【doc】成纤维细胞生长因子—2对损伤面运动神经元代谢的影响

【doc】成纤维细胞生长因子—2对损伤面运动神经元代谢的影响 成纤维细胞生长因子—2对损伤面运动神经 元代谢的影响 第33卷第6期 2002年l2月 解剖 AC11AANATOMICASINICA Vo1.33.No.6 Dec.2002 成纤维细胞生长因子.2对损伤面运动神经 元代谢的影响 秦兆冰董明敏 (郑州大学第一附属医院耳鼻咽喉科,郑州450052) [摘要]目的研究外源性成纤维细胞生长因子.2(FGF.2)对损伤面运动神经元降钙基因相关肽(CGRP)和 FGF.2达的影响.方法采用大鼠面神经损伤模型,在损伤面神经近侧断端加入FGF.2,同时以生理盐水做对 照,观察面运动神经元CGRP和FGF-2免疫阳性细胞数和灰度值.结果单纯损伤组和生理盐水组,损伤侧面运 动神经元CGRP阳性细胞数和染色强度比对照侧明显增强,而FGF.2则表达下降;与生理盐水组比较,FGF.2处理组 损伤侧面运动神经元CGRP阳性细胞数和染色强度明显下降,FGF.2阳性细胞数和染色强度增加.结论外源 性FGF-2能增强面运动神经元FGF一2的表达,但对损伤面运动神经元CGRP的表达有负向调节作用. [关键词]面运动神经元;轴突损伤;降钙基因相关肽;成纤维细胞生长因子一2;大鼠 [中图分类号]R764[文献标识码]A[文章编号]0529.1356(2002)o6—590 EXoGENoUSFGF.2REGULATESTHEM[ETABoLISMoFRAT FACIALMoToNEURoNSAFTERJURY QINZhao-bing,DONGMing-min (DepartmentofOtolaryngology,theFirst~tiatedHospitalofZhengz~uUniversity,Zhengzhou450052,China) [Abstract]ObjectiveTostudytheregulatoryeffectofexogenousfibroblastgrowthfactor(FGF-2)inexpressionsofcalci— toningene?relatedpeptide(CGRP)andFGF一 2infacialmotoneuronsafterinjury.Me~odsrI1}lefightfacialnervewastransected 6mmdistaltotIlestylomastoidforaman.A3mmpieceofGelfoampresoakedin25ofvarioustestsolutions(norlnalsaline,or16 ×106lUlLFGF一2.or32×106lUlLFGF一 2)wasimplantedadjacenttotheproximalnervestump.Afterthreedayssurvival,tIle ratswerekilledandbrainstemswereremoved.Serial20tuncryosectionswerecutthroughtIlewholebrainstem.rI1}leCGRPand FGF-2immun0reactivitvwerestudiedbyimmunohistochemistyandimageanalysis.ResultsAnincreaseintheCGRPandde— creaseintheFGF.2signalswerepresentedinaxotomizedmotoneuronswithsaline— treatedanimals.InFGF-2一treatedanimals,tIle lesion-inducedup-regulationofCGRPanddown—regulationofFGF一 2wereattenuatedcompaifingwithnormalsalinetreatedani— mals.ConclusionExogenousFGF.2canincreaseFGF-2expressionanddecreaseCGRPexpressioninratfacialmotoneuronsafter inj"ury. 1KeywordsfFacialmotoneuron;Axotomy;CGRP;FGF一2;Rat 实验表明,损伤面神经外周能引起面运动神经 元降钙基因相关肽(CGRP)代谢增高…和成纤维细 胞生长因子.2(FGF.2)表达下降.有研究提示,外 源性FGF-2可作为靶源性神经营养因子,通过神经 元的突触后传导作用到达运动神经元胞体而发挥作 用,有助于受损神经元胞体代谢和功能的恢复. 为探讨外源性FGF.2是否对损伤面运动神经元 CGRP和FGF一2的表达有调节作用,我们拟通过制造 大鼠面神经损伤模型,在损伤面神经近侧断端加入 [收稿日期]2001.07—30[修回日期]2002—03.0l [基金项目]河南省科技攻关计划项目(001170664) [作者简介]秦兆冰(1962一),女(汉族),河南郑州市人,医学 博士,副教授. *通讯作者(Towhomcorrespondenceshouldbeaddressed) 外源性FGF一2,同时以生理盐水做对照,观察其对面 运动神经元的影响,为研究面神经损伤和再生机制 及外源性FGF.2的临床应用提供参考. 材料和方法 1.动物分组和处理 成年雄性Wistar大鼠24只,体重200,250g. 右侧为面神经损伤侧,左侧为自身对照.随机分成 4组,每组6只.(1)单纯损伤组:戊巴比妥钠(40 mg/kg体重)腹腔麻醉动物,切断右侧茎乳孔处面神 经;(2)生理盐水组:以3mm3大小的明胶海绵浸泡 25肚l生理盐水,放置损伤神经近侧断端;(3)FGF一2 I组:将FGF.2粉剂(1600IU/支,珠海东大生物制药 有限公司,批号:990325)1支+100l生理盐水溶解 秦兆冰等.成纤维细胞生长因子一2对损伤面运动神经元代谢的影响 为16×106IU/L的FGF-2溶液,每只动物加25,以 3mm3大小的明胶海绵浸泡后放置损伤神经近侧断 端;(4)FGF一2I1组:将FGF-2粉剂1支+50l生理盐 水溶解为32×10.IU/L的FGF.2溶液,每只动物加 25l,以3mm大小的明胶海绵浸泡后放置损伤神 经近侧断端.各组动物标记后混合饲养3d. 2.标本制备 用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉动物,开胸,经左心 室插管至升主动脉,生理盐水冲净血液,随即灌注 4%多聚甲醛(4~C)取面神经核段脑干于4%多聚甲 醛(4?)中再固定4h,入20%蔗糖磷酸缓冲液至沉 底(4oC).术侧标记后行20tsm面神经核段脑干连 续冰冻切片.白面神经核将要出现时开始收集切 ,至面神经核根膝平面每10张取 片,每10张取1张 4张,共4轮,以后仍每10张取1张,到面神经核结 束.这样每只动物共收集切片4套,1套包括面神 经核全过程,行CresylViolet染色作对比观察.其余 为面神经核根膝平面,每套4张贴在同一玻片上,其 中1套行CGRP免疫组织化学染色,1套行FGF一2免 疫组织化学染色,剩余作阴性空白对照片和备用切 片. 3.CresylViolet染色 切片在0.1%CresylViolet液中染色10min,蒸 馏水洗2遍,在70%,80%,2个95%酒精中各分化3 min,2个100%酒精中各分化1min,2个二甲苯中各 透明5min,中性树胶封片. 4.免疫组织化学方法 切片经0.3%H,O,处理30min,0.3%TritonX一 100室温30min,5%正常羊血清封闭37?30min.1 :8000兔抗CGRP抗体(Sigma公司),1:300兔抗 FGF一2抗体(SantaCruze公司)4~C24h,生物素化羊 抗兔抗体37?30min,SABC37oC30min,最后DAB 呈色5min.染色过程中除正常血清外,各步骤完成 后均用0.01mol/LpH7.4PBS洗3次.阴性空白对 照用PBS代替一抗作免疫组织化学染色,结果阴 性. 5.计算机图像分析 用MPIAS.500计算机图像处理系统.灰度值:0 (黑),255(白).测量CGRP和FGF一2免疫反应阳 性细胞数和灰度值.每个指标每组取6张玻片,每 个玻片4个切片,分别测量两侧面运动神经元阳性 细胞数和平均灰度值.直径大于20m,胞核清晰 者在测量范围之内.为减小实验误差,采用两侧面 运动神经元的测量比值作不同处理组之间的比较, 即以损伤侧面运动神经元阳性细胞数和平均灰度值 分别除以同一张切片对照侧所测数值,记录为阳性 细胞数比和灰度值百分比.采用SPSS统计软件多 个样本均数比较的方差分析,以P<0.05为有显着 性差异. 结果 1.CresylViolet染色切片光镜观察 面神经运动核位于脑桥下部靠近腹侧,神经元 细胞呈大多角形,多突起.各处理组两侧面运动神 经元细胞数量和形态无明显改变. 2.对照侧及损伤侧面运动神经元CGRP和FGF.2 的表达 CGRP阳性反应物质呈棕黄色,胞浆着色,核为 阴性.对照侧(健侧)面神经核各亚核中均有CGRP 阳性胞体出现,阳性细胞多为大多角形神经元细胞, 突起较短(图1).面神经损伤后,损伤侧面运动神 经元CGRP染色比对照侧增强,并发现阳性神经元 突起明显伸长,阳性细胞数也明显增多(图2). FGF-2阳性反应物质呈棕黄色,胞浆着色,核无染 色.FGF一2阳性细胞主要分布于正常面神经核腹侧 亚核,阳性细胞为大圆形或多角形神经元细胞.面 神经损伤后,损伤侧面运动神经元FGF一2阳性细胞 数和染色强度显着减少. 3.各处理组面运动神经元CGRIP的表达 生理盐水组双侧面运动神经元CGRP阳性细胞 数比和灰度值百分比与单纯面神经损伤组比较差异 无显着性(P>0.05).与生理盐水组相比,FGF一2I 组和FGF一2I1组损伤侧面运动神经元CGRP染色强 度明显下降,FGF一2I1组损伤侧面运动神经元CGRP 阳性细胞数减少(图3,4).各处理组双侧面运动神 经元CGRP阳性细胞数比和灰度值百分比见表1. 表1面运动神经元CGRP阳性细胞数比和灰度值 百分比(损伤侧/对照侧)图像分析 Table1ImageanalysisofCGRPpositivecellratioandlebaling percentageratio(injury/contro1)infacialmotoneurons 4.各处理组面运动神经元FGF.2的表达 生理盐水组双侧面运动神经元FGF一2阳性细胞 ? 592?解剖33卷,6期 图1对照侧面运动神经元CGRP细胞呈弱阳性表达.免疫组织化学染色(下同)×400(下同)图2面神经损伤后损伤侧面运动 神经元CGRP阳性细胞数和染色强度均增加图3FGF.2I组损伤侧面运动神经元CGRP阳性细胞染色强度减弱图4FGF-21I 组损伤侧面运动神经元CGRP阳性细胞数减少,染色强度减弱图5面神经损伤后损伤侧面运动神经元FGF-2阳性细胞数和染色 性细胞数和染色强强度均降低图6FGF一21I组损伤侧面运动神经元FGF一2阳 度增加. Fig.1ControlfacialmotoneuronsshowfaintCGRPstaining.immunohistochemistry.× 4OO(ThesalTlebelow) Fig.2AnincreaseinstainingintensityandthenumberofCGRPmotoneuronswasobsverdinoperatedsidefacialmotoneuronsafteraxotomy. Fig.3AdecraseinstainingintensityofCGRPmotoneuronswaso~veMinoperatedsidefacialmotoneuronsingroupeofFGF-21. Fig.4AdecraseinstainingintensityandthenumberofCGRPmotoneuronswaso~veMinoperatedsidefacialmotoneuronsingroupeofFGF一2?. Fig.5AdecreaseinstainingintensityandthenumberofFGF-2motoneuronswasobsveredinoperatedsidefacialmotoneuronsafteraxotomy. Fig.6AnincraseinstainingintensityandthenumberofFGF-2motoneuronswaso~veMinoperatedsidefacialmotoneuronsingroupeofFGF一2?. 秦兆冰等.成纤维细胞生长因子一2对损伤面运动神经元代谢的影响.593. 数比和灰度值百分比与单纯面神经损伤组比较差异 无显着性(P>0.05).与生理盐水组比较,FGF一2I 组和FGF.2I1组损伤侧面运动神经元FGF.2阳性细 胞数明显增多,FGF一2I1组染色强度也增强(图5, 6).各处理组双侧面运动神经元FGF一2阳性细胞数 比和灰度值百分比的比较见表2. 表2面运动神经元FGF-2阳性细胞数比和灰度值 百分比(损伤侧/对照侧)图像分析 Table2ImageanalysisofFGF-2positivecellratioandlebaling percentageratio(injury/contro1)infacialmotoneurons 讨论 FGF-2广泛分布于中枢和周围神经系统,在神 经系统的发育和再生过程中起重要作用.本研究结 果及我们的另一研究结果均显示:面神经损伤后,损 伤侧面运动神经元FGF.2蛋白表达减少. Huber?等在舌下运动神经元也观察到类似的结果. 提示:正常面运动神经元对FGF一2的需求主要依赖 其靶组织来源的FGF一2的突触后传导作用,当周围 神经受到损伤后,这种传导被阻断,则损伤侧面运动 神经元FGF一2蛋白显着减少. CGRP是降钙素基因在甲状腺以外的组织中转 录,表达的一种由37个氨基酸残基组成的神经肽, 与乙酰胆碱共同存在于脊髓和脑干的运动神经元 中.目前CGRP在神经系统的作用尚不完全清 楚,但当外周神经损伤后,其运动神经元CGRP及其 mRNA快速升高,常被作为神经损伤的一个标志性 物质….本研究观察到损伤面神经管外段,则损伤 侧面运动神经元CGRP显着升高,与其他运动神经 元中观察到的结果一致.另有研究显示:用秋水仙 素和长春花碱复合物阻断轴突运输,同样能激发出 运动神经元中类似的CGRP升高.提示,神经元 突触后传导的物质中可能存在有对运动神经元中 CGRP起抑制作用的因子,神经的损伤和阻断使这 种抑制因子不能到达其神经元胞体,结果导致运动 神经元中CGRP升高.CGRP的升高是运动神经元 对轴突阻断的一种早期的内在反应. 研究报道,外源性FGF.2可作为靶源性神经营 养因子,通过神经元的突触后传导作用到达运动神 经元胞体而发挥作用n].本实验观察到,在损伤面 神经断端加入外源性FGF一2则损伤侧面运动神经元 FGF一2蛋白表达增多,与生理盐水组相比有显着性 差异,其作用强弱与FGF一2的浓度相关.ehl 等在培养的运动神经元细胞和损伤的坐骨神经 的研究中发现,加入外源性的FGF.2,能阻止损伤导 致的运动神经元CGRP的升高.我们通过对面神经 损伤的观察发现:在损伤面神经局部加入外源性 FGF一2,可明显减低损伤导致的面运动神经元CGRP 的升高,与生理盐水组比较有显着性差异,并且这种 作用的强度与FGF.2的浓度成正相关.本研究观察 到:FGF一2I组仅损伤侧CGRP阳性细胞染色强度下 降,而FGF一2I1组损伤侧CGRP阳性细胞数和染色强 度均下降,说明高浓度的FGF.2作用更强.阳性细 胞数的减少可能是由于其染色强度降低到了可 水平以下.上述结果说明神经损伤导致面运动神经 元CGRP升高至少部分原因是由于靶源性FGF一2被 阻断所致.综上所述,本研究结果提示:面神经损伤 早期,面运动神经元胞体内源性FGF一2缺乏,此时如 能外源性予以补充可能有助于神经元胞体代谢和功 能的恢复. 参考文献 [1]FukuokaT,TokunagaA,KondoE,eta1.Differentialregulationofalpha? andbeta—CGRPmRNAswithinoculomotor,trocMear,abducens,andtri— geminalmotoneuronsinresponsetoaxotomy【JJ.BrainResMolBrain Res,1999,63(2):304—315. 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