应用HRM分析Leber遗传性视神经病变家系mtDNA突变

294 分子诊断与治疗杂志 2010年 9月第 2卷第 5期 J Mol Diagn Ther,September2010，Vo1．2 No．5 应用HRM分析Leber遗传性视神经病变家系mtDNA 突变 万智慧 李修春 段唯 任翔 王擎 刘木根 唐朝晖 李毅 【摘 要】 目的 揭示一个 Leber遗传性视神经病变 (Leber's hereditary optic neuropathy，LHON) 家系的遗传基础。 方法 对家系成员提取线粒体 DNA (mtDNA)，直接进行测序分析，用分子克隆法 为每个人构建单克隆群，再用高分辨熔解曲线技术和DNA测序的方法，对家系中成员的单克隆群分析统 计，计算该家系成员的线粒体DNA突变比例。 结果 该家系患者mtDNA上11778位核苷酸发生G到 A的突变。家系成员中G 11778 A突变比例分别为：先证者 (II2)91．67％；父亲 (I2)0％；3位母系家属 正常人依次为： (I1)90．83％、(II1)53．16％、(II3)49．16％。 结论 G 11778 A的同质体 (即：突变比 例达到90％以上 )女性仍可不患Leber遗传性视神经病变，该女性后代的平均突变比例远小于先前的报道。 【关键词】 Leber遗传性视神经病变；mtDNA 1 1778位点突变；高分辨熔解曲线分析；测序 Applying HRM to analysis the mtDNA mutant in a pedigree with Leber’S hereditary optic neuropathy WAN Zhihui，LI Xiuchun，DUAN Wei，REN Xiang，WANG Qing，LIU Mugen，TANG Zhaohui ，LI Yi (Center for Human Genome Research，College of Science and Technology,Huazhong University of Science and Technology,Hubei，Wuhan 430074，China) 【ABSTRACT】 Objective To investigate the genetic basis for a Chinese pedigree with Leber's hereditary optic neuropathy (LHON)． Methods Direct DNA sequence was performed for 3 candidate mtDNA sites．High resolution melting and sequencing were carried out to analyse the proportion of mutant mtDNA of each member in the LHON pedigree afterwards． Results A single nucleotide substitution Of G for A was found at 1 1 778th of mtDNA．The proportion of mtG1 1 778A for the proband 012)，his father(I2)，and three unaffected maternal members(I1，II1，II3)were 91．67％，0％，90．83％，53．16％，49．16％，respectively． Conclusion Our study found that the female G11778A mtDNA mutation carrier I1，who contains more than 90％ G1 1 778A mtDNA mutation，could be unaffected，and her children’S average proportion of mutant mtDNA was far lower than the previous reports． fKEY WORDS】 Leber’S hereditary optic neuropathy；Point mutation of mtDNA 1 1 778；Higb resolution melting；Sequencing Leber遗 传 性 视 神 经病 变 (Leber’S hereditary optic neuropathy,LHON)是一种较常见的主要由线 粒体 DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)突变而导 致的具有家族遗传特点的疾病。在不同的人群中， 其外显率大约在 1／3 1000到 1／50000之间 [1-3]0该病 在临床上一般现为急性或亚急性双眼视力丧失，视 野上出现中心或旁中心暗点，中心视觉缺失，视盘充 ● 论 著 ● 血，视神经纤维层变薄或缺失等特点 。患者发病 高峰年龄一般在 1 5-30岁 [4】，且男性患者比例明显高 于女性 [6】。 目前已经发现 50多个与 LHON相关的 突变，其中90％～95％的LHON患者与mtDNA上三 个原发突变位点 (G3460A、G11778A、T14484C) 相关，这些突变均位于编码 NADH一泛醌还原酶的区 域内 ]，另外，酗酒、吸烟等因素也可能诱发该病的 基金项 目：国家自然科学基金 (30771199，30770455) 作者单位：华中科技大学人类基因组研究中心，生命科学与技术学院，湖北，武汉430074 通讯作者：唐朝晖，E-mail：zh — tang@mail．hust．edu．cn 分子诊断与治疗杂志 2010年 9月第 2卷第 5期 J Mol Diagn Ther,September2010．Vo1．2 No．5 发生 _4】。 线粒体遗传病具有外显率和表现度不一致 等特点，而一般患者及其亲属细胞中突变型 mtDNA 的比例，与发病风险常常呈现出较强的相关性 】，因 此，对 LHON患者及其家族成员 mtDNA突变比例进 行检测，不仅可以使患者家族成员积极进行疾病的预 防和治疗，同时也为更深入地了解此类疾病的病因提 供帮助。 近年来，一种主要用于高通量突变扫描和基因 分型的新技术——高分辨熔解曲线 (high resolution melting，HRM )法逐渐发展起来。该方法主要基于 核酸的物理特性对 目的片段进行分析，其检测具有 简便、高通量、快速、灵敏度高、低成本、不受检测 位点局限且能检测出纯合突变与杂合突变 [8-10]等多 种优势，提高了突变检测效率。 本研究中我们应用 HRM 这一新技术对一个 LHON患者家系中 5位成 员的突变 mtDNA的比例进行了检测。 1 对象和方法 1．1 研究对象 本实验研究对象来自湖北省赤壁市，先证者因视 力急剧下降到医院就诊，被多家医院诊断为 Leber遗 传性视神经病。经本人及其家人书面同意，收集全 家共 5人 (图 1A)的外周血样本。 1．2 研究方法 1_2_1 人类 基因组 DNA提取：研究对象基 因组 DNA的提取用 Promega公司的Wizard genomic DNA purification kit试剂盒，按产品说明书逐步提取全基 因组 DNA，紫外分光光度计检测 DNA含量和纯度。 1_2．2 引 物 合 成：从 GeneBank数 据 库 获 得 mtDNA全序列 (GenBank：FJ460548．1)，包含 mtG3460A、mtG 1 1 778A、mtT 1 4484C三个原发位点 的引物以及包含 11778位点的用于 HRM 检测的引 物，引物序列及长度如表 1所示。 表 1 LHON三个原发位点检测引物序列 Table 1 The primer sequences for detection ofthree primary mutations ofLHON 1_2．3 突变检测：以G3460A—F／G3460A—R，G11778A— seq—F／G11778A，T14484C．F／T14484C—R三 对 引 物 对II2号患者测序，并将测得的序列与正常人序列 进行比对，以检测该患者发病的分子遗传学基础。 之后，利用 I12的测序结果，再对家系中其他人进行 测序。 1 I2_4 HRM 分 析：以 G11778A．hrm—F／G11778A-R为 引物，以该家系五位成员的 DNA为，扩增包含 G11778A突变点区域，长度为 102 bp的片段。PCR产 物纯化后与 T-easy载体连接，连接反应在4 0C过夜，连 接体系依照 T-easy的说明书。连接产物转入大肠杆菌 感受态细胞，针对每个个体挑选出多个阳性克隆。 以挑 出的所 有单 克 隆 为模板，以G11778A— hrm—F／G11778A—R为引物在Rotor-Gene 6000(Corbett Research Pty Ltd，澳大利亚 )上进行 HRM 检测，同 时设置阳性对照 (即经过测序证明肯定含 G11778A 突变的片段)以及阴性对照 (即经过测序证明肯 定 不含 G11778A突变 的片段 )。 反应 总体 系为 25 ，其 中 模 板 DNA：1 ，dNTP(10 mM )： 0．5 ，Taq酶 (5 U／ )：0I3 pL，引物 (10 pM)： 0．4 pL／条，10×Buffer(含 Mg )：2．5 ，LC Green 染料：1 pL，加水至总体积为 25 。 反应程序： 95。C变性 5 min，片段扩增循环共 40个：95。C变性 10 S后，在适当的退火温度 (进行 HRM 反应前通 分子诊断与治疗杂志 2010年9月第2卷第5期 J M01 Diagn Ther,September2010，Vo1．2 — Nc 过PCR确定 )下退火 10 S，72。C延伸 15 S，最后在 72。c中延伸 5 min后结束。反应前设置温度范围为 70。C～90。C，灵敏度为0．2。C。反应结果利用 Rotor． Gene 6000 Series Software version 1．7．87(Corbett Research Pty Ltd，澳大利亚 )进行分析。 根据每个个体HRM分析结果中出现的不同类 型熔解曲线的样本进行抽样测序，并根据测序结果以 及与对照的比较，鉴别各个熔解曲线的类型，最后通 过对突变数量的统计分析得到突变mtDNA的比例。 2 结果 A C ＼-／ U I1 l2 I - ( 1I1 Il2 Il3 2．1 诊断结果 患者 II2，男，15岁，因两眼视力同时下降到医 院就诊。经查，其视力左眼 0．03，右眼0．04，双眼视 野出现缺损，眼底荧光造影检查显示两眼视乳头有 轻微隆起，视乳头及其周围放射状毛细血管和小动 脉充盈，颞侧颜色苍白 (图 1c、D)，闪光视觉诱发 电位 (flash visual evoked potential，F．VEP)检查则 表明其双眼闪光 VEP潜伏期延迟，振幅值降低 (图 1B)，诊断为 Leber遗传性视神经病变，其父母 (I1 和 I2)以及姐妹 (II1和 II3)视力正常，无该病的家 族遗传史。 D A为患者的家系图；B为患者闪光视觉诱发电位检查结果，图左侧为左眼，右侧为右眼；C 和D为患者眼底荧光造影检查结果。 图 1 患者家系及其临床诊断 Figure 1 The LHON pedigree and clinical diagnosis of the patient 2．2 突变检测结果 对该家系中的先证者II2进行 LHON三个原发 突变位点 G3460A，G11778A和 T14484C的测序，发 现其具有 l1778位点核苷酸由G变为 A的改变 (图 2C)。进一步的测序表明该家系中，I1、IIl以及II3 都具有G11778A突变，其中II1和II3为杂合突变(图 2B和D)，而先证者 II2的母亲 I1则和II2一样为纯 合突变 (图2A)。 上述结果提示 G11778A突变是 引起先证者 112患有 Leber遗传性视神经萎缩的原因 所在。 图2 Leber家系成员的突变检测结果 Figure 2 The mutation detection results ofLerbefs family members 坌 堑 杂志 2010年9月第2卷第5期 J Mol Diagn Ther,September2010，Vo1．2 No．5 ．297． 2．3 HRM分析结果 利用 Rotor-Gene 6000自带的软件对家系中五 人 HRM 的结果进行分析，以已知含 G11778A突变 片段或正常片段作为参照，得到每个人的荧光强度变 化率对温度的曲线图 (图 3)，其中A、B、C、D、 E分别代表以 I1、I2、II1、II2、II3的单克隆为模板 HRM 的结果 (部分 )。根据曲线的相似度以及与参 照的差异度，将曲线加以分组，并选取每组的典型曲 线以及异常曲线 (标 的曲线)对应的样本进行测 序以确定各个组对应的样本是否含有GI 1778A突变。 } I ； t 一 一 =． ．i； ： — A、B、c、D、E分别代表以I1、I2、II1、II2、II3的单克 隆为模板 HRM 的结果 (部分)。A、E图以正常片段为参照，其余以突变片段为参 照。狭长的长方形黑框表示相交的曲线为同种类型片段 (即突变或正常 片段)。 表示该曲线已经经过测序验证。所有图中，组 1为正常片段， 组 2为突变片段。 图 3 以已知含 G1 1778A突变片段或正常片段作为参照得到 的家系中各个个体的荧光强度变化率对温度的曲线图 Figure 3 The HRM results ofDNA ffagrnents including G1 1778A for individuals irl the LHON family 表 2 家系各成员 mtDNA突变体含量 Table 2 The proportion of mutant mtDNA of each member in theLHON family 从图 3中可以看到，图3A与图 3D对应的Il以 及 II2曲线类似，他们的单克隆样品中突变片段的含 量比较高 (组 2)，而正常片段很少 (组 1)，表明他 们 含 G11778A突变的 mtDNA含量较高；相反，图 3B对应的 I2，则几乎全是正常片段，家系中患者的 两个姐妹，II1(图 3C)和 II3(图 3E)则显示其克 隆样品中正常片段 (组 1)与突变片段 (组 2)的数 量基本接近 l：1的比例。 所有个体突变片段以及 正常片段的数量以及突变片段的比例经统计后列于 表 2中 3 讨论 在本研究中，我们对一个 LHON家系进行了线 粒体 DNA上 LHON三个原发突变位点的检测，结 果发现患者 II2在 11778位点存在 G到 A的突变 ， 其余两个位点正常。以前的研究表明，在不同种族 背景的LHON患者中，mtG11778A的检出率大约在 40％～90％之间，而在中国LHON患者中的检出率则 高达 90．9％，是导致中国人 LHON的最主要的原发 突变位点 u”。 我们的结果再次表明G11778A是中 国人 LHON患者中的高频突变。 家系中其他个体的测序结果显示 ，患者II2的两 个姐妹 II1和II3有该位点的杂合突变 (图 1B和D)， 而患者的母亲 I1虽然和 111、113一样表型正常，但 是她却具有和患者II2一样纯合的G11778A突变(图 2A和 C)。接着，我们运用高通量的HRM技术对家 系中所有 5人 G11778A突变比例进行了检测，结果 表明，家系中唯一的患者 II2，其 G11778A的突变比 例非常高，达到 91．67％；正常表型的II1、113突变比 例分别为 53．16％、49．16％，有趣的是，家系中患者的 母亲 I1，尽管其 G11778A的突变 比例非常高，达到 90．83％，接近于其子患者 112的 91．67％，但她的视力 却未发现异常 (表 2)。 一 般认为，LHON的三个原发突变主要是同质体 突变，尤其是 G11778A的突变，其异质体比例大约仅 为 5．6％【 ]，Smith等 u3]的研究也发现在有 G11778A 突变的患者中仅有约 14％的人具有 10％以上的正 常 mtDNA，即只有少数人呈现不同程度的异质性。 在本研究 的病例中，H2的 G11778A突变 比例高达 91．67％，和大多数该突变的个体一样属于 Smith等 研究 中认定的同质体。 同时，我们看到其母亲 I1 的G11778A突变 比例也达到了 90．83％，同样也是 · 298· 分子诊断与治疗杂志 2010年9月第2卷第5期 J Mol Diagn Ther,September 2010，Vo1．2 No．5 G1 1778A的同质体突变，但其表型正常，该结果明显 表现出线粒体遗传中外显不全的特点。 此外，在本研究中，具有G11778A同质突变的 I1有两个表型正常的 G11778A异质体女儿，这个比 例 (2／3)远远高于 Smith等的研究结果，他们仅在 54个母亲是 G11778A同质体突变的孩子中发现了 1 例G11778A异质体 (1／54) ，同时，Yen等 认为， LHON mtDNA的突变比例会在传递中主要呈现上升 趋势，只有极少数病例其子代的突变mtDNA比例低 于亲代，而在我们的病例中，子代的 mtDNA的平均 比例为64．66％，远远低于其母亲 I1的90．83％，这表 明在 LHON mtDNA的遗传过程中可能受到多种因 素的影响，而不仅仅是先前有人提出的简单的随机传 递模式 _I 。 为了简便、准确地对本实验中LHON家系中各 成员进行基因分析，我们采用了HRM技术对 LHON 患者家系中5位成员的单克隆进行分析，并统计各个 成员突变 mtDNA的比例。 以往的位点特异性 PCR 检测方法虽然能有效的用于个体突变体含量的检 测，但为了提高反应的特异性，通常对退火温度及其 它PCR反应条件有很高的要求，因而具有一定的局 限性。HRM分析特别适用于突变筛选和基因分型的 优势性已被国内外学者所公认，在突变体含量的检测 上也具有更高的可信度，但其优势的充分发挥依赖于 目的基因及DNA片段自身的属性。研究表明，PCR 产物长度会影响 HRM结果的敏感性，片段越短，纯 合突变的检出越容易。 当PCR产物的长度在不大 于 1 000 bp时，HRM结果的敏感性为 98％，当PCR 产物长度小于 300 bp时，HRM结果的准确率可达 100％t 。 因此，本实验将受检 DNA片段长度限制 为 102 bp(<300 bp)，使得该实验在高效率的同时， 大大提高了准确性和可靠性。 参考文献 [1]Man P Oriffiths P G，Brown D et a1．The epidemiology of Leber 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