime polymerase chain reac- tion；Single s~and conformation polymorphism；Restriction fragment length polymo~hisms；DNA sequencing Leber遗传性视神经病变(Leber hereditary optic neuropa- thy，LHON)是一种以母系遗传为特征的线粒体遗传病。临 床现为双眼急性或亚急性中心视力下降，主要累及青年男 性，是青年人致盲的主要原因之一⋯。近年来研究表明 LHON与线粒体DNA(mtDNA)突变有关。本研究应用等位 基因特异性 PCR及限制性酶切片段长度多态性分析 LHON mtDNA两个原发突变位点，用单链构象多态性(SSCP)筛查 未知突变位点，明确其发病，为临床诊治提供依据。 对象与方法 1。研究对象 来自12个家系的4O位成员，其中患者 21人，无明显眼疾的母系亲属 l9人。患者均来 自山西省眼 科医院门诊，临床疑诊为 LHON患者。 2。方法 (1)基因组DNA提取：每人抽取 2～4ml外周静脉血， 酚一氯仿法提取 DNA，TE溶解，一2O℃保存待用。 (2)PCR扩增：所需试剂 TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA 分子量标准(Maker)均购自上海生工生物工程技术服务有限 公司。引物序列参考文献 ，由北京赛百盛基因技术有限公 司合成。PCR反应总体积为 251~1，内含 10 X buffer(15mM Mgcl2)2。5 l，dNTP (200~mol／L)1 l，上 下游 混合 引物 (101．cM)0。5 l，DNA模板 1 l，加 201~1去离子水至总体积 25／~1。反应条件：94oC预变性 5rain后加入 TaqDNA聚合酶 (5u／l~1)O。3UL，后之94℃变性45s，57oC退火60s，72oC延伸 1min，30个循环后 72℃再延伸 5min。2％琼脂糖凝胶(含0。5 rrIl溴化乙锭)电泳检测 PCR扩增是否成功。检测 mtD- NA突变的引物见表 1。 表 1 检测 mtDNA突变的引物序列及检测方法 检测区域 ； 5物'-序3 产 度检测方法 【bp) (3)等位基因特异性PCR(MSP—PCR)检测11778位点 突变：取PCR扩增产物101~1和6 X上样缓冲液(溴酚蓝+二 甲苯蓝)2 混匀点样，2％琼脂糖凝胶电泳，紫外检测仪上直 接观察结果。 (4)限制性片段长度多态性 (RFLP)检测 3460位点突 变：取PCR扩增产物101~1，限制性内切酶HinI1 0。3 l，10 X 维普资讯 http://www.cqvip.com · 24· 中国优生与遗传杂志 2007年第 15卷第 8期 buffer缓冲液2 ，加2．71M去离子水至总体系15 ，37~C消 化 6h。12％聚丙酰胺凝胶电泳 6h，凝胶用银染显色分析 DNA结果。 (5)单链构象多态性(SSCP)检测未知突变：取 PCR扩 增产物5 l与等体积的2×上样缓冲液(95％甲酰胺，0．05％ 溴酚蓝及二甲苯蓝)混匀，于 95℃变性 5min后置于冰上冷 却，迅速上样，8％非变性聚丙烯酰胺凝胶(含 10％甘油)低 温下(温度控制在 15~C一20~C)220V电泳 8h。凝胶用银染 显色分析结果。 (6)DNA测序：对单链构像多态性分析异常者由上海生 工生物工程技术服务有限公司进行 DNA测序。 结 果 1．MSP—PCR结果 G11778A位点经在琼脂糖凝胶电 泳分析有 5例与正常对照者相同只有一条 496bp的非特异 条带，其余 35例除出现496bp的非特异性条带外还出现了 222bp的特异性条带。 2．RFLP—PCR结果 G3460A位点扩增产物经 HinI1 限制性内切酶酶切后，38例家系成员与3例正常对照者只能 见到306bp和93bp两条带，其余2例除这两条带外还可见一 条399bp电泳条带，表明可能有杂合型存在。 3．PCR—SSCP结果 在受检的 12个家系40位成员的 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳条带中只发现1例与正常对照 者不同。迁移较慢的单链的迁移率稍小于正常人，迁移较快 的单链的迁移率明显小于正常人。 讨 论 11778位点突变是 LHON与 mtDNA突变有关的第一个 证据 ，也是 LHON中最常见的原发突变位点。除 11778位 点外，还有 14484和 3460原发突变位点的报道 ，但不 同 种族突变类型各异。欧洲国家 LHON母系成员携带 11778 位点突变者约50％ ～70％ ，携带 3460位点突变者约 15％ ， 而亚洲国家携带 11778位点突变可高达 90％，携带 3460位 点突变者仅 8％ ～9％ J。本研究中，87．5％的 LHON母系 成员均含有 11778位点突变，仅有 5％的 LHON母系成员含 有 3460位点突变，这也进一步说明了 11778位点突变在我 国LHON发病中的作用。在众多的母系成员中，虽然大部分 有 11778位点突变，却只有部分成员发病，推测可能与突变 量或突变阈值有关 J。 近些年有资料报道显示 LHON的发病除原发突变位点 外 ，还有许多继发位点的作用 J。目前除3个原发突变位点 外继发突变位点有20多个，而且还不断有新的继发位点被 发现。这些继发突变在正常人群也可能存在，但频率远低于 LHON患者。一般来说必须与原发突变同时存在才可致病。 本研究 中，1例母系成员检出4258位点突变并无伴随原发 突变存在所以该母系成员的突变是否为继发突变，还有待更 多的研究证实。 参 考 文 献 [1]Wallace DC，Singh G，Lott MT，et a1．Mitochondrial DNA mutation associated with Leber S hereditary optic neuropathy[J]．Science， 1988，242：1427—1430． [2]王燕，郭向明，贾小云，等．中国人 Leber遗传性视神经病变的原 发突变及临床特征[J]．中华医学遗传学杂志，2005，22(3)． [3]Johns DR，Neufeld MJ，Park RD．An ND一6 mitochondfial DNA mutation associated with Leber hereditary optic neuropathy[J]．Bio— them Biophys Res Commun，1992，187(3)：1551． [4]Fauser S，Leo—Kottler B，Besch D，eta1．Confirmation ofthe14568 mutation in the mitochondrial ND6 gene as causative in Le ber S he— reditary optic neuropathy[J]．Ophthalmic Genet，2002，23(3)：191 — 197． [5]Yen MY，Wang AG，Chang WL，et a1．Leber S hereditary optic neu— mpathy-- the spectrum of mitochondrial DNA mutations in Chinese patients[J]．Jpn J Ophthalmol，2002，46(1)：45． [6]郭向明，贾小云，肖学珊，等．中国人 Leber遗传性视神经病变线 粒体 DNA突变频谱[J]．中华眼底病杂志，2003，19(5)：288． [7]金学民，胡宏阁，刘斌，等．Leber遗传性视神经病变家系线粒体 DNA突变检测[J]．郑州大学学报(医学版)，2005，7(4)． [8]Torroni A，Carelli V，Petrozzi M，et a1．Detection of the mtDNA 14484 Mutation on all Africa—spectific haplotype：implications about its role in causing Leber hereditary optic neuropathy[J]．Am J Hum C,enet，1996，59：248—252． 收稿日期：2007—03—18 (上接第45页) 占86％，与其他研究者的报道相近 。症状均为不孕或性 发育异常。故男性不育或性发育异常均应行细胞遗传学检 查。患者大都为婚后检出，绝大多数患者是由于婚后不育而 就诊 ，这部分患者在检出 Klinefeher综合征核型加之多次精 子计数为零后，可作出不育的结论性诊断，劝告其不必乱投 医，可通过供精人工授精解决生育问题。鉴于Klinefelter综 合征患者一般都具有临床特征，故应重视在婚检中对此征的 检出，使患者对其生育前景有所预料和心理准备，避免不必 要的医疗负担，也有利于家庭稳定。 参 考 文 献 [1]Visootsak J，Graham JM Jr．Klinefeher syndrome and other sex chro— mosomal aneuploidies[J]．Orphanet J Rare Dis，2006，24：l：42． [2]周汝滨，李永全，等．湛江地区 85例 Klinefelter综合征染色体分 析[J]．中国优生与遗传杂志，2001，9(6)：37—38． [3]黄平治，李永海，等．男性不育[M]．第 l版，科学技术文献出版 社，1990，l38． [4]Nielsen J，Pelsen B，et a1．Follow—up 0f 30 Klinefeler males treated with testc~terone[J]．ClinC,enet，1988，33(4)：262—9． [5]冯俭．65例 K1inefelter综合征的临床特征与治疗[J]．中国优生 与遗传杂志，1997，5(3)：102． 收稿日期：2007—05—25 维普资讯 http://www.cqvip.com