发酵工业中的噬菌体防治

一 ／ 《食品 与发酵ll_J ’ Food and Fermentation Industries 丁s 1 996 NO． 6 发酵工业中的噬菌体防治 岳 海 峰 (河南师范大学生物系．河南新乡．453002) 摘 要 噬菌体的污染常导致发酵生产 的失败。本文简要地概述 了嚆苗体研究 及其在发酵工业中的防治。 关键词 噬菌体 ，发酵，污染 ，防治 — ———‘一 ———～ ’ ’ 一 噬菌体属于非细胞型微生物．是侵染细 菌、放线菌等细胞型微生物的病毒。它们个 体微小．通常仪能在 电子显微镜下观察到 ；结 构简单 ，多数噬菌体仅由蛋白质和核酸两种 成分组成．蛋白质构成的衣壳包裹着核酸。在 自然界单独存在的噬菌体不现出生命现 象．但具有潜在的生命力。噬菌体从吸附至 宿主细胞上的一瞬问．就开始了自己的生命 过程。根据噬菌体与宿主的关系．可将其分 为烈性噬菌体与温和噬菌体。烈性噬菌体通 过吸附、侵入、生物台成、装配与释放等步 骤使宿主细胞裂解死亡：而温和噬菌体侵染 宿主后 坝 将其核酸整合在宿主基因组上 t并 以原噬菌体状态存在，宿主则转为溶原性菌 株；但也有机率较少的温和噬菌体类似于烈 性噬菌体．引起宿主细胞的裂解死亡。温和 噬菌体对溶缘状态和裂解途径 的选择，取决 于感染细胞内的一些宿主基因产物和噬菌体 基因产物活性之1司的平衡。理化诱导因素可 以明显提高温和噬菌体对裂解途径的选择。 多宿主的同 噬菌体对不同的宿主可表现为 烈性或温和噬菌体 。噬茁体分 1]个科和 1 个群 ]。1 988年前 曾报道的噬菌体总数超过 I800种[ ．现在每年大约有 150种噬菌体在 世界各地被分离出来 不同噬菌体的生物学特性各异 通常发 58 酵工业中出现的噬菌体的抗热性比从 自然界 分离出的高【4 。但总体上来说噬菌体的抗热 性较差·在 100"C的湿热条件下很容易失活。 温和噬菌体的溶原化现象给杀灭噬菌体带来 了一定的困难 最明显的例子是芽孢杆菌的 温和噬菌体。由于它们可以原噬菌体的状态 整合于宿主的核酸上t随宿主形成芽孢而得 以保护，从而使其抵抗恶劣环境的能力太为 增强 。 噬菌体对 pH 的适应范围与宿主类 似， 多数噬菌体在中性环境中稳定 。也有少数噬 菌体在 pH3．5 ]、pill4．O嘲时仍能保持活 性。有些噬菌体存活的pH范围较窄．如噬菌 体 BS31(pH4~9)口]；而有的可在较大的pH 范围内存活，如噬菌体Ps (pH4～14)。噬菌 体往往在其保持活性的最低 pH 以下租最高 pH以上失话陡然增强 在工业发酵时的pH 一 般不构成对噬菌体的威胁。 噬菌体对宿主细胞的吸附具有高度的特 异性 。这一特异性是由宿主细胞的表面构造 和噬菌体的构造所决定的。遗传特性的改变 可使噬菌体与宿主间的吸附能力发生改变 ； 另外，存在于革兰氏阴性菌细胞中的质粒常 会改变细胞膜的组成和特性．从而导致噬菌 体与宿主的吸附特性的改变-B] 宿主失去对 特定噬菌体的吸附能力并不一定意味着它 已 维普资讯 http://www.cqvip.com 《食品与发酵工业≥ Food and Fermentation Industrie~ 丧失了合成噬菌体吸附的受体基因。这是因 为受体或许被细胞外层的其它成分所掩盖； 也许受体是宿主在特定条件下才产生的非必 需成分 。 我们已知微生物的某些属和种的不同菌 株都是重要的工业发酵用菌 例如，枯草芽 孢杆菌的不同菌株可分别用来生产 a淀粉 酶 (ACCC11060)． 中 性 蛋 白 酶 (ACCC11052)、肌 苷 (AS1．795)、脂 酶 (IFF1．1 98)等” 。由于这些生产菌株的亲 缘关系极近，故它们很易有共同的嗟菌体。噬 菌体的宿主范围与宿主的分类界限相比可宽 可窄，跨多属的放线菌嗟菌体 、跨多种的 细菌噬菌体 均有报道 在发酵工业中所遇 到的噬菌体宿主范围越宽则对发酵的威胁越 大。噬菌体的宿主范围决定了其对发酵工业 的影响范围。 噬菌体侵人宿主细胞内后，潜伏期从十 几分钟到数小时；裂解量从几个到万个以上． 这与噬菌体、宿主及培养条件等有关。通常 在良好的培养条件下．噬菌体的潜伏期较短， 裂解量大：否则．潜伏期延长、裂解量减 少 。 噬菌体作为一类可被利用的生物资源已 为人们所重视。然而，在自然状态下，噬菌 体也给人类带来危害。例如：在多抗霉索的 生产过程中，曾困噬菌体的污染致使倒罐率 达 50 ，发酵单 位 由 3082r／ml下降至 1320r／ml而被迫停产 一。给企业带来巨大的 经济损失。 ]929年在丙酮丁醇发酵工业 化生产的 初期就发现了可能是由噬菌体引起的异常发 酵。直到 1951年Kinoshita等才证实这种异 常发酵是由嗟菌体所引起的 。许多发酵工 厂在开始生产的1～3年内就可观察到由噬 菌体污染所导致的异常发酵。菌体污染发酵 后的情况因发酵工业的种类、噬菌体的特性 及荇染时间、污染程度和发酵时的物理化学 等因素不同而异 一些生产菌株感染噬菌体 后．菌体形态则会发生明显的变化，菌体残 片随时间的延续而增加。通常噬菌体污染发 酵后有以下几种情况：(1)污染程度轻或在 发酵周期末出现污染常使发酵过程减慢、pH 异常、发酵液稀薄、发酵产率下降；(2)污 染发生在对数生长期、且污染程度重．就会 造成生产菌大量裂解死亡，并伴有泡沫产生， 使发酵停止；(3)在芽孢杆菌的异常发酵中， 有时会有芽孢出现早、发展快、生产周期缩 短，产率低，但没有典型的溶菌现象 ”J 噬菌体污染发酵除 r根据生产异常与否 加以推断外，尚可根据镜检及培养特征加以 诊断 利用 电子显微镜既可证实噬菌体的存 在，又可观察到生产菌感染噬菌体后的形态 改变。双层平板法是 目前广泛用于检测噬菌 体的，该法通过噬菌斑的形成 、既能检 测噬菌体、又能准确测定其效价。该方法通 常需要十几个小时；另外．玻片快速培养法 可将噬菌体的检测时 缩短至 2．5～4 h、但 测定效价的准确度不如前者 。温和噬菌体 的检测需用敏感性指示菌。温和噬菌体可以 通过 自发或诱导的方式进人裂解途径 后者 可以明显提高温和噬菌体的裂解能力、而增 加其检出率。 发酵工业中所涉及的噬菌体主要属于细 菌和放线菌噬菌体 。细菌噬菌体所涉及的发 酵工业较多，如氨基酸、酶制剂、以及酸乳 制品等生产 而放线菌嗟菌体主要出现在抗 生索发酵工业中。 污染发酵生 产的噬菌体 以两种状态存 在．噬菌体颗粒和溶原状态 (包括溶原性杂 菌和溶源性生产菌株)。噬菌体颗粒和溶原性 杂菌的污染源存在于发酵生产区及周围的环 境中，而溶原性生产菌株本身则可能成为噬 菌体的来源。因此，污染的过程则可由自然 或人为的因素造成。 发酵工厂的周区环境易分离到生产用菌 株的噬菌体．这是由于发酵过程中产生的废 气、废液及废料等处理不当造成的。发酵过 程排出的气体常带有大量的生产菌；发酵过 59 维普资讯 http://www.cqvip.com 《食品与发酵工业》 Food and Fermentation Industries 1996 No．6 程一旦受到噬菌体的污染，那么噬菌体也将 随废气排至空气中。发酵生产的排放物及废 渣，尤其是倒罐的发酵液处理不当，则可能 成为难以对付的污染源 生产菌及杂菌易在生产区周围存在的废 弃发酵液、污水、泥土中繁殖。因此，工厂 周区环境就成为了富集来 自土壤、污水及空 气 中的生产菌株噬菌体及溶原 菌的天然场 所。噬菌体在这种环境中重复地侵染增殖，可 以想象 ，由于突变和重组致使噬菌体在其滋 生的环境 中存在的实际上是一个噬菌体群。 噬菌体群的宿主范围明显大于单一噬菌体。 因此，它们更易污染发酵生产，并且，也大 大增加了选育抗噬菌体生产株的难度和工作 量。 ‘ 溶原性菌株是发酵工业的一大隐患，一 些溶原性菌株被用作生产菌株 ；而另一些 溶原性杂菌则通过不同的污染途径进入发酵 系统 。尽管发酵工业中使用的溶原性菌株 的自发裂解频率较低 ，然而在发酵后期可能 会产生许多对原噬菌体进入裂解途径有诱导 作用的小分子物质，在这些物质的作用下，原 噬菌体便可能进入增殖状态，使生产菌株裂 解死亡 ”1。 噬菌体对发酵生产的污染还涉及生产工 艺及操作、机械设备及布局等各方面的因素。 例如一些落后的生产工艺厂将给噬菌体及杂 菌的漫延提供方便 。又如一家被噬菌体连 续污染困扰的发酵厂通过改变空气系统进气 口与发酵罐排气口的相对位置而使污染得到 控制 。 在发酵工业中，人们对各种建成噬菌体 污染的因素及其污染机率加以统计，结 果见表 l、表 2[ 。 表 l 上海味精厂窿菌体污染因素的分析 失效事件 空气系统 环境污染 设备同题 稍毒操作 管道 二级种子 致命度 ( ) 3D．33 33．25 14．63 10．73 4．07 1．63 表2 日本抗生素发酵污染圈素分析 为了防止噬菌体的污染，必须对种子、发 酵液、空气以及周围环境定时进行检测t为 防范噬菌体污染提供依据。保持生产区的清 洁，疏通排污系统，消除死角 要做好废气、 废液、废料的处理。经常利用物理、化学消 毒剂对环境消毒。室内消毒可采用新洁尔灭 (0．05 )、甲醛 (0．1 )、高锰酸钾 (0． o5 )、来苏JL(O．5 )；室外消毒可采用漂 白粉 (0．5 ，按有效氯计)、生石灰 (0．1 ， 或洒干粉)l6]。对因噬菌体严重污染而要倒 罐的发酵液，倒罐前必须进行认真地灭菌处 理 。 建立和完善发酵工艺，把好种子关 ，发 6O 酵系统在生产前必须认真清洗和严格灭菌， 在生产中严格无菌操作；设备要合理布局并 消除设备密闭不严的现象。 在实际生产中，一旦生产受到噬菌体污 染，则应立即查找事故琢因，作出相应处理； 应根据污染噬菌体的宿主范围测定，选用另 一 抗噬菌体菌株进行生产或更换菌种转产其 它产品，避免该噬菌俸的连续污染。优良的 抗性菌株应具备如下特征：(1)对出现过的 噬菌体都具有稳定的抗性；(2)具有高产能 力；(3)为非溶原菌。 溶原性菌株可表现出对已感染噬菌体或 外来的同源噬菌体的免疫性，但有原噬菌体 进入营养状态的隐患，故在使用时必须充分 注意发酵条件的控制，确保溶原性的稳定 不 稳定的溶原性菌株不可作为生产菌株。尽管 人们对溶原菌株可否用于工业发酵的观点尚 维普资讯 http://www.cqvip.com 《食品与发酵工业》 Food and Fermentation Industries 1996 No．6 未达成共识，然而在生产上使用溶原菌必须 慎重。 迄今为止，已有许多药品、试剂用于发 酵过程对噬菌体的防治。这些药剂的适量添 加不影响生产菌的正常生长和发酵，而选择 性地干扰噬菌体增殖过程中的某些环节 倒 如，由于二价阳离子对一些噬菌体的吸附有 促进作用或是必需的，我们可以利用络台剂 降低发酵液中的二价阳离子的浓度，即可有 效地抑制噬苗体的吸附 在发酵工业中常用 的络合剂有六偏磷酸 ]、肌醇六磷酸、柠 檬酸、草酸等；一些抗生索在低浓度时对宿 主无明显影响，而选择地抑制噬菌体；人们 还发现一些维生素、氨基酸及其衍生物对噬 菌体有抑制作用。“。此外培养基中共存的铁 离子浓度高于其他二价金属离子浓度时，可 抑制噬菌体裂解细菌 总之，随着科技的进步、人类对噬菌体 的研究深入，今后将会有更多的有效措施用 于发酵工业对噬菌体的防治，确保发酵生产 的正常进行。 参 考 文 献 [4]岳海峰：武汉大学硕士研究生论文 ，1993 5]Sakaki Y．et a【．{J．Viro!．，1976，75：25fi 6]李在乾等：微生物学通报．1992，19(31： 15 [73那淑敏 ：微生物学报 +1990，30(2)：117 [83胡彦民：微生物学报+1992，32(6)：456 [9j卢礼亚等编著．王顺德等译：《普通病毒 学》，上海科学技术出版社，I987 [iOj中国微生物菌种保藏管理委员会：《中国菌 种 目录》．机械工业出版社．1993 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