中国Leber遗传性视神经病变G11696A突变两个家系分析

· 556· 主堡堕兰 篮芏 查 至! 旦箜丝鲞箜 期 CAin JMedGenet，October2007，Vo1．24，No．5 · 临 床 遗 传 学 论 著 · 中国Leber遗传性视神经病变G11696A突变两个家系分析 赵福新 周翔天 瞿佳 韦企平 童绎 杨丽 吕建新 管敏鑫 【摘要1 目的 对两个中国Leber遗传性视神经病变(Leber’s hereditary optic neuropathy，I．HON)家系的 临床和分子遗传学特征进行分析。方法 眼科临床检查发现在这两个家系中只有先证者 1人出现视力障 碍，发病年龄分别为 1O岁和 17岁。对这两个家系先证者使用 24对有部分重叠的引物进行线粒体 DNA (mitoehondrial DNA，mONA)全序列扩增分析。结果 没有发现 mtDNA G11778A、G3460A和 T14484C 3个常 见的突变位点，而发现了与 LHON相关的ND4 G11196A同质性突变位点的存在，在 167名正常对照只发现 1 例 G11696A突变。结论 线粒体 DNA全序列分析发现两个家系呈现独特的mtDNA多态性，都属于东亚单 体型D4。不完全外显率和正常对照频率(1／167)表明 G11696A突变本身不足以导致 LHON的发生，说明其 它因素在这两个 LHON家系的表型表达中也起一定的作用。在这些家系 mtDNA中缺乏影响重要功能突变 位点的存在，排除了线粒体背景对 LHON临床表型的影响。因此，核修饰基因、环境因素可能对两个中国 G1 1696A突变家系的外显率和发病严重程度起促进作用。 【关键词】 Leber遗传性视神经病变； 线粒体 DNA； 点突变； 视力障碍 Leber’s hereditary optic neuropathy is associated with the milodmmirial Gl1696A mutation intwo Clfinese fm · lies ZHAO Fu-xin ，ZHOUXiang-tian。 ， qu ，WEI ，TONG K ，YANGLi。．一，LVJian-xin ，GUAN Min-xin ． (z^慨 Provincial Key laboratory of Medical Genetics，Wenzhou Medical College，Wenzhou，Zhe— j／ang，325035 P．R．China)； (School of fmD and O~ome．r，Wenzhou Medical College，Wenzhou，Zhe- j／ang，325027 P．R．China)； (Oepom,~ of Ophthalmology，Oonaf~g Hospital，aeiji~ Unioersity of Chinese Medicine andPhannaco／ogy，ne~／ng，100078 P．R．China)； (The First Affaia~ Hospital，Fujian Medical Universi— ty，Fuzhou，Fufian，350005 P．R．China)； (Division ofHuman Gem~ics，Cincinnati Children’s nospi~ Medical Center，~ncinnaa，OH 45229，USA) Corresponding~lghor：CA／AN Min-xin，Email：min-xin．guan@cchmc．org 【Abstract】 Objective To report the clinical，genetic，and molecular characterization of two Chinese families with Leber’s hereditary optic neuropathy(LHON)．Methods Ophthalmological examinations showed that only pmbands in two families exhibited visual loss at the age of 10 and 17 years respectively．The entire mitoehondrial genome of two pmbands was PCR amplified in 24 overlappingfragments using sets ofohgonucleotide primers．Results Mutational anal— ysis of mitoehondrial DNA (mtDNA)in these pedi Bes revealed the absence of three common LHON associated G11778A，G3460A and T144484 mutations but the presence of homoplastic LHON associated ND4 G11696A mutation， which was present in one out of 167 Chinese healthy contm~．C嘎ldlIl 岫 Sequence analysis of the complete mitoehon- drial genomes in two ped ees showed the distinct sets of mtDNA polymorphisms，belonging to Eastern Asian haplogroup D4．Th e incomplete penetrance ofvisual loss and the presence of one in 167 contm~suggested that this mutation itselfis insufficient to produce a clinical phenotype and other modifier factors play a role in the phenotypic manifestation．Th e lack offunctional mtDNA variants in these pedi Bes mled out the role of mitoehondrial background in the phenotypic ex· pression of visual loss．Therefore，nuclearmodifiergene(s)or environmentalfactor(s)may play a roleinthe phenotypic expression of the LHON·associated G11696A mutation in two Chinese pedisr~es． 【Key words】 I~ber’s hereditary optic neuropathy； mitoehondrial DNA； point mutation； vision loss *Supported by 2~aejiang Provincial Natural Science Foundation(ZB0202)and Key Research and Development Program titan 21ae· jiang Province(2004C14005) 基金项目：浙江省自然科学基金(zB0202)；浙江省重点研究和发展基金(2004C141X)5) 作者单位：325035温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室(赵福新、吕建新、管敏鑫)，眼视光学院(赵福新、周翔天、瞿佳、杨丽、管敏鑫)；北京 中医药大学东方医院眼科(韦企平)；福建医科大学附属第一医院(童绎)；~vision ofHumanGenetics，Cincinnati Children’sHospitalMedical Center，Cincin· nail。OH45229，USA(杨丽、管敏鑫) 通信作者：管敏鑫，Eamil：rain．xin．guon@cchmc．org 维普资讯 http://www.cqvip.com 生坐垦堂运 苤查 生 筮丝鲞第5期 Chin JMed C,enet，October 2OO7，Vo1．24，No．5 Leber遗传性视神经病变(Leber’s hereditary optic neuropathy， LHON)是一种主要累及视盘黄斑束纤维，导致视神经退行性变 的母系遗传性疾病。本病男性患者居多，发病年龄可从小于 l0 岁到70多岁，但常在20～30岁时发病。双眼同时或先后起病， 主要表现为急性或亚急性视力减退，伴中心视野缺损及色觉障 碍。1988年 Wallace等_l J发现 LHON与线粒体 DNA(mitoeheIldri— al DNA，mtDNA)突变有关 ，患者的氧化磷酸化复合物 I (NADH 脱氢酶)ND4亚基第 11778位点的碱基由 G置换为 A，使 ND4亚 基第 340位高度保守的精氨酸变成了组氨酸，从而导致 LHON 的发生。目前已发现有 4o多个与 LHON相关的 mtDNA突变位 点 ，其中NIM G11778A、ND1 G3460A和 ND6 T144~C被认为是与 III 2 3 4 o · 557 - LHON相关的3个公认的原发突变位点。近来我们在全国范围 内对中国LHON患者进行了系统性的调查研究 2 4。，我们对其 中两个LHON家系从临床、分子遗传学进行分析和讨论。 1 对象与方法 1．1 对象 通过温州医学院眼视光医院门诊和北京东方医院 眼科对两个家系先证者(图 1)经视力、视野、眼底、色觉及电生 理等检查均表现为双侧视神经病变，结合遗传特征，临床诊断 为 LHON。经过所有实验对象的知情同意和温州医学院伦理委 员会的批准，对该家系先证者及母系成员抽取外周静脉血，另 外采集 167名中国正常人血样作为对照。 I II III Ⅳ 图 1 两个 LHON家系图 a：WZ21家系|b：WZ22家系 1．2 方法 1．2．1 眼科临床检查 对该家族中的所有成员进行眼科临床 检查，包括标准 对数视 力表视力 ，俞 自萍色觉 图检查， Humphrey视野计按程序 SITA检查(Humphrey Visual Field Analyz— er lli，SITA Standard)，德国罗兰电生理仪(Roland Consult m port gamma，pattern or flashⅥ1P)检查视觉诱发电位(VEP)以及佳 能眼底数码彩照(Canon CR6—45NM fundus camera)拍摄眼底。 1．2．2 mtDNA突变检测 先证者及家系母系成员和正常对照 者经 EDTA-K3抗凝的全血或血滤纸片用经典的酚一氯仿法提取 DNA，然后以提取的 DNA为模板，首先对先证者及家系母 系成 员 3个原发位点进行扩增 ，扩增引物见表 1。引物使用 Primer Premier 5．0软件进行设计，由宝生物工程大连有限公司合成。 PCR反应体系：DNA模板 20～50 ng，dNTP终浓度为200tnnol／L， MgCl2终浓度为 1．5 mmol／L，引物终浓度为 0．1 tnnol／L，Ex 酶 0．5 u(购自TaKaRa宝生物工程大连有限公司)，加去离子水 至总体积为20 。使用Boi—Rad公司的2200自动扩增仪进行 扩增，反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性 30 s，58℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，35个循环，然后再延伸7 min；扩增产物使用 1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光分析仪观察扩增的结果。 表 1 mtDNA突变检测所用引物序列及 PCR产物长度 ① 为了确定线粒体单体型对 LHON外显率和表现度的影响， 使用扩增片段有部分重叠的24对引物_5j，对两个家系先证者 线粒体基因组全序列进行扩增，退火温度58～61℃(根据不同 引物优化)，其它反应条件同上。PCR产物使用纯化试剂盒(大 连宝生物有限公司)纯化后并送该公司使用 ABI PRISM 3730测 序仪进行双向测序(ABI公司，美国)，峰图结果用 Chromas Pro1．33软件分析。 1．2．3 结果分析 测序结果与修正的线粒体 DNA剑桥参照序 列进行对比_6J，DNA序列及蛋白质比对使用 DNASTAR和Mito— Analyzer软件进行处理。为了分析 G11696A的频率，使用表 1 中与11778位点相同引物对正常对照样本进行扩增、测序及相 应处理分析。 2 结果 2．1 临床表型 在家系WZ21中，先证者(Ⅲ )在 17岁时因视 力模糊，就诊于北京东方医院，双眼先后起病，右眼先发病，20 天后左眼也发病；视力检查右眼为 0．05，左眼为 0．2；眼压 16 mmHg，色弱 ，有光幻觉，瞳孔对光反射存在；视盘充血，盘缘小 血管扩张，视野左旁中心暗点，右象限缺损，电生理闪光视觉诱 发电位(F-VEP)检查显示双眼 P100波潜时延长，表现为典型的 LHON临床症状，进一步检查没有发现其它疾病。家系中其他 9个母系成员经检查身体及视力均正常。先证者经治疗后视力 有所改善，近期视力复查右眼为 0．1，左眼为 0．4。 在家系 WZ22中，先证者(Ⅳ )在 10岁时因双眼视力无痛 渐进性下降来温州医学院眼视光医院就诊，经检查右眼视力为 0．4，左眼为0．5；眼底摄影双眼颞侧视乳头色泽苍白，中央视神 经血管弯曲，视乳头毛细血管发生微血管病变；眼底检查表现 为视野中心暗点，色觉正常，具有典型的LHONI临床表型，经 维普资讯 http://www.cqvip.com · 558· 中华医学遗传学杂志2O07年 lO月第 24卷第 5期 Chin JMed C,enet，October 2O07，Vo1．24，No．5 C T T C A C C 6 6 C 6 C ^ 6 T C ^ T T C T C A T ^ ^ T WZ21 III 图2 两个家系先证者和 1个正常者 N／M 基因部分峰图 箭头所指为 l1696位点 表2 两个 LHON家系的线粒体 DNA突变位点 WZ22Ⅳ， 正常 者 ‘见线粒体基因组数据库网站 ：http：／／www．mitomap．org T A ^ T ^ C T C T T “ C T ● A A C 6 C 6 6 C C A C T T C 维普资讯 http://www.cqvip.com 主堡医堂迫 堂叁查 年l0月第24卷第5期 Chin JMed Genet，October 2OO7，Vo1．24，No．5 CT／MRI全身进一步检查没有发现其它疾病，经过治疗视力无 好转，近期检查视力也无提高。而其它 10个母系成员没有发 现视力障碍及其它疾病。 2．2 线粒体 DNA分析 在先证者及家系成员未能检测到最常 见的3个原发 mtDNA突变位点(G3460A，G11778A和T14484C)， 但在两个先证者及其家系母系成员中均发现 NIM G11696A突 变位点(图2)，并导致 ND4亚基312位的缬氨酸变成异亮氨酸。 此突变在 5个中国家系中发现与 LHON相关( ，在一个荷兰大 家系中被证实与 LHON和肌张力障碍相关IsJ。mtDNA序列分 析发现这两个家系先证者都是同质性 G11696A突变。167名中 国正常对照分析发现只有 1例是阳性(男，25岁)(图2)。 这两个家系存在许多的多态性位点(表 2)，D-loop区有 10 个 ，rRNA有 5个，在多肽编码区存在 14个无义突变，11个错义 突变；两个先证者拥有 32个相同的变异位点，WZ21．Ⅲ 除拥有 一 些已知的变异 ATPase 8亚基 C8414T(L17F)、ATPase 6亚基 A8701G(T59A)位点外，还存在3个新的变异 ND2亚基 T4500C (sJ1P)，ATPase 6亚 基 C8702T( 9I)和 ND4L亚 基 T10663C (V65A)。通过对牛、小 鼠、蟾蜍及人几个不同物种保守性分析， 这些发生变异的位点和氨基酸在进化上并不保守。 3 讨论 LHON主要由 NIM G11778A、ND1 G3460A和 ND6 T14484C 3 个公认的原发突变位点引起，在不同人种背景中占LHON发病 的 80％～95％以上_9 ，3个突变主要影响患者氧化磷酸化复 合物I(NADH脱氢酶)的活性，对此研究和报道也较多，但其它 位点报道很少。在本研究两个中国家系中，先证者均表现双眼 视力下降，颞侧视野苍白，视中心暗点或盲点，P100波潜时延 长，经放射学和神经病学检查没有发现其它疾病，临床表型为 典型的LHON症状。mtDNA全序列分析发现了NIM G11696A突 变，两个家系患者在 RNA和多肽编码区没有发现影响重要功 能突变位点和其它继发突变位点的存在。11696G位于氧化磷 酸化复体 I NIM 亚基上，参与编码一个缬氨酸，位于一个跨膜 区，G11696A突变则使 ND4亚基312位非保守的缬氨酸变成异 亮氨酸。在一个荷兰家系报道 G11696A突变为异质性突变，降 低了复合体 I的活性Is J，而本研究中两个家系均为同质性突 变。双眼视神经病变为唯一的临床表型，临床及分子遗传学水 平分析表明 G11696A突变可能为 LHON的分子基础。与以前 报道 G11778A中国人家系外显率(约 18％～60％)相比_2 4。，这 两个 G11696A突变家系外显率极低，都只有男性先证者一人发 病(1／10，1／11)，其它母系成员尽管携带有相同的G11696A突 变，但并没有发病。先证者发病年龄分别为 17岁和 10岁，平均 13．5岁，与 Zhou等_8 报道平均 18．6岁有所差异，可能与病例过 少有关。不完全外显率、较轻的生化影响及正常对照频率(1／ 167)说明 G11696A本身并不足以致病 ，可能其它因素(如核基 因背景、环境因素，线粒体单倍型等)对 G11696A突变的外显率 和临床表现度起到促进作用。 线粒体单倍型已经被证实与 LHON的外显率和表现度有 关联，特别是单倍型J对原发位点 G11778A和T14484C发病有 很大的影响_】 ·bJ。对这两个家系先证者 mtDNA全序列分析发 现除了有相同的 G11696A突变外，还拥 有其它 31个相同的变 异位点，被归于东亚单倍型 D4【14]，从线粒体进化角度讲，他们 可能来 自于一个共 同的中国祖先。但这两个家系 mtDNA上不 存在影响重要功能的突变位点和其它继发突变位点表明在这 · 559 · 两个家系中线粒体单倍型D4可能不影响 Ⅲ0N发病。两个先 证者临床表型不一 ，可能与核基因、环境因素 (吸烟、饮酒、营状 不良及心理压力等)相关[15,16]。LH0N的许多特征仍无法解 释，如患者性别比例不等、男多于女，同一家系成员患病严重程 度存在差异，有些患者视力能够自行恢复，尤其 mtDNA突变并 不意味着患病等，有待进一步通过功能试验研究解决这些问 题。 参 考 文 献 l Wallace DC，SinghG，LoftMT，d a／．MitochondrialDNAmutation associ． ated with I．~,ber’s hereditary optic neuropathy．Sc／ence，1988，242：1427一 l430． 2 Qu J，Li RH，Tong Y，et a／．Only male matrilineal relatives with er’s hereditaryoptic neIJmpathyin alarge Chinesefamily carryingthemitochon— drial DNA G11778A mutation．B／ochem B／ophysRes Commun，2OO5，328： l139。l145． 3 Qian YP，Zhou XT，Hu YW，d a／．Clinical evaluation and mitochondrial DNA~ ellce analysisinthreeChinesefamilieswit}l Lelier’s hereditary 0D． tic neumpathy．B／oc／~m B／,~ys Res C mmm，2005，332：614-621． 4 Qu J，U RH，Zhou XT，d a／．The novel A4435G mutation in t}le mito． chorflrial tRNA聃 ma ymodulatethe phenotypic expression ofthe LHON as— sociatedND4 G11778Amutation in aChinesefamily．InvestOphth V／s ． 2Oo6．47：475．483． 5 Rieder MJ，Taylor SL，Tobe VO，d a／．Automating t}le identification of DNA variations usi|1g 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