磷脂酰肌醇3激酶在卵巢上皮性癌组织中的表达及其抑制剂对卵巢上皮性癌细胞生长抑制作用的研究
磷脂酰肌醇3激酶在卵巢上皮性癌组织中的表达及其抑制剂对卵巢上皮性癌细胞生长
抑制作用的研究
?
196?2007年3月第42卷第3期ChinJObstetGynecol,March2007,VoL42,No.3
磷脂酰肌醇3激酶在卵巢上皮性癌组织中的
表达及其抑制剂对卵巢上皮性癌细胞
生长抑制作用的研究
张彭南孙红
【摘要】目的探讨细胞信号转导信使磷脂酰肌醇3激酶(PDK)在卵巢上皮性癌(卵巢癌)组
织中的表达及其意义;并探讨PI3K抑制剂LY294002联合顺铂对卵巢癌细胞株的生长抑制作用.
方法应用蛋白印迹法和RT.PCR技术
正常卵巢组织(正常组,20份),卵巢良性上皮性肿瘤组
织(良性组,6份),卵巢交界性上皮性肿瘤组织(交界性组,6份)和卵巢癌组织(卵巢癌组,39份)中
PDKp85亚单位蛋白和mRNA的表达.将SKOV3细胞分为对照组(只加培养液),LY294002组(加
1,10,30,50,100p,mol/LLY294002),顺铂组(加0.33,1.25,2.5,5,10ixmol/L顺铂)和联合组(加
50p,mo1./LLY294002+10~mol/L顺铂),四甲基偶氮唑蓝还原法测定不同浓度的LY294002及顺铂
对SKOV3细胞的生长抑制作用.结果(1)PDKp85亚单位蛋白的表达阳性率:正常组和良性组均
为0.交界性组为2/6,卵巢癌组为85%(33/39),正常组,良性组,交界性组分别与卵巢癌组比较,差
异均有统计学意义(P<0.01).(2)PI3Kp85亚单位mRNA的表达水平:正常组为0.1784-0.102,良
性组为0.6434-0.112,交界性组为0.8474-0.058,卵巢癌组为1.6894-0.423,正常组,良性组,交界性
组分别与卵巢癌组比较,差异均有统计学意义(P<0.01).卵巢癌组织中,PI3Kp85亚单位蛋白表达
阳性率及InRNA的表达水平,不同年龄,病理类型间比较,差异均无统计学意义(P>0.05);而不同病
理分化程度,手术病理分期问比较,差异均有统计学意义(P<0.05).(3)LY294002及顺铂呈剂量
依赖性地抑制SKOV3细胞的生长.LY294002组(50p,mo1./L),顺铂组(10~mol/L),联合组SKOV3
细胞的抑制率分别为(46.04-2.0)%,(44.44-3.2)%,(57.14-4.1)%,联合组SKOV3细胞的抑制率
高于LY294002组及顺铂组(P<0.01).结论PI3Kp85亚单位在卵巢
癌组织中呈高表达,与病理分
化程度,手术病理分期有关.LY294002与顺铂联合用药对卵巢癌细胞
生长的抑制具有协同效应.
【关键词】1一磷脂酰肌醇3一激酶;卵巢肿瘤;色酮类;吗啉类;顺铂
qpl惯s自如
ofphosphatidylinositol-3kinaseinepithelialovariancarcinomaZHANG一
naR,
SUNltong.DepartmentofGynecology,ObstetricsandGynecologyHospital,FudanUnive~hy,Shanghai
2O0011.China
Correspondingauthor:SUNltong,Email:hongsurd7@hotmaiLcorn
【Abstract】
ObjectiveToexploretheexpressionandsignificanceofphosphatidylinositol-3kinase
(PBK)inovariancancer,andtheeffectofcombinedPDKinhibitor(LY294002)therapywithcisplatinon
epithelialovariancarcinoma.andtoexplOreifthereisasynergisticeffectbetweenthetwotherapies.
MethodsTheexpressionlevelsofPDKD85subunitproteinsandmRNAwereevaluatedbywesternblot
andRT—PCRinnormalovariantissue(G1),ovarianbenigntumortissue(G2)
,ovarianborderlinetumor
tissue(G3)andovariancancertissue(G4),andtherelevantclinicalpathologicalparameterswere
analr~SKOV3cellswereisolatedandculturedbyenzymolysismethod.SKOV3cellsweretreatedwith
culturemediumonly,LY294002(1,10,30,50,100~mol/L),cisplatin(0.33,1.25,2.5,5,
10p~mol/L),LY294002(50~mol/L)+cisplatin(10t~nol/L)for2days,respectively.11heeffectof
Ur294002andcisplatinonthegrowthofSKOV3ceUswasmeaSuredbymethylthiazolyltetrazoliumaSsay.
Results11hereWaSnopositiveexpressionofPI3Kp85subunitproteinsinG1andG2,whiletheexpression
Wills2/6inG3,and85%(33/39)inG4.PDKp85subunitmRNAexpressionlevelswere0.1784-0.102
基金项目:上海市卫生局科技发展基金(054064)
作者单位:200011上海,复旦大学附属妇产科医院妇科
通信作者:孙红,Email:hongsun57@hotmaiLcorn
.
临床研究.
2O07年3月第42卷第3期
ChinJObstetGynecol,March2007,Vo1.42,No.3
inG1.0.6434-0.112inG2,0.8474-0.058inG3,1.6894-0.423inG4;therewasasignificant
differencebetweenG1.G2.G3andG4(P<0.01).ThereWasnosignificantcorrelationbetweenprotein
e】叩l麟
ionandageatsurgeryorclinico—pathologicalstaging(P>0.05).Significantdifferenceswerenoted
betweenproteinexpressionlevelsinG4(in,1V)andG4(I,II;P<0.05).ThereWasasignificant
differencebetweenexpressiOnlevelsintissuesofdifferentdifferentiationdegrees(P<0.05).LY294002
andcisplatininhibitedthegrowthofSKOV3cellinaconcentration—depend
entmanner.卟einhibitory
activityofu陀
94002attheconcentrationof50m0L/LWas(46.04-2.0)%aftertreatmentfortwodaysI
nleinhibitoryactivity0fcisplatinattheconcentrationof10ixmol/LWas(44.44-3.2)%aftertreatmentfor
twod弧
Aftertreatmentfortwodays,theinhibitoryactivityofLY29400250~mol/L+cislplatin10pmol/L
was(57.14-4.1)%.TheinhibitioneffectonSKOV3cellgrowthofthecombinedtreatmentgroupWasbetter
thantheLY294002orcisplatintreatedgroup(P<0.01).ConclusionsPI3Kp85subunitishighly
expressedandpositivelycorrelatedwithovariancancer.Differentexpressionlevelsexistintissuesoflate
ovariancancer.earlierovariancancer,borderlinetumor,benignovariantumorandnormalovariantissue.
chang髑
inPI3Kp85subunitarecorrelatedwithtumordifferentiationdegree,butnotpathologictyping.
LY294002combinedwitIlcisplatinCansignificantlyenhalicetllekillinge砺
ciencyinovariancancercells.
【Keywords】
1-Phosphatidylinositol3-kinase;Ovarianneoplasms;Chromones;Morpholines;
C~platin
卵巢上皮性癌(卵巢癌)是女性生殖器官常见
的恶性肿瘤之一,病死率位于妇科肿瘤的首位,目前
仍缺乏有效的早期诊断及治疗手段.磷脂酰肌醇3
激酶(phosphafidyhnositol-3kinase,PI3K)一蛋白激酶
B(proteinkinaseB,PKB)通路是近年来备受关注的
凋亡抑制通路之一,与肿瘤的发生,耐药关系密
切uJ.在卵巢癌细胞株中的研究显示,PDK的p85
亚单位可能是一种新的致癌基因,但未见有在卵巢
癌组织中的实验.近来的研究表明,PDK—PKB通路
表达过高能导致肿瘤细胞对化疗药物的抵抗,耐
受j.若能特异性地阻断该通路,可能产生明显的
抗癌效应,且这种抑制效应对正常细胞影响甚微,即
可显着提高肿瘤治疗的靶向性J.本研究用蛋白
印迹(westernblot)法及RT—PCR技术检测不同的卵
巢组织标本中PDKp85亚单位蛋白和mRNA的表
达,探讨其临床意义;并应用四甲基偶氮唑蓝
(1wrr)还原法比较单用PDK抑制剂LY294002,顺
铂及联合两种制剂的治疗
对卵巢癌细胞株
SKOv3的生长抑制作用.
材料与方法
一
,主要材料
1.组织标本及细胞株来源:收集2004年3月
至1O月间在复旦大学附属妇产科医院手术治疗的
卵巢上皮性肿瘤患者的组织标本,其中,卵巢良性上
皮性肿瘤标本6份(良性组),卵巢交界性上皮性肿
瘤标本6份(交界性组),原发性卵巢癌标本39份
(卵巢癌组);另收集20例因子宫肌瘤行手术治疗
患者的正常卵巢组织作为正常对照(正常组).所
有患者的年龄为15,76岁,平均45.5岁,术前均未
接受化疗或激素治疗.所有组织均经病理检查明确
诊断.卵巢癌患者中,?50岁者24例,>50岁者
15例;病理类型:浆液性癌23例,黏液性癌2例,子
宫内膜样癌7例,透明细胞癌7例;手术病理分期:
按国际妇产科联盟(FIGO)2000年的
,I期13
例,?期2例,?,?期24例;病理分化程度:高,
中,低分化分别为10,9,20例.组织标本切除后立
即置液氮中保存,标本采集均经患者知情同意.人
卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株SKOV3由复旦大
学附属妇产科研究所提供.
2.主要试剂:小鼠抗人PDKp85亚单位单克
隆抗体购自美国Serotec公司,二抗(辣根酶标记山
羊抗小鼠IgG)购自北京中杉金桥生物技术公司;
TRIzol试剂及RT.PCR试剂盒购自上海申能博彩生
物科技公司;顺铂(100%纯度)购自美国Sigma公
司,LY294002购自上海康成生物技术公司,MrlT,新
生牛血清购自上海实生细胞生物技术公司,DMEM
高糖培养液购自杭州吉诺生物医药技术公司.
二,方法
1.蛋白印迹法检测PDKp85亚单位蛋白的表
达:取冰冻的组织标本0.3g并加入预冷的细胞裂
解液0.5ml,迅速匀浆至肉眼不可见组织块,测定标
本的蛋白质含量.用5%聚丙烯酰胺压缩胶和
7.5%聚丙烯酰胺分离胶进行蛋白标本的垂直电泳,
再经过转移电泳将蛋白转移至硝酸纤维素膜上.在
硝酸纤维素膜上先后加入一抗,二抗及5一溴4-氯-3-
吲哚基磷酸酯/四唑氮蓝(BCIP/NBT)显色液.用
图像分析系统对电泳条带进行定性分析,出现条带
即为表达阳性.
2.RT—PCR技术检测PI3Kp85亚单位mRNA
2007年3月第42卷第3期ChinJObstetGynecol,March242?垒
的表达:(1)组织总RNA提取:按TRIzol抽提
试剂盒
进行,紫外分光光度计检测RNA纯度.
(2)引物
:PI3Kp85亚单位引物序列,上游:5r_
AGGAGCGGTACAGCAAAGAA..3,下游:5一
GCCGAACACaITrGAGTC_3,产物片段长度为
270bp;内对照B肌动蛋白(p—actin)引物序
列,上游:5r_GTGGGGCGCCCCAGGCACCA一3,下游:
5一GTCCTYAATGTCACGCACGArITITI’C一3,产物片段
长度为540bp.(3)生成cDNA:在20逆转录反
应体系中,加入4IrlRNA,1l引物,反应条
件为42?1h,72?10min,4?冷却.(4)PCR扩
增:取cDNA5,上,下游引物各4,耐热DNA聚
合酶1,加入PCR反应体系中扩增.反应条件:
94?预变性5min,94?变性45s,57?退火45s,
72?延伸1min,共35个循环,72?后延伸
10min,一20?保存.(5)电泳:用1.5%琼脂
糖凝胶进行电泳,同时用图像处理系统计算每
一
条带的吸光度(A)值与面积值之积,此积与内参
照B—actin的比值代表目的基因mRNA的表达
水平.
3.细胞培养:SKOV3细胞常规培养于37?,
5%CO含10%新生牛血清,青霉素和链霉素(各
100U/toO的DMEM培养液中.按每孔2X10个
将细胞接种到96孔培养板中,每孔100(细胞密
度为2X10/m1),置孵育箱中培养.
4.不同浓度LY294002,顺铂及LY294002联合
顺铂处理细胞:接种于培养板中的SKOV3细胞待生
长24h后,细胞大部分已贴壁,分为对照组,
LY294002组,顺铂组,联合组.对照组只加含二甲
基亚砜(DMSO)的培养液,LY294002组加入含
LY294002(浓度分别为1,10,30,50,100I~mol/L)的
培养液,顺铂组加入含顺铂(浓度分别为0.33,
1.25,2.5,5,10~moL/L)的培养液,联合组加入含
LY294002(50I~mol/L)+顺铂(10I~mol/L)的
培养液.所有组DMSO的终浓度为0.1%.继
续置于37?,5%CO的孵育箱培养.每组3个
复孔.
5.MTY还原法测定不同浓度药物作用后
SKOV3细胞的生长情况:各组细胞培养44h后,每
孔加入5mg/m~1WIT溶液10,37?孵育4h.弃
去培养液,每孔加入DMSO150,振荡10min,使
结晶物充分溶解.在酶联免疫检测仪上测定各孔的
A值,计算不同浓度药物对细胞生长的抑制率,计算
公式为(A对照组一A实验组)/A对照组X100%.实验重复
3次.
三,统计学方法
应用SPSS12软件进行统计学分析,实验结果
以元-4-s表示,计数资料的比较采用x检验,计量资
料的比较采用单因素方差分析.
结果
一
,各组组织标本中PI3Kp85亚单位蛋白的
表达
正常组和良性组组织标本中均未有PI3KpS5
亚单位蛋白的表达;交界性组中有2例(2/6)表达
阳性;卵巢癌组中有33例(85%,33/39)表达阳性.
正常组,良性组,交界性组的表达阳性率分别与卵巢
癌组比较,差异均有统计学意义(P<0.01).
二,各组组织标本中PI3Kp85亚单位mRNA的
表达
PI3Kp85亚单位mRNA的表达水平,正常组为
0.178?0.102,良性组为0.643?0.112,交界性组
为0.847?0.058,卵巢癌组为1.689?0.423;正常
组,良性组,交界性组分别与卵巢癌组比较,差异均
有统计学意义(P<0.01).
三,卵巢癌组织中PI3Kp85亚单位蛋白和
mRNA的表达
卵巢癌组织中,PI3Kp85亚单位蛋白表达阳性
率及mRNA的表达水平,不同年龄,病理类型间比
较,差异均无统计学意义(P>0.05);而不同病理分
化程度,手术病理分期间比较,差异均有统计学意义
(P<0.05).见表1.
四,不同浓度LY294002,顺铂及LY294002联合
顺铂对SKOV3细胞生长的抑制情况
随着LY294002浓度的升高,LY294002对
SKOV3细胞生长的抑制率呈上升趋势;当达到50
p,moL/L浓度时抑制率显着增高(P<0.05),达
46.0%,但与100i~mol/L浓度比较,差异无统计学
意义(P>0.05).随着顺铂浓度的升高,对SKOV3
细胞的抑制率也随之上升,到10p,mol/L浓度时
有较显着的升高(P<0.05),达44.4%.选取
LY29400250I.Lmol/L+顺铂10l~mol/L作为联合
组,对SKOV3细胞的抑制率显着高于LY294002组
及顺铂组,与单用LY29400250I~mol/L及顺铂
10I~mol/L分别比较,差异均有统计学意义(P<
0.01).见表2.
2007年3月第42卷第3期ChinJObstetGynecol,March2007,VoL42,No.3
表1不同临床病理特征的卵巢癌组织中PI3Kps5亚单位蛋白和mRNA的表达
注:”a表示例数少于1O,不计算百分率;…b表示每种临床病理特征内相互比较
表2各组SKOV3细胞生长的抑制情况(元?s)
注:.一表示无此项
讨论
一
,卵巢癌中PI3Kp85亚单位表达的意义
PI3K是磷脂酰肌醇依赖激酶家族成员,由两个
活性亚单位即p110催化亚单位和p85调节亚单位
组成的异二聚体.PI3K与细胞增殖,抗凋亡,细胞
迁移,膜泡转运,细胞癌性转化等过程相关,这些效
应主要是通过PI3K催化形成的”锚”分子——_3磷
酸肌醇脂介导的HJ.具有酪氨酸激酶活性的癌性
蛋白Src,Rac,Abl,v—Crk,多瘤病毒中T抗原等可与
PI3K的调节亚单位p85结合而发生作用,这些癌性
蛋白的异常活化可使PI3K持续活化,引起细胞形态
改变,凋亡受阻,导致细胞转化及过度增殖].
本研究结果显示,卵巢癌组织中PI3Kp85亚单
位蛋白和mRNA的表达均高于正常卵巢,卵巢良性
上皮性肿瘤及卵巢交界性上皮性肿瘤组织.Philp
等用抗p85多克隆抗体检测发现,在卵巢癌
OVCAR3和SKOV3细胞株中有PI3K的p85亚单位
蛋白的表达,与本研究的结果相符.本研究发现,正
常卵巢及卵巢良性上皮性肿瘤组织中,未检测出
PI3Kp85蛋白的表达,但却检测出mRNA的表达.
Zhang等报道,卵巢癌中编码PI3K催化亚单位的
基因PIK3CAmRNA在癌组织中的表达明显高于良
性及低度恶性的卵巢肿瘤.本研究从组织学研究上
支持PI3K在卵巢癌中被活化的观点.说明PI3K途
径在正常组织中即存在,行使正常的信号转导功能,
维持细胞正常的增殖,凋亡等生理过程;只是在细胞
恶变后,才被异常激活,表现出其介导肿瘤信号的特
性,提示PI3K途径参与卵巢癌后期进展阶段的信号
转导.对此应进一步行大样本研究,若有此规律,对
鉴别早,晚期卵巢癌将有重要意义.
二,不同临床病理特征的卵巢癌组织中PI3K
p85亚单位蛋白和mRNA表达的意义
本研究结果显示,PI3KpS5亚单位蛋白和
mRNA表达与患者年龄,病理类型无关.但值得注
意的是7例子宫内膜样癌及7例透明细胞癌均各有
6例PI3KpS5亚单位蛋白表达为阳性.Campbell
等发现,在早期卵巢癌中有明显的病理类型分布
的偏移,其中88例浆液性癌中只有2例出现卵巢癌
中PIK3CA蛋白的改变(2.3%);在4o例子宫内膜
样癌中有8例出现了PIK3CA蛋白的改变
(20.0%),两者之间有差异.本研究由于标本数量
有限未能得出有统计学意义的差异.
本研究结果还显示,PI3KpS5亚单位的表达与
2007年3月第42卷第3期ChinJObstetGyn鲤丛,丝
卵巢癌的手术病理分期有关,I期,?期和?一?期
表达升高;卵巢癌组织高,中与低分化比较,PI3K
p85亚单位表达的差异有统计学意义.这表明分期
越晚,分化越差,恶性度越高,PI3Kp85亚单位的表
达越高,浸润,转移趋势越强.
三,LY294002联合顺铂与单用LY294002,顺铂
对SKOV3细胞生长抑制的比较
顺铂是当前广泛应用的卵巢癌化疗药物,Lee
等[9报道,OVCAR3细胞产生对化疗药物的抵抗可
能是由于PIK3CA的增强,对顺铂的抵抗作用可能
通过增强PI3K—PKB的活性和抑制凋亡蛋白Bax而
产生的.Cheng等?认为,顺铂化疗的耐药依然是
成功治疗卵巢癌的主要障碍,可能与x染色体连锁
凋亡抑制蛋白(XIAP)和PI3K途径之间的交互作用
有关,故选择能有效与顺铂配伍的药物是临床探索
的问题之一.Lee等发现,用PI3K特异性抑制剂
LY294002处理对顺铂耐药的OVCAR3细胞,可以
增强细胞对顺铂诱导的凋亡效应,减少细胞的生存.
本研究应用5种不同浓度LY294002作用于
SKOV3细胞后发现,随着LY294002浓度的升高,对
SKOV3细胞生长的抑制率呈上升趋势.Skinner
等报道,在SKOV3细胞中20~mol/LLY294002
抑制了PKB的表达.Hu等?研究发现,LY294002
作用于接种了OVCAR3细胞的裸鼠后,平均抑瘤率
为65%;在体外,LY294002作用于OVCAR3细胞,
生长抑制率显着高于对照组,与本研究的结果相符.
本研究选用50~mol/LLY294002和10~mol/L
顺铂联合用药,与单用50~mol/LLY294002,
10panol/L顺铂比较,联合组对SKOV3细胞的抑制
率显着高于LY294002组及顺铂组,显示出联合给
药比单纯用LY294002及顺铂对SKOV3细胞生长的
抑制效果好,说明在SKOV3细胞中,LY294002可以
增强顺铂对卵巢癌细胞的生长抑制作用.
n940o2可能是通过以下作用增强顺铂化疗疗效
的:(1)PI3K—PKB途径通过促进细胞进入G期和
加速G.期向S期的转换来调控细胞周期,促进细胞
增殖.LY294002能抑制细胞周期发展,使细胞停滞
在G.期,导致细胞增殖受到抑制.(2)癌基因Ras
可通过PDK激活PKB,保护细胞不发生凋亡,而
LY294002通过抑制PI3K的活性,可以阻断该信号
转导通路,进而抑制Ras介导的对卵巢癌细胞的保
护作用,下调抗凋亡因子bcl-2,c—myc的表达,促进
肿瘤细胞发生凋亡L6J.(3)PI3K—PKB通路对细胞
的生长,增殖,凋亡,恶变起重要的调控作用,活化的
PKB通过上调抗凋亡因子(如bcl—x1)的表达,同时
可下调促凋亡因子(如Bad)的表达,抑制细胞凋亡,
从而通过调控细胞凋亡来影响肿瘤细胞的药物敏感
性].LY294002特异性地抑制了PI3K的活性,从
而提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性.
随着细胞内磷脂酰肌醇的靶蛋白(如促凋亡因
子Bad,核因子KB,p21Cipl蛋白和p27蛋白)cDNA
克隆相继获得,PI3K—PKB信号转导途径将有可能成
为卵巢癌诊断和治疗新的靶点,其特异性抑制剂
LY294002的抑制作用也将得到深入的研究,PI3K
抑制剂联合传统的化疗药物可能提供一种新的卵巢
癌治疗的组合.
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(收稿日期.2006-08-08)
(本文编辑:沈平虎)