中国根霉12菌株抗生物质的分离提纯及分子量测定

食品与发酵工业 Food and Fermentation Industries Vo1．24 No·2 中国根霉 12菌株抗生物质的分离提纯及分子量测定 杜连祥 郝利民 J 路福平 王 敏 一 — — — — ／ (天津轻工业学院．天津．300222) 摘 要 中国㈣ 2( 船 菌株产生 星 l 先经过饱自度 为 70 硫酸铵盐析处理，再经半透膜透析去离子后，通过 Sephadex--G75凝胺柱层析·浓绾 含有活性蛆舟 的层折冼脱液．得到抗生物质粗制品。经 HPLC和薄板层析法证明为一纯组 分。而且用Sephadex--G75凝胺柱层析法测得抗生物质的分子量为 48000道尔顿 关键调 中旦兰三 苎兰塑 生苎芝生 竺三芝 — _ -。 ■● ⋯ 一 -— —— — ～ 在食品、发酵工业中，由芽孢菌污染导致 食品腐败变质及发酵异常造成的损失是惊人 的。这是由于芽孢菌属的细菌在繁殖过程中 向细胞外分泌淀粉酶和蛋白酶，容易引起食 品腐败。因芽孢对恶劣环境的耐受力较强，通 过常规灭菌方法难以除去，是发酵工业常见 污染菌。因此开发新型生物防腐剂杀灭芽孢 菌，是食品、发酵工业中亟待解决的问题。 R．chinesis 12菌株产生的抗生物质对 芽孢属细菌，特别是枯草芽孢杆菌和蜡样芽 孢杆菌有强烈的抑制作用[1]。该菌株分离自 我国传统的酒药中已被证明安全无毒。因此 有望开发为新型生物防腐剂。 1 材料与方法 1．1 材料 1．1．1 菌种 中国根霉 12(Rhizopus chi~esis 12)，枯 草 芽 孢 杆 菌 IFO3335(Bacillus subtillis IF03335)。 1．1．2 培养基 种 子 培 养 基 (g／l~0m1)：1O 豆 汁 100ml、葡萄糖 3、酵母膏 2、pH 自然；发酵培 养基 (g／10Om1)：酶解 4h的豆饼粉酶解液 80ml、玉米水解液 20ml、葡萄糖2、pH自然。 1．2 方法 1．2．1 发酵滤液的制备 缓 也 28℃振荡(150r／min)培养 16～18h。按 l 接 种量将种子液接入 200ml发酵培养基中，28 ～ 30℃振荡(1 6Or／min)培养 48h。将发酵液 离心收集上清液：再经布氏漏斗过滤得澄清 液备用。 1．2．2 硫酸铵盐析 用 饱 和 度 分 别 为 3O 、40 、50 、 60 、7O {8O 的硫酸铵盐析沉淀发酵液中 的抗生物质，离心收集沉淀物。将沉淀物分别 用 1Oral重蒸水溶解。测定盐析上清液和沉 淀物水溶液中的活性。 l_2．3 盐析沉淀枷的透析 将饱和度为 7O 硫酸铵盐析沉淀物的 水溶液，分别用 MW3500和 MW3600两种 透析袋于重蒸水中透析 24h。测定透析袋内 液中抗生物质的活性。 1．2．4 硅胶层析 取硅胶 G和水 (1 t 5)混合研磨后制成 硅胶板，风干后于 105℃活化 l_5h。取 50．~1 透析袋内液点样后，于展开剂 (V／V)(正丁 醇 t冰醋酸 ：水一4：1 t 5)的层析缸中平衡 lOmin，之后于展开剂中展开 待溶剂前沿到 达板长的4／5即可结束层析。取出胶板风干， 用碘蒸气薰蒸薄板使其显迹，观察层析斑点 个数并计算各斑点的Rf值， 1．2．5 凝胶柱 的分离 将 8．OgSephadex—G75凝胶用 150ml 将 lml R．c Mes／s 12菌椿的孢子悬液 、重蒸水溶胀 24h。装入 1．8cm(内径)×40cm (10s个／m1)接种于 30m1种早培养基中， (柱高)的分离柱中，用柱床体积量的2～3倍 维普资讯 http://www.cqvip.com 第24卷 第 2期 杜连祥等：中国根霉 12菌株抗生物质的分离提纯及分于量测定 33 重馏水平衡。取 5ml透析袋内液注入柱中， 同时从柱底放出 5ml平衡水，使样品完全进 入凝胶柱中。加 100ml重蒸水洗脱，洗脱液 流速为 lml／2~3mln，每管接收洗脱液 2m1， 共50管。以Mc一756紫外可见分光光度计 在 280rim处测定各管收集液的吸光度，绘制 洗脱曲线。同时渊定各管收集液活性 ，将有活 性的收集液于真空干燥器中干燥得粗品。 1．2．6 紫外吸收谱 圜 将具有生物活性的洗脱液 3ml，用 MC 一 756型紫外可见光分光光度计在 220～ 400nm范围内扫描，将其紫外吸收谱图与标 准蛋白质紫外吸收谱图对照。 1．2．7 红外吸 收谱图 将干燥的粗品，采用 KBr压片法n]，在 定所含物质的特征性基团。 l-2．8 Sephadex—G75凝 胶层析 测定抗生 物质的分子量 分别称取 2rag分子量为 45D00的 卵清蛋白和分子量为 18400的标准 p一乳球 蛋白混合，用 lml重蒸水溶解 按 1．2．5所 示方法上柱、洗脱并绘制洗脱曲线，根据各物 质的洗脱面积计算 R．chinesis 12菌株产生 的抗生物质的分子量。 2 结果与讨论 2．1 发酵液的硫酸铵盐析 以不同饱和度的(NH )。SO 盐析沉淀 发酵滤液中的抗生物质，测定盐析上清液及 沉淀物的抑菌活性(以抑菌圈直径示，下 IR一435型红外光谱仪上扫描，分析谱图确 同)结果如表l 表 1 不同饱和度(N )，SO．盐析结果 (NH‘)2s0。饱和度( ) 30 1 40 1 50 f 60}70 l 80 上清蘸抑菌圈直径(mm) 2l_o l l9．o I 16．0 l 12．o I 8．5{8．5 盐析沉淀橱抑菌圈直经(ram) 8．5『12．5 f 23．o』31．o l 35．o l 35．o 由表 l可知，硫酸铵饱和度≥70 时，发 蔓开爿t精 ⋯ ⋯ 一 一 一 l的盐析上清液中残存的抑菌活性物质很 rL乎完全被硫酸铵沉淀下来。为此，选择 !铵盐析法提取发酵液中的抗生物质，且 !铵的饱和度确定为70 。 盐析沉淀物的透析 I ● 0 将饱和度为 7O 的硫酸铵盐析沉淀物 溶液Sin!，按 1．2．3所示方法透析后，测 ● -l |析袋内液的抑菌活性的结果表明，其抑 一直 f性不变。这说明R．chinesis 12菌株产生 子量较大的蛋白质。这一结果与对照株少孢 根霉 IFO8831菌株产生的抗生物质的分子 量不同啪。 2．3 硅胶层析 按 1．2．4所示方法，将 50tA透析袋内液 经硅胶层析，结果如图 1。 ． ， f 从图 1可知，R．chlnesis 12菌株产生的 抗生物质经盐析沉淀和透析除盐后的物质在 硅胶板上呈现两个斑点。说孵该盐析沉淀物 中有两个组分，组分 1的分子量大于组分 2。 已知溶剂前沿移动距离为 12．70cm，组分 l 和组分 2的 移动距离分别为 3．00和 6． i30cm，所以组分 1的Rf为0．236，组分 2的 i } 维普资讯 http://www.cqvip.com 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 24卷 第 2期 杜连祥等：中国根霉 12菌株抗生物质的分离提纯及分子量测定 35 图 抗菌物质的红外光谱 根据蛋白质特征基团的红外吸收谱 v的吸收。由此可进一步判定R．chinesis 12 图 。解析图4抗生物质的红外吸收光谱图： 菌株产生的抗生物质是蛋白质 3250cm 峰为酰胺 N—H和O—H的伸缩振 2．7 Sephadex—G75凝胶层析法测定抗生 动；2950cm 峰为 C—H伸缩振动；1650～ 物质分子量[6] 1660cm 峰为酰胺 I的C—O伸缩振动， 按1．2．8所示方法，将标准卵清蛋白和B 1520cm 是酰胺 l的 C—N伸缩振动；1235 一乳球蛋 白混合样品经 Sephadex—G75凝 ~ 1240cm 峰为酰胺 Ⅲ的c—N伸缩振动和 胶层析 ，结果如图 5所示。 N—H面内变形振动}620cm 峰为酰胺 n『和 图 5 标准蛋白质样品洗脱 曲线 从图 5可知，标准蛋白的混合样品经 标准蛋白混合样品洗脱曲线可知，卵清蛋白 Sephadex--G75凝胶分离后呈两个洗脱峰。 的最大紫外吸收出现在第 12管，标准 B一乳 根据凝胶层析原理，先出峰的组分是分子量 球蛋白的最大紫外吸收出现在第3o管。所以 为 45000道尔顿的卵清蛋白，后出峰的组分 标准卵清蛋白的洗脱体积 Ve =24．0ml，标 是分子量为18400道尔顿的p一乳球蛋白 从 ’ 准B一乳球蛋白的洗脱体积Ve产 60．0ml。 f - ‘ ●^。#5 墨螭■ 维普资讯 http://www.cqvip.com 食品与发酵工业 Food and Fermentation Industries Vo1．24 No．2 从图 2可知，R．chinesis 12菌株产生的 抗 生 物 质 经 盐 析、透 析 后 的 样 品，在 Sephadex—G75凝胶层析的洗脱曲线上，抑 菌活性物质的最大紫外吸收出现在第 1l管， 所以其抗生物质的洗脱体积 Ve’一22．0ml。 通过 Andrews口 经验公式，logM—Kl— K ×Ve可列出下列方程组： logM 1一 K1一 K2×Vel logM 2一 Kl— K2×Ve2 M-：卵清蛋白分子量 45000 M：：8一乳球蛋白分子量 18400 Ve ：卵清蛋白洗脱体积 24．0ml Ve ：口一乳球蛋白洗脱体积 60．0ml 解方程得：K =4．925，K =0．388 代入方程：logM’一Kl—K2×Ve’ Ve’：抗生物质的洗脱体积 22．0ml 解方程：M’=48000 在此可以定论，R．chinesis 12菌株产生 的抗生物质是分子量为48000道尔顿的碱性 蛋白质。 有关该蛋白质的一级结构的氨基酸组成 及序列将进一步深入研究和报道。 参 考 文 献 1 王昌棘，路檑平，鲁梅芳 工业微生物，1993， 23(5)：l0～ l5 2 朱明光编．仪器分析．北京：高等教育 出版 社 +I993 3 Sin— ya Kobayasi+ Naoto Okazaki。 and Takuya Koseki，Biosci．Biotech． Biochem．，199 2+ 56(1)，94～ 98 4 彭师奇著．多肽药物化学．北 京；科学 出版 社 ，l993 5 Andrews．P．Estimation of Molecular Size and Molecular Weights of Biological Compounds by Gel Fihration． Methods of Biochemical Analysis． 1970，Voll8，l ，Glick，D．(Ed)．New York and London 6 张龙翔，张庭芳，李令嫒 主编．生化实验方 法和技术．北京 ：人民教育出版社，1982 The Isolation and M olecular W eight Determination of Antibiotic Substance from Rhizopus chinesis 1 2 Du Lianxiang Hao Limin Lu Fuping W ang M in (Applied Microbiology Research Section，Tianjin University of Light Industry，Tianjin，300222) ABSTRACT The antibiotic substance produced from Rhizopus chinesis 12 exist in fermentation solution．The solution was treated by salting--out(70 saturated ammonium sulfate)，then deionized by dialysis，filtrated by sephadex—G75 gel，condensed the active substance．At last the antibiotic substance preparation was obtained．The analysis result of HPLC and TLC proved the antibiotic preparation is pure substance．The molecular weight of the antibiotic substance is 48000 Dalton， tested by sephadex — G75 gel column chromatography． Key word Rhizopus chines~，antibiotic substance，isolation and purification，molecular wehight． ‘ _． ： { 维普资讯 http://www.cqvip.com