琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳 [实验目的] 掌握琼脂糖凝胶电泳的操作方法 [实验原理] 电泳是现在用于分离和纯化DNA片段的最常用技术。当装备一块“胶”即包含电解质的多孔支持介质并把它置于静电场中，DNA分子将向阳极移动，这是因为DNA分子沿其双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基。当DNA长度增加时，来自电场的驱动力和来自凝胶的阻力之间的比率就会降低，不同长度的DNA片段就会表现出不同的迁移率。因而就可依据DNA分子的大小来使其分离。该过程可能通过把示踪染料或分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。分子量标准参照物也可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。 依据制备凝胶的材料，凝胶电泳可被分成两个亚类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。相比之下，琼脂糖凝胶在分离度上比聚丙烯酰胺凝胶电泳差一些，而在分离范围上优于聚丙烯酰胺。一般，琼脂糖凝胶适用于分离大小在0.2-50Kb范围内的DNA片段。 【应用】分离、纯化和鉴定0.2-50Kb的DNA片段 [实验用品] 1.琼脂糖（1.0%） 1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，熔化的琼脂物冷 却至60℃时（可加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀），将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。1.5%:琼脂糖1.5g。 2.电泳缓冲液： 50×TAE（Tris－乙酸） Tris 242g （终2 mol/L） 乙酸 57.1ml （终1mol/L） 0.5M EDTA 200ml（pH8.0，终100mmol/L） dH2O 补足至1000ml 使用时稀释1×TAE。 5×TBE（Tris－硼酸） Tris 54g （终445mmol/L） 硼酸 27.5g （终445mmol/L） 0.5M EDTA 20ml （pH8.0，终10mmol/L） dH2O 补足至1000ml 使用时稀释10倍成0.5倍，如50ml贮存液+450ml水→500ml工作液。 [实验内容与方法] 1.移取适量的琼脂糖(如制备1%的琼脂糖胶液，就移1g的琼脂糖溶于100ml TAE缓冲液中)微波炉加热使其溶于TAE缓冲液中。 2.缓慢地将琼脂糖胶液注入一个带有“梳子”的胶床中(避免气泡产生)，若有气泡产生用塑料移液管移去。现在许多种胶床都可方便买到并且根据其说明书而得以应用。 3.根据胶的大小让胶凝固20-60min. 4.当胶正凝固时，准备DNA样品并取适量的DNA（如5μl）加1μl加样缓冲液混合，加样液中包含染料如溴酚蓝（BPB）。 5.胶凝之后，轻轻移去梳子。将胶床放在电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极（黑末端），注入适量的TAE缓冲液，通常缓冲液高于胶面1cm。 或加溴化乙锭（EB） 至TAE缓冲液中并使之混匀（EB的终浓度是1μg/ml）。EB也可加到胶中，即将琼脂糖在微波炉加热，然后冷却至50℃，再加入EB。 6.加DNA样品及进行电泳： 使吸管与加样孔垂直，使吸管尖端刚好在加样孔开口之下，缓慢将DNA样品加入加样孔中 7.加样完毕后，正确连接电泳槽和电源（黑的连阴极，红的连阳极）在打开电源之前，设定好电压和时间（电压100mV, 时间30min.） 8.通过检查加样孔附近的铂线来检测接线柱是否连接良好。若连接良好　，负极附近的铂丝会有气泡产生。 9.电泳过程要进行一个合适的霎时间。电泳时间的选择取决于胶的长度和电压的大小。胶越长，电压越低，所需时间越长、然而，使用高电压时，大的DNA片段的分辨率很低。 10.凝胶摄影 [注意事项] 1.TAE和TBE都是常用的缓冲液，TBE相对于TAE而言有较高的缓冲量。 2.电泳中，溴酚蓝和0.5Kb大小的DNA一起移动，这可给泳动最快的DNA片段提供一个指征。 3.DNA的迁移依赖如下因素： DNA分子越小，迁移越快。琼脂糖其浓度越低，迁移越快。DNA的构象，环状切口DNA比线状DNA迁移快。两电极间每厘米的电压。电压越高，迁移越快。 4.引物：1个OD260值相当于33μg,2个OD260值相当于66μg 引物的贮存液浓度为100μmol.L-1 ；工作液浓度为20μmol.L-1 故2个OD260值的引物稀释为100μmol.L-1的工作液时所需的加水量： （66μg/分子量）×104＝所需加水的μl数.一般PCR反应中的引物终浓度为0.2~1.0μmol.L-1. Xmol.L-1=OD260/[A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)] A、G、G、T（引物中的个数） 5.RNA定量:根据OD260值算出 OD260＝1　的溶液其RNA含量约为40μg/ml 6.dNTP一般反应中每种dNTP的终浓度为20~200μmol.L-1。理论上4种dNTP各20μmol.L-1足以在100μl反应中合成2.6μg的DNA，dNTP可配成5－10mmol.L-1并分装，－20℃贮存。 [实验结果与分析] 1.有无非特异带，及产生原因。 _915203206.unknown