Leber遗传性视神经病变线粒体DNA原发性突变位点的分析

· 574 · Chin J Dis Control P 2006 Dec；10(6) Leber遗传性视神经病变线粒体 DNA原发性突变位点的 杜卫东 ， 一，吕永梅 ，汤华阳 ，黄叔仁 ，陈大本 ，何祥成 ，王永清 ，孙松 ，张学军1-2-3 【摘要】 目的 探讨 Leber遗传性视神经病变(LHON)线粒体 DNA原发性突变特征。方法 利 用 Pyrosequencing和测序技术对 11个 LHON家系的13例典型患者及其 30位家系成员 11778G> A等 12余种线粒体 DNA突变位点进行分析。结果 本地区LHON患者均为线粒体 DNA同质性 突变(homoplasmy)。11个 LHON家系中有 7个分别含有 11778G>A，14484T>C和 3460G>A原 发性突变位点，占63，6％(7／11例)。13例患者线粒体 DNA突变以 11778G>A为主(53，8％，7／ 13例)。13708G>A和3552T>A突变单独存在于 2个 LHON家系中。3460G>A与 3394T>C 合并存在。未发病家系成员中可见 11778G>A，14484T>C，13708G>A纯合性或杂合性突变体。 结论 继发性突变位点可单独存在，也可与原发性突变位点合共同导致 LHON的发病。11719 G >A可能成为人线粒体有用的生物标签。 【关键词】 视神经疾病；DNA，线粒体；点突变； 【中图分类号】R774，6 【文献标识码】A DNA突变分析 【文章编号】1008—6013(2006)06—0574—06 Analysis of primary mitochondrial DNA mutations of Chinese patients with leber’s hereditary optical neuropathy(LHON) DU Wei—dong ’ 一，LV Yong—mei ，TANG Hua—yang。，HUANG Shu—ren4， CHEN Da—ben ，HE Xiang—cheng4，WANG Yong-qing4，SUN Song ，ZHANG Xue—jun ’ 一． 1．Institute ofDermatology，Anhui Medical University，Hefei 230032，China；2．Department of De rmatology，FirstAffiliatedHospitalof AnhuiMedical University，Hefei 230022，China；3．Key Lab of Gene Resource Utilization for Severe Hereditary Diseases of Ministry of Education and Key Lab of Genome Research of Anhui Province，Anhui Medical University，Hefei 230032，China； 4．Ophthalmology Hospital，Red Cross Association of Anhui Province，Hefei 230022，China； 5．Department of Ophthalmology，University of Science and Technology of China，Hefei 230026， China 【Abstract】 Objective To question the characteristics of primary mitochondrial DNA mutations in Chinese patients with Leber’s hereditary optical neuropathy(LHON)．Methods Twelve mutations in 1 3 patients and 30 members from 1 1 LHON pedigrees were investigated with Pyrosequencing and DNA sequencing techniques．Results All the mitochondrial DNA mutations of the LHON patients in this study are homoplasmy．Seven of the 11 pedigrees showed 11778G>A，14484T>C and 3460G>A，re— spectively，accounting for 63．6％ (7／11)．11778G>A mutation in these patients is prevalent(53．8％， 7／13)，13708G>A and 3552T>A mutations occurred alone in two LHON pedigrees，respectively， 3460G>A and 3394T>C mutations were found to co-exist in LHON．Either homoplasmy or hetero— plasmy 11778G>A，14484T>C and 13708G>A appeared in LHON pedigree members who showed no clinical manifestation．Conclusions Secondary mutations not only alone but integrating with primary mutations led to LHON pathogenesis．The 11719G>A．would be a potential genetic bio-barcode of hu— man mitochodrion． 【Key words】 Optic nerve diseases；DNA，mitochondrial；Point mutation；DNA mutational analysis (C J Dis Control Prey 2006，10(6)：574—579) 【基金项 目】 【作者单位】 【作者简介】 【通讯作者】 国家自然科学基金(30470591)；安徽省“十五”高校学科拔尖人才基金 。安徽医科大学皮肤病研究所，安徽 合肥 230032 安徽医科大学第一附属医院皮肤科 ，安徽 合肥 230022 省部共建教育部重要遗传病基因资源利用重点实验室，安徽省基因研究重点实验室，安徽 合肥 230032 安徽省红十字会眼科医院，安徽 合肥 230022 中国科技大学医院眼科 ，安徽 合肥 230026 杜卫东(1958一)，男，江苏徐州人，教授，博士。主要研究方向：线粒体疾病分子生物学。 杜卫东 ，E—mail：weidongdu@hotmail．com 维普资讯 http://www.cqvip.com 疾病控制杂志 2006年 12月第 10卷第 6期 Leber遗传性视神经病变(1eber’S hereditary op— tical neuropathy，LHON)是一种 罕见母 系遗传 的致 盲性眼病，主要累及视盘黄斑束纤维，导致视神经退 行性病变的线粒体遗传性疾病。临床以双眼同时或 先后急性 、亚急性中心视力下降为表现 ，常伴有色觉 障碍为其特征。有时伴有周围神经病变，心脏传导 阻滞和肌张力降低等症状。并且临床无特效治疗方 法。LHON男 性发病高于女性 。发病可见 于任何 年龄组 ，但 以青春期多发 l-3；。LHON病的病 因至 今未明，可能与线粒体基因突变 lj以及体内氰化物 代谢障碍有关 4j。近年来不少学 者强调环境危 险 因素 ，尤其是吸烟对本病发生 的影响 j。文献 6j报 道 LHON 只有 50％发生是 由于母 系遗传，其余 50％则可能来源于散发病例。 已有研究表明 95％以上的 LHON是 由 mtND4 *LHON1 1778A，mtND1*LHON3460A 和 mtND6 *LHON14484C等3种位点突变所致，由这 3个位 点上的任一个碱基发生突变导致 的 LHON病称之 为原发性突变点 ，其中 11778G>A突变约占原发 性突变 50％～90％。亚洲人 11778位点突变率似 乎比欧洲人高 8j。另外，已发现 25个以上线粒体 DNA 突 变 与 LHON 相 关 ，其 中 包 括 mtND1* LHON4216C，mtCYB * LHON15257A，mtND5 * LHON 1 3708A，mtCO1*LHON7444A 和 mtND1* LHON3394C 等 ，这 些 突 变 称 之 为 继 发 性 突 变[ ， ， ]。该类突变可以与原发性突变合并出现。 但单独 继发性突变能否导致 LHON病发生或对该 病的影响 ，众说纷纭。 本研究拟对合肥地区 LHON患者线粒体 DNA 编码 及调 控 区 3种原 发性 突变位 点 ：11778G>A (NI34)，3460G>A(ND1)和 14484T>C(ND6)及九 种已知 LHON相关继发性突变位点：3394T>C (ND1)，3552T>A(ND1)，4216T>C(ND1)，7444G >A(CO1)，9438G>A(CO3)，9738G>T(CO3)， 9804G>A(C03)，13708G>A(ND5)和 15257G>A (Cyb)等进行焦磷酸测序(pyrosequencing)和线粒体 DNA序列分析，以期对 LHON发病机制进行探讨。 1 材料与方法 1．1 对 象 选择 2005年 5月 ～2005年 11月 间， 从安徽省红十字会眼科医院和中国科学技术大学眼 科医院收取 的 11个 LHON家系的 13例 LHON患 者 ，及其 30例家系成员为对象。LHON诊 断主要 依据以下标准 ：患者主要表现为无痛性 、急性或亚急 性双眼视力相继下 降，初诊 时最佳矫正视力 为光感 · 575 · ～ 0．6。所有患者均有视神经异常 、急性或亚急性视 神经炎和视神经萎缩 ，排除其他原 因引起 的视神经 病变，未见其他视神经 系统 和心脏异常。详细询问 家族史 ，确 定患者母 系血缘 亲属及其 LHON患 者。 如母系亲属双眼均正常 ，无视办下降及视神经萎缩 ， 则认为是无症状者。 1．2 临床资料 11个 LHON家系 43人 中(男 25 人 ，女 18人)，13人有 症状，其 中男性 9例，女性 4 例。平均年 龄为20．4±6．8岁。外 显率 为30．2％。 发病情况 ：13例患 者视力均 明显下降 ，视力下 降程 度为光感～0．5不等。其 中双眼同时下降者 4例 ，双 眼视 力 先后 下 降 者 9例 ，双 眼发 病 间 隔 时间 为 0．5～6个月，平均2．7个月。色觉检查均为色觉障 碍。13例患者中 5例经治疗后视力有所好转。 1．3 线粒体 DNA制备 收集 11个家系的 43个家 族成员外周静脉血。按照血液 DNA制备试剂盒要 求抽提线粒体DNA。DNA抽提试剂盒购自Takara 公司。纯化后 DNA置 4℃贮存 。 1000bp一 500bp一 400bp一 300bp一 3 4 圈 1 PCR 电 冰 结果 Figure 1 PCR products on gel 1：marker；2：PCR product 1 at nucleotides 11778；3：PCR product 2 at nucleotides 14484；4：PCR product 3 at nucleotides 3460． 1．4 含有线粒体 DNA突变位 点 PCR片断的扩增 对 可能 含有 导致 LHON 3个原 发性 突 变位点 (11778G>A，14484T>C和 3460G>A)以及七个 继发性 突变点 (4216T>C，7444G>A，9438G>A， 9738G>T，9804G>A，13708G>A 和 15257G>A) 的线粒体 DNA进行了 PCR扩增。引物按 Pyrose— quencing Assay Design Sofeware 1．0(Biotage公 司 ) 设计。上、下游及测序引物序列见表 1。引物 由 Thermo Electron公 司 (Ulm，Germany)合成。PCR 仪为 Corbtt Research CG1—96型(Australia)。PCR 扩增体系 ：1×PCR缓冲液 ，2．5 mM MgCI2，125 M dNTP，0．2 M 上 、下 游 PCR 引 物，100 ng模 板 维普资讯 http://www.cqvip.com · 576 · DNA，1 U AmpliTaq Gold(Applied Biosystems， Damstadt，Germany)。扩 增 条 件 ：95℃ ，5 min； 95℃ ，15 S，57℃ ，30 S，72℃ ，15 S，共 50个 循环 ； 72℃ ，5 min。扩增后 ，PCR产物经 1．5％琼脂糖凝 胶 电泳鉴定。结果见图 1。 1．5 线粒体 DNA突变位点 Pyrosequencing检测 使 用 PSQTM 96 MA 仪 (Biotage公 司 ，Uppsala， Sweden)对患者外周血线粒体 DNA上述 突变体进 行检测。Pyro Gold Reagents(REF 40—0044)，Bind— ing缓冲液(REF40—0033)，Annealling缓冲液(REF 40~036)和 Washing缓 冲液 (REF 40—0035)购 自 Biotage 公 司 (Uppsala，Sweden)。 Streptaviding Sepharose(high performance)购 自 Amersham Bio— sciences(Uppsala，Sweden)。Pyrosequencing检 测操 作步骤及试剂盒使用见仪器和产品说明。 Chin J Dis Control Prey 2006 Dec；10(6) 1．6 线粒体 DNA突变位点测序分析 所有患者 1 1778G>A，14484T>C和 3460G>A 的 Pyrose— quencing结果均经过相应线粒体 DNA序列分析再 确定 ，同时对这些 序列内可能 出现的其他突变位点 进行筛查。检测 mtDNA 突变位点的引物序列 (表 2)。PCR引物 由上海生工公司合成。PCR试剂盒 购 自大连 Takara公司。PCR扩增体 系：1×PCR缓 冲液 ，1．25 mM MgCl2，100 M dNTP，0．1 M上、 下游 PCR引物 ，70 ng模板 DNA，1 U Taq DNA聚 合酶。扩增条件 ：预变性94℃ ，5 min，然后 ，94℃， 变性45 S、55℃ ，复性50 S、72℃ ，延伸50 S，共 45个 循环 ，最后 ，72℃ ，延伸10 min。PCR产物用 2％琼 脂糖凝 胶电泳检测。PCR扩增 产物 由北京 奥科 生 物技术有限公司纯化并序列分析。 表 1 LHON 3种原发性和 7种继发性突变位点 pyrosequencing检测引物序列 Table 1 Pyrosequencing primer sequences for three primary mutations and seven secondary mutations in LHON 表 2 LHON线粒体 DNA 3种原发性突变位点 PCR引物 Table 2 PCR primers of mtDNA LHON primary mutations 2 结果 对 l1个 LHON 家系的 13例患者及其相应 的 30个家系成员 外周血细胞 线粒体 DNA 11778G> A，14484T>C和 3460G>A等 3种原 发性 突变位 点以及 9种继发性突变位点进行 了 Pyrosequencing 筛查(图 2)以及 DNA测序分析(图3)。结果发现所 有患 者线 粒 体 DNA 突 变均 为 同 质性 (homoplas— my)。13例患者 中 7例为 11778G>A突变，3460G >A和 14484T>C突变各有一例。本研究 11778G >A突变占已明确定位诊断原发性患者 的 77．7％ (7／9例 )。家系 1中两位家族成员(患者弟 1及母 ) 为 11778G>A杂合性 突变(heteroplasmy)。家 系 2 中一位家族成 员 (姨 )为 11778G>A纯合性 突变。 家系 4和家系 5分别为 13708G>A 和 14484T>C 纯合性突变 ，除先证者之外 ，这些家系其他成员均未 出现任何临床症状。线粒体 DNA测序分析原发性 突变位点的结果与 Pyrosequencing完全一致。测序 还发现患者 8有 3552T>A突变 ，患者 9有 3394T >C突变(图 3)。继发性突变位点可以与原发性 突 变位点同时存 在 ，如患者 9中 3394T>C与 3460G >A，但也可以单独存在 ，如患者 5的 13708G>A突 变和患者 8的 3552T>A突变等。除了患者 1以 外 ，所有检测 患者均含有 11719G>A改变 。l1个 LHON家系中有 2个未能筛查出上述 12种突变位 点。Pyrosequencing和测序 比较结果 见表 3。13例 患者中有 8例治疗无效 ，其中 11778和 3460等原发 性突变 占 6例 (75．0％)。有 5例 经治疗 后视力好 维普资讯 http://www.cqvip.com 维普资讯 http://www.cqvip.com · 578 · 表 3 Table 3 Chin J Dis Control PrP 2006 Dec；10(6) Pyrosequencing及线粒体 DNA测序分析对 LHON病原发性突变位点检测的比较 Pyrosequencing and DNA sequencing comparison in detecting LHON primary mutations Pyrosequencing DNA sequencing 11778G>A 14484T>C 3460G>A 11778G>A 14484T>C 3460G>A 11719G>A Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Patient 5 Patient 6 Patient 7 Patient 8 Patient 9 Patient 10 Patient I1 Patient 12 Patient 13 1447OT>C 3552T> A 3394T>C．3381A>G 使视力受损 ．7 J。本研究发现合肥地区 LHON仍以 11778G>A 变 异 为 主 (7／13例 )，3460G> A 和 14484T>C各有一例，11778G>A突变占已明确定 位诊断原发性突变患者 的 77．7％(7／9例)。原发性 突变致 LHON占研究病例的 69．2％(9／13例)，较 目前国内外报道为低，这可能与在研样本量较小有 关。 LHON患者的临床症状轻重不一，复杂多样。 文献_5 报道 85％的 LHON病例为纯合性，15％为 杂合性。就杂合性病例而言，LHON临床症状的严 重程度取决于突变线粒体 DNA阈值的高低以及所 累细胞对能量代谢需求大小。伴有高度突变的同质 性患者更易于产生视力丧失。携带 白细胞源性线粒 体DNA同质性 11778(homoplasmy)的母亲较其突 变阈值低于 80％的母亲更容易生产表现临床症状 的儿子_l 。但也有人对这一结论表示置疑 ，认为这 是由于白细胞与神经细胞异质性水平存在差异的缘 故_l 。本 研 究 发 现 11778G>A 突 变 不 仅 见 于 LHON病患者中，也存在于母系家族的未发病其他 成员中。家系 1中有 2位患者为 11778G>A纯合 性突变 ，其家系中另外 2位成员(弟和母 )为 11778G >A杂合性突变；家系2成员中(姨妈)为 11778G> A纯合子。家系4和家系 5分别为 13708G>A和 14484T>C纯合性突变，然而，除先证者之外，这些 家系其他成员均未出现任何临床症状。产生这些差 异的确切机制目前尚无法定论，有人认为可能与其 线粒体DNA突变的阈值或／和受累线粒体数量偏 低有关【1 。但本研究 家系分析 中更多 的迹象表 明 11778G>A，14484T>C和 13708G>A的单独存在 似乎不足以导致 LHON的发生。 本研究有 4个 LHON家系未发现原发性突变 位点的存在，其中2个已证实为单独出现的继发性 突变(13708G>A和 3552T>A)。另外 2个家系未 能在上述 12种突变位点中检测 出，推测这 2例病变 可能源于其他继发性突变所致。另外 ，本研究发现 在原发性 LHON家系中继发性突变位点 3394 T> C可以与 3460G>A 同时存 在。因此 ，认为原发性 及继发性突变在导致 LHON过程 中似乎是各 自独 立的事件 ，13708G>A，3552T>A以及其他继发性 突变点可以单 独引起 LHON 的发生。至于原发性 突变与继发性突变间对 LHON临床症状的加重有 否协同效应 ，值得进一步探讨。 另外，本研究发现 13例患者中8例患者治疗无 效 ，其中原发性突变(11778G>A和 3460G>A)占 6 例(75．0％)。经治疗后视力好转的 5例中，3例为 继发性突变 ，提示 LHON病的疗效与预后似乎与突 变类型有关。 DNA测序可以检测某一突变位点的侧翼序列 ， 因而可以筛选线粒体 DNA可能同时存在的其他突 变位点。本研究发现患者之间序列差异较大，除了 患者 1以外，其他病 例均见 11719G>A 变异。 11719G>A为无义突变。曾有人认为 11719>A的 出现与精子不动症[¨]和线粒体肌病等相关[ ]，但 近年来更多的迹象表明这一单核苷酸多态性可以恒 定地出现于欧洲[ ]以及中国人线粒体样本中["]， 该研究推测 11719G>A可能成为人线粒体有用的 生物标签。至于 3381A>G，3725T>A，11944T>C 以及 14470T>C在 LHON中出现的临床意义尚有 待于研究。 目前临床对 LHON 的诊断主要通过典型家族 " m 如 丝 懈 e e e e e e e e e d 三萋 三萎 维普资讯 http://www.cqvip.com 疾病控制杂志 2006年 12月第 10卷 第 6期 史和临床症状加以判断。婚前遗传咨询与分子遗传 学检测是预防并降低本病发生率的有效措施。基因 诊断技术如 DNA序列分析，限制性片段长度多态 性(RFLP)分析，PCR一单链构象多态性(PCR—SSCP) 分析，寡核苷酸芯片[18]和 Pyrosequencing技术[ ]等 技术，已逐渐应用于 LHON的临床诊断中。Pyrose— quencing技术可以高通量、灵敏、特异地进行突变位 点筛选，短靶核酸序列分析(60—100 bp)及核酸甲基 化研究并可提示突变存在状态(纯合性／杂合性)。 该研究发现 Pyrosequencing仪操作简便 ，可重 复性 强。突变位点定性与 DNA序列分析完全一致，两 种检测技术可 以互补。因此，笔者认 为对于大样本 筛查已知突变位点或对靶核酸进行短序列分析 Py— rosequencing仪不失为一种有用的工具 。 【参 考 文献 】 [1] Wallace DC，Singh G，Lott MT，et a1．Mitochondrial DNA 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