核黄素产生菌的补料发酵

第l9巷蒂3期 2000年 5月 无 锡 轻 I 大 学 学 报 Journal of Wuxi University of Light Industry Vo1．19．No 3 May．．2000 文章龋号：1009—038X(2000)03—0240—04 z 。一≯ 核黄素产生菌的补料发酵 陆文清， 章克昌， 吴佩琼 (无 甭蘅 生物王 丽 江苏无锡214036) 7 擎 @ s； 摘 要：通过核黄素产生菌E．ashby／／在发酵过程中菌体量、糖质量浓度、pH值、核黄素质量 浓度和粘度的变化夏茵体彤态与核黄素生物合成之闻的联未，发现 pH值对茵体生长有显著的彰 响，茵体浓度过高会导致发酵液粘度过大，通风供氧困难，菌体活力下降．采用先低浓度培养菌体， 然后根据发酵液 pH值的变化进行多次适量补料，不仅可以控．I菌体的过度增殖．缓解通风供氧不 足造成的困难，而且还可以保持茵体活力，增加轼黄素的产量． 关键词： ； 塞壁 中国分类号：Q563．2 ；阿氏假囊酵母 文献标识 萄诈皱 Batch-fed Fermentation of Riboflavin Producing Strain E．ashbyii LU Wen-qing，ZHANG Ke-chang，WU Pei-tong (School of Biotechnology．Wuxi Univershy of ht Industry．Wuxi．214036) Abstract：By analyzing blomass，saccharide，pH，riboflavin and viaeosity of the broth during ri· boflavin producing strain E．ashbyii fermentation process and the relationship between the strain pro· file and riboflavin biosynthesis，it was found that pH has great effect on the strain reproducing an d higher biomass leading to higher viscosity of the broth which resulted in difficulties On broth aeration an d lower activity of the strain．By culturing E ．ashb3／i with lower nut~ent then feeding the broth with higher nutrient culture several times according to the pH of the broth．[1Ot only over—reproduc— ing of the strain could be avoided，the difficulties of broth aeration be alleviated and higher activity of the strain be maintained，but also the yield of ribo flavin could be improved． Key words：ribofIavin：batch-fed ferm entation E．ashb2n'i 核黄素是人和动物 自身不能合成的一种必需 维生索，在糖类、脂类和蛋白质代谢过程中起着极 其重要的作用．在医药、食品和饲料等行业有着广 泛的用途LI．2J． 核黄索的工业化生产有微生物发酵法和化学 合成法两种．目前以微生物液态深层发酵法为主． 生产用的菌种主要有阿氏假囊酵母(Eremoshecium 口shbyii简称E．ashbyil)和棉病阿舒囊霉(Ashbya gossypii简称A．gossypii)，它们均为好氧的丝状真 菌．发酵液粘度很大，呈非牛顿特性，通风供氧困 难．而充足的溶氧是发酵高产核黄索的关键之一． 作者以E．ashb：i为试验茵，采用逐步补料的方法， 通过控制菌体质量浓度来缓解通风供氧不足造成 的困难，进一步提高核黄索的产量，降低生产成本． 收稿日期 1999—12—13；恬订日期：20OO一03—16． 作者简介；陆文清(1968年2月生)，男．江苏太仓人．工学博士 口扫^A 维普资讯 http://www.cqvip.com 第3期 陆文清等：核黄素产生菌的补料发酵 241 1 材料与方法 1．1 试验菌种 阿氏假囊酵母 E．ashby／i 无锡轻工大学生物 工程学院诱变筛选获得． 1．2 分批发酵培养液组成 豆油30 mI√L．葡萄糖30 g／L，骨胶30 g／L．玉 米浆20 mL／L．NaC1 3 g／L．KHzPO4 3 g／L．MgSO4。 7H2O 0．2g／L，pH 7．0(灭菌前)． 1．3 实验设备 显微镜 上海江南仪器厂产品；NDJ1型旋转式 粘度计 上海天平厂产品；酸度计 上海天达仪器有 限公司产品；721型分光光度计 上海第三分析仪器 厂产品；往复式摇瓶机 锡山市生化器械厂产品；超 净工作台 苏州净化设备厂产品；20升全自动发酵 罐 瑞士 Infer公司产品；冷冻高速离心机 日本 H；． tachi公司产品；高压灭菌锅 锡山市第二医疗器械 厂产品；恒温干燥箱 上海医疗器械厂产品． 1 4 测定方法 ’ 核黄素含量测定 分光光度法-3 ；糖古置测定 费林定糖法【 ；菌体浓度：干重法【 2 结果与讨论 2．1 分批摇瓶发酵试验 摇瓶培养E．ash6 (500 mL三角瓶装液 50 mL．3O℃{中程84 mm．频率 100捩／分 )．测定不 同时间的菌体量、葡萄糖质量浓度、核黄素质量浓 度和粘度．结果如图 1～图3所示： 田 1 pH位和曹体量随时间的变化 F ．1 The曲 n at pII blomal v|．time 发酵160 h以后残糖降为3．2 g／L，核黄素不再 增加．最高质量浓度为6．4 g／L左右．发酵液的最大 粘度为0．762 Pa．s_ 显徽镜检测发现．菌体形态与核黄素的合成速 度及发酵液的粘度之间存在着密切的联系．根据摇 I I — — — — J 瓶发酵和显微镜观测获得的结果，可把 E．ashbyii 的发酵过程粗略地分为四个阶段-e J． 第一阶段(0～24 h)菌丝逐渐增多，菌丝体细 长．相互缠绕在一起，美蓝染色很深．发酵液的颜色 由棕色变成乳白色．粘度迅速上升．但还没有核黄 素产生． 第二阶段(24-48 h)菌体生长旺盛．菌丝体逐 渐膨大．内容物明显增多．并有少量特别黄亮的粗 短苗丝体出现，美蓝染色极浅．发酵液由白色转为 黄色，有少量核黄素产生．发薜藏的粘度继续上升． 发酵时闻／h 田2 tll萄■质量浓度和j圭黄素质量浓度融时间的变化 T ．2 The Chall~ at~ma~ntra~Ima 0f glu anti rilmllavIn v|．time 发酵时问／h 田3 发酵液粘度随时间的变化 Pig．3 The e．1taage 0f咄 竹 v|·time 第三阶段(48～96 h)核黄素大量合成．膨大菌 丝体缓慢收缩，美蓝染色逐渐加深．有针状的核黄 索晶体出现 发酵液的粘度逐渐升到最大值． 第四阶段(96～160 h)菌体开始解体自溶．发 酵液的粘度迅速下降．断菌丝和游离孢子逐渐增 多。核黄素的合成逐渐趋于停止 核黄素的生物合成需要消耗大量ATP，E．ash． 是高耗氧的丝状酵母．但是在核黄素合成的高 峰期(即发酵的第三阶段)．溶液的粘度很大．给发 酵液的通风供氧造成了很大围难．在生产实践中， 缓解液态发酵供氧不足的方法主要有三种I8】：1)调 整搅拌转速和通风置，设法提高体积传氧系数 K ． ¨盯 ：宝 ¨ ” 叭0 一 一＼瑙 糖蕾稍 0／I一／瑙甓●蜒挚翟 维普资讯 http://www.cqvip.com 242 无 锡 轻 I 大 学 学 报 第19卷 2)加大罐压．3)通入纯氧和富氧气体．体积传氧系 数受设备能力限制，一般不易改变．加大罐压虽然 可 提高发酵液的平衡溶氧浓度，但同时也加大了 CO2在水中的溶解度 (在水中 CO：的溶解度是 02 的30倍左右)．HCO3-浓度过高会对某些苗体产生 毒害作用 经试验发现，在 20 I 小罐培养 E．ash— byii，罐压维持在 0．1 MP丑(表压)，菌体生长很慢 通风培养60 h，菌体质量浓度仅为4．6 g／L．而且基 本不产核黄素．采用通入纯氧和富氧气体的方法不 仅成本高，而且操作繁琐．如果菌体高耗氧的时间 比较短，设备的供氧能力也已经达到极限而尚不能 满足供氧要求时，采用富氧方法改善供氧是比较合 理的．但E．oshbyli在发酵合成核黄素的过程中高 耗氧的时间长达 60 h以上，采用富氧气体的方法显 然是不合适的．既然供氧一方存在困难，那么可从 需氧一方进行考虑，设法降低发酵过程中菌体的需 氧量来缓解供氧的困难． 2．2 pH值对菌体生长的影响 配制不同 pH值的 E．ashbyii培养液(不含豆 油，其余组份同发酵液)．500 mI 三角瓶装液70 mI 接种 1 mI ，30℃摇瓶培养24 h(冲程 84 mm 频率 80次／分)．结果如图4所示： 圉 4 DH值对菌体生长的影响 F ．4 Effect orpH OR growth orE．4曲6 oH值对苗体生长有显著影响，当pH值低于 5．0时菌体生长几乎停止．pH值大于 6．2以后菌体 生长明显．可通过控制 oH值的变化来控制菌体过 度增殖，降低溶液粘度和菌体耗氧量，从而缓解通 风供氧的困难． 2．3 摇瓶补料发酵试验 配制组分浓度为分批培养液 4倍的溶液 500 mI (pH值不变) 平均分成两部分．其中一部份用无 菌水稀释至2 I ．然后分装在500 mL的三角瓶中， 装液量为 45mL．灭菌、冷却、接种．30℃摇瓶培养 (i中程84mm，频率 100次／分)．另一部分灭菌后留 作补料用．在第48 h补料 3 mL．在第 72 h和 96 h 各补料2mL，发酵200 h．结果如图5～7所示．菌体 量最大值为28．5 g／I ，比原来下降了18．6％．在核 黄素合成的高峰期．溶液的粘度为0．628 Pa．s，比原 来有所下降，体积传氧系数有所提高．虽然苗体量 下降了，但菌体膨大期延长了．发酵至 192 h，核黄 素的产量达 8．14 g／L．比原来提高了25％左右． 0 趟 嵌 捌 餐 垃 蛐 发酵时间／h 围5 值和菌体量随时间的变化 Fig．5 The Clumge 0f pH and bjo vs．time 0 趟 嵌 埘 餐 龋 牲 围6 葡萄糖和桉黄素质量浓度随时间的变化 FI窖．6 The change or concen~ n 0f saecharide and riboflavin邶 ．time 发 群 时同 ／h 围 7 发酵液粘度随时阃的变化 Fig．7 The ch|Ⅱ||0f viscosity v墨．time 2，4 小罐补料发酵试验 配制浓度为分批发酵培养液 1／2的 E．ashbyil 培养液 12 I ，灭菌、冷却，接种在20 I 小型发酵罐 中进行搅拌通气培养．发酵液的通气量为 0．014～ 0．02 m ／(s，m )，搅拌转速为450~550 r／rain．分别 在40 h、60 h和 80 h补料 3次．补料液的浓度是分 一 )／ 辨盐挝 维普资讯 http://www.cqvip.com 第3靳 陆文清等：核黄素产生菌的补料发酵 243 批培养液的4倍．结果如图8和图9所示 趔 发酵时阃／h 圉8 pH值和苗体量随时间的变化 H2-8 The change ofpH mad biom~ v5-time 发酵 140 h．核黄素的质量浓度达 56譬／L．发酵 液的最高粘度为0．620 Pa-sl此时溶液的溶氧质量 分数为0．42 mg／kg．若采用不补料发酵．培养液浓 度与摇瓶分批培养液相等，即使把搅拌转速调到 600 r／min，发酵液的通气量调至0．024 m3／(s·m3) 通风供氧仍显得困难，在最高粘度时溶液的溶氧仅 为0．23 mg／kg．而在此条件下测得N~2SO3溶液的 体积传氧系数 K 高达 1 000／h左右．虽然大罐氧 的利用率比小罐高，但是采用不补料发酵高浓度培 参考文献 图’ 葡萄糖和接黄素质量浓疰随时间的变化 rig-9 The Change of colaeenlt~／ions or aaccharide mad riboflavln vs．time 养 E．ashbyii生产核黄素对于实际使用的发酵设备 来说仍存在着较大的困难． 3 结 论 采用低浓度培养液培养 E．ashbyii，然后根据 培养液pH值的变化进行多次适量补料．不仅可以 控制苗体的过度增殖，缓解供氧困难，而且还有利 于提高核黄素的产量．对实际生产具有指导意义． [1】无镯轻工业学院等编．工业发酵(下册)[M】．北京：财政经济出版社．1960． [2]蔡辉益编．家禽营养需要[M]．北京：中国农业出版杜．1994 [3]蔡武城．裒厚积主编．生物物质常用分析方法[M]．北京：科学出版杜，1982 [4]张龙翔 生化试验方法与技术[M】北京：高等教育出版社．1981． [5]余俊红．阿氏假囊酵母发酵核黄索工艺条件的研究[D]．无锝：无镉轻工大学．1996 [6】俞倥棠．唐孝宣编．生物工艺学(下册)[M]．上海：华东化工学院出版杜．1992． (青任编辑：朱 明) 维普资讯 http://www.cqvip.com