大豆蛋白去酰胺改性的研究

⋯ 业 ⋯ ⋯ 大豆蛋白去酰胺改性的研究 吴 向明 (浙江工业大学轻工系 ，杭州 ，310014) L／雕鸿荪 沈蓓英 (无锡轻工大学食品学院．无锡 ，214036) |s f孚， 摘 要 本文研究了磷酸盐对大豆分离蛋白(SPI)进行去酰胺改性，在既保持大豆蛋白的大 分子构象t叉提高大豆分离蛋白功能性质的条件下．得出去酰胺改性的最佳工艺条件为：磷 酸盐浓度为 0．262M，pH8．14．在 102c下反应 3h 测定了改性前后大豆分离蛋 白水溶性．乳 化能力 ，发泡能力，持水性 及牯度等的变化。结果表明改性后大豆蛋 白的等 电点随去酰胺程 度的增加 ，向低 pH值移动t大豆蛋白的功能性质均有不同程度的提高和改善。并用红外光谱 (FT—IR)和差示扫描量热法(DSC)对改性前后大豆分离蛋白结构的变化进行 了研究。 关键词 ’塑 ，工基，营养 众所周知，大豆蛋白已经成为人类食品 还是品 上，其水平相对较低，这使得我国人 J 的重要蛋白质来源，但在食品加工中，大豆蛋 白的功能性质(如溶解性，发泡性 ，持永性)不 如鸡蛋白等动物性蛋白质 动物来源的蛋白 质如牛奶 ，鸡蛋白和肉蛋白等，在传统食品和 组合食品中应用较多。根据生理功能分，大豆 蛋白质可分为贮藏蛋 白和生物活性蛋 白两 类。贮藏蛋白为主体，约占总蛋白的 70 左 右 (如 11S球蛋白，7s球蛋 白等)，它与大豆 的加工贮藏关系密切 在传统工艺中，从豆粕 中获得的大豆分离蛋白(SPI)主要是大豆的 贮藏蛋白。在它们的自然状态，贮藏蛋白只有 较有限的功能性范围。]。然而，这些功能性质 可以用食品工业可以接受的改性 、如热、 酸、碱变性 ，酶法改性．分提和机械加工(挤压 等)得到提高和扩展 在美 国，大豆蛋白制品 的基本品种只有 5～6种，但通过功能性和配 方特点配合产生的产品却有 50～60种。目 前，我国大豆蛋白制品的发展，无论是数量上 民的人均蛋白质消费量远低于世界先进水 平 因此．利用化学改性提高大豆蛋白质的食 用价值和应用领域，无疑具有十分重要的意 义 。 人们对化学改性研究较多的是一NH：、一 OH 及一COOH 的改性。在众多的化学改性方 法中、去酰胺改性尤其引人注 目。 。因为油料 蛋白中含有丰富的天冬酰胺(ASh)和谷氨酰 胺(GLn)残基。如每 100g蛋白中，大豆蛋白 含 G1，n14．8g、ASnl 3． 2g。本 研 究 采 用 NaH PO 和 Na。HPO 对大豆蛋 白进行去酰 胺改性。 产 。 材 料 与 方 法 一 、 材 料 脱脂大豆粉：黑龙江佳木斯三江公 司生 维普资讯 http://www.cqvip.com 《食品与发酵工业》 Food and Fermelltation Industries NaH2PO‘(A．R)和 Na2HPO4(A．R)： 按摩尔浓度和 pH配制。 ZD-2型电动电位滴定计 ：上海第二分析 仪器厂。 Virtis Consol冷冻干燥仪：美国。 SD一04喷雾干燥机：英国 Armfield。 DSC一7差示扫描量热计：美国PE公司。 日立 835氨基酸自动分析仪：日本。 GXD一201型蛋白质分析仪 ：北京环境保 护仪器厂 。 NICOLET 1 70SX FTIR：美 国。 二、方 法 1．SPI制取 脱脂大豆粉一粉碎至 40～60目一 与水 1 t 10(W／lv)混合浸提(pH8．5～9．o)一搅 拌 15min~3000r／min下离心 10min一取上 清液调 pH至 4．5一静止 30rain一离心水洗 二次一打浆回凋至 pH 7．0一喷雾干燥一成 品。 2．大豆蛋 白的 改性 将大豆分离蛋白以 3 (W／V)浓度溶解 在 0．1～0．3M ，pH7～9的磷酸盐缓冲菠申， 在 9o～110℃下连续搅拌 3h，反应过程中，温 度用温度控制仪控制在某一值。反应结束后， 按常法通过离心沉淀洗涤，中和回调至 pH 7．0，冷冻干燥。考虑到最终产品的应用性和 蛋白质的许多功能性质以溶解度为前提，本 研究以蛋白质的溶解度为响应值，采用响应 曲 面 分 析 法 RSM (Response Surface Methodology)研究三个变 量—— 磷 酸盐浓 度(0．1．0．2，0．3M)、温度(90，100，110℃) 和 pH值(7，8，9) 利用 SYSTAT软件进行 回归和方差分析。改性蛋 白质用 DASPI表 示 。 3．酰胺键水解程度的测定 采用 Conway法0 测定 样品 中的含 N 量。去酰胺程度 DD(Degree of Deamidation) 表示为： 。。c％ {墓I； }； × oo％ 8 4．肽键水解程度的测定 甲醛滴定法“ 测定水解上清液中游离氨 基酸的含量。 水解程度 DH(％)一 丽 豢器 ⋯。％ 样品完全去酰胺增加的游离氨基氨 ⋯ 5．溶解度测定 双缩脲 。 6．持水性的测定 参见文献[6，7]。 7．乳化性和乳化稳定性的测定 参见文献[8] 8．起 泡性 和泡沫稳 定性 的剐定 参见文献[9，Io3。 9．有效赖氨酸的测定 DBL法，参见文献[11] 1(】_粘度测定 采用 NDJ一1旋转粘度计。 1l_残留磷酸盐测定 参见文献E12]。 12．红外光谱分析 取样品 3～5mg放八玛瑙研钵 中，添加 100～200mg光谱纯 KBr，在红外 灯下研磨 均匀，装入压片模具 中抽气加压，压力约为 600Kg．／cm ，保持 3～5rain，得薄片经 NICO— LET I?0SX FTIR红外光谱仪分析测定。 13．蛋白质变性热力学的DSC分析法 采 用 Perkin Elmer公 司的 Delta Series DS?型差示扫描量热仪测定蛋白质在热变化 过程 中的变性温度 Td和变性焙差△H 样 品过 80目筛，称样 10 SPI溶解于 pH7．0 的蒸馏水中，升温速度为 10~／rain，温度扫 描范围为 20～1 50C。本论文所示数据，都是 3次测定结果的平均值。 结 果 与 讨 论 一 、 磷酸盐去酰胺改性的可能性机理 一 般认为蛋白质中的去酰胺反应通过羰 基中的 0 和 H 直接发生质子化作用，导致 维普资讯 http://www.cqvip.com 《食品与发酵工业》 Food and Fermentation Industries NH。的释放。我们在参考了前人对合成多 肽[1 3．t4 和猪的促肾上腺 ：等分子构象研 究的基础上，推测磷酸盐改性大豆蛋白的去 酰胺反应机理如下： M c c II — H — ii 一 0 ／ ＼H 。 0 ＼ @ O 0 -NI4-CH C-~ ⋯ @一 - I 一曲 i 一 _@ 、@ 。 ⋯ c 2 i c 2 一。’ 0 u 一 @ ． ． O ． R ． O 一 ⑤ @’“ ： II； ． ．量@ 图 1 磷酸盐 SPI去酰胺改性的机理 反应 l是肽键中的 N对 p或 酰胺基 中的羰基 c进行亲核进攻．形成了环状 中问 体 (Ⅱ)和 NH 。从前人研究的结果可以看 出，天冬酰胺(ASn)较容易发生这步反应。反 应 2是羰基 中的O和 H 直接发生质子化作 用，或者是 OH 对羰基 c进行亲核进攻，从 而导致 了 NH：的释放 ，没有形 成环状 中间 体。这一步可能是谷氨酰胺去酰化的最佳途 径。环状中间体(n)再被 H 或 OH催化，产 生 一羰基联接 的多肽(Ⅳ)或 羧基联接的 多肽(-q) 一羧基肽键在不同的 pH和温度 下，易被 H 或 OH一直接水解。 二、回归的正交设计 为了寻求最佳工艺及建立生产过程 中的 数学模型，把试验设计和回归分析结合起来， 根据中心旋转设计CCRD按排各变量。 经回归分析得如下方程： Y一 85．033+ 2．3Xl十 1．45X2+ 1．85X 一 L 917 Xl。一 4．267 X2 一 8．21 7 X3。+ 0．45XlX2+ 0．1XlX3-- 0．95X。X3 方差分析显示，F值大于 F一 (9，5)，所 以回归方程显著。 令杀_0，袅 差一。 求解三元一次偏导方程组，得最佳工艺条件 为：磷 酸 盐浓 度 X 一0．262M；温 度 X2— 102~C；pH值 X 一8．14，在此条件下 ．大豆蛋 白去酰胺改性程度为 28．6 ，肽键水解程度 为 2．8 大豆蛋 白的溶解度 为 86 (pH 7．0) 9 维普资讯 http://www.cqvip.com 《食品与发酵工业》 Food and Fermentation Industries 1996 No．5 表 1 优化实验的设计及响应值 实验号 浓度(X_) 温度(x2) pH(X3) 响应值( ) DD(％) DH( ) 1 1(O．1) 1 0 76．5 18．5 2．0 2 】 0 1 70．4 】7．】 2．3 3 — 1 0(100) 1 73．1 01．2 5 0 4 l l 0(8) 78．3 24．6 4．6 5 0(0．2) 1 1 67．8 4．8 1．2 6 0 1(9O) l 74．2 20．9 2．3 7 0 1 — 1 72 8 17．8 4．6 8 0 1 1(9) 75．4 18．1 4．5 9 1(0．3) 一 1 0 78．5 25．5 3．5 10 1 0 l(7) 76．5 21．6 2．3 11 】 0 l 79．6 26．7 3．7 1 2 1 3 14 1 5 1(1l0) 0 0 0 82．1 85．3 84．7 85．1 27． 28． 27． 28． 2 方 差 分 析 方差来源 平方和 自由度 均方差 F值 显著性 回 归 393．251 9 43．695 29．81 9 剩 余 7．327 5 1．465 总 计 400．578 1‘ *F0 ． 05(9．5)一 4．77， Fo c】<9．5)一 10．r6 裹 2 回归分析和方差分析数据 系数 标准差 t值 显著性 aO 85．033 0．699 l21．669 a L 2．300 0．428 5．374 a2 1．450 0．428 3．388 a3 1．850 0．428 4．323 a Ll ——1．917 0．630 ——3．042 a22 ——4．267 0．63O 6．773 a33 — 8．217 0．630 1 3．043 a L2 0．450 0．605 0．743 a 0．1O0 0．605 0．1 65 a23 — 0．950 0．605 1．570 显著性：**(△<0．01)，*(。