对乙酰氨基酚在大鼠体内药动学研究

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Microbiol，2003，41(12)：5 449—5 455． (收稿日期：2009—12—25 修回13期：2010—01—29) 对乙酰氨基酚在火鼠体内药动学研究▲ 蒙光义 王柳萍 严 明。 许 盈 杨 斌 (1广西医科大学药学院，南宁市 530021； 2广西中医学院药学院，南宁市 530001；3广西医科大学第一附属医院，南宁市 530021) 【摘要】 目的 应用反相高效液相色谱法(RP—HPLC)测定大鼠血浆中对乙酰氨基酚浓度，研究单剂量口服 不同剂量对乙酰氨基酚片在大鼠体内的药代动力学。方法 3组SD大鼠分别按体重单剂量口服对乙酰氨基酚片 300 mr：／kg、6OO mr／kg、1 200 mr：／kg后，采用 RP—HPLC测定血浆中药物的浓度，绘制血药浓度 一时间曲线，计算其 药代动力学参数。结果 3个剂量组的对乙酰氨基酚药一时曲线均符合口服吸收的一级动力学二室模型，主要药 代动力学参数：T 分别为(0．78±0．17)h、(1．07±0．12)h、(1．19±0．12)h；C 分别为(158．99±26．08)v#ml、 (226．26±20．38) g／ml、(402．95±86．46) g／ml；T1／2k 分另q为(0．24±0．09)h、(0．39±0．11)h、(0．43±0．14)h； T1 2k。分别为(3．78±0．33)h、(3．66±0．32)h、(4．33±0．47)h；AUC0 分别为(718．71±143．03)Ixg·h一 ·ml一 、 (1 578．53±246．76)lag·h～·InI～、(3 734．67±665．58) ·h～·ml～；AUC~ 分别为(757．16±155．29) ·h～·IId～、 (1 594．61±247．11)ixg·h～ ·ml～、(3 847．99±692．03)ixg·h～·ml～。结论 所建立 RP—HPLC法能够准 确地测定对乙酰氨基酚血药浓度，能满足药代动力学的研究需求；低剂量组和中剂量组的药代动力学过程基本 相似，但高剂量组则与上述两组则有所不同，这可能与其剂量过高有关。 【关键词】 对乙酰氨基酚；药动学；血药浓度；反相高效液相色谱法；大鼠 【中图分类号】 R 971．1 【文献标识码】 A 【文章编号】 0253-4304(2010)02。133-05 ▲基金项 目：广西科学基金(桂科 自0991135) 作者简介：蒙光义(1983～)，男，汉族，广西灵山人，硕士研究生，学士学位，研究方向：中药药理学。E—mail：gxmu-mgy@163．com 通信作者：杨斌(1964一)，男，汉族 ，广西灵山人，博士，教授，硕士生导师，研究方向：中药药理学。E—mail：yangbirr2003202@sina．eom l34 Guan~xi Medical Journal，Feb．2010，Vo1．32，No．2 Study oN Pharmacokinetics of Paracetamol in Rats MENG Guang-yi ，WANG Liu-ping ，YAN Ming ，XU Ying。 ， YANG Bin (1 Pharmacy College of Guangxi Medical University，Nanning 530021； 2 Pharmacy College of Guangxi Traditional Chinese Medical University，?Canning 530001； 3 The f Affiliated Hospital ofGuangxi Medical University，Nanning 530021，China) 【Abstract】 Objective To apply the reversed—phase high performance liquid chromatography(RP—HPLC) method for determination of plasma drug concentration of paracetamol in rats，to investigate the pharmacokinetics in rats after different doses of a single oral paracetamol tablet．Methods After three groups of rats were given an oral paracetamol tablet in a single oral dose of 300 mg／kg，600 mg／kg，3 200 mg／kg by weight separately，the concentrations of paracetamol in plasma were determ ined by RP—HPLC，and then the blood concentration—time curves was draw and the pharmacokinetic parameters was calculated．Results The plasma concentration—time curves of paracetamol were fitted to a two-compartment model with first order absorption in rats after a oral paracetamol tablet in single dose(300 mg／kg， 600 mg／kg，1 200 mg／kg，respectively)．The main pharmacokinetic parameters of paracetamol in three groups rats were as follows．T were(0．78±0．38)h，(3．07±0．12)h and(3．19 4-0．32)h．C were(358．99 4-26．08) ml， (226．26 4-20．38) g／n】l and(402．95 4-86．46) g／ ．T1／2 were(0．24±0．09)h，(0．39 4-0．31)h and(0．43±0．34)h． T were(3．78 4-0．33)h，(3．66 4-0．32)h and(4．33±0．47)h．AUC were(738．71 4-143．03)Ixg’h～·I11l～， (3 578．53_+246．76)~g·h～·ml～and(3 734．67_+665．58)tag·h一·ml-1．AUCD— were(757．36 4-155．29)tag·h～·ml～， (3 594．63±247．3 3) g·h～·ml and(3 847．99±692．03) g·h～ ·ml～．Conclusion The RP—HPLC method could be suitable for the determination of rats serum paracetamol and pharmacoldnetics researches．The main phanmcokinetic parameter~of paracetamol between the low—dose group and the medium-dose group were basically the ss．rne，different from those 0f the high dose D'oup，which might be related to the hi曲dosage． 【Key words】 Paracetamol；Pharmacokinetics；Plasma drug concentration；Reversed-phase high performance liquid chromatography；Rats 对乙酰氨基酚是临床上使用极其广泛的苯胺类 解热镇痛药，其过量使用和滥用引起的不良反应和严 重的肝毒性已日益引起人们的关注。与其他药物中 毒不同的是，对乙酰氨基酚血药浓度对指导治疗极为 重要，国外已将对乙酰氨基酚血浓度作为急诊中毒病 人常规检测⋯，但是我国在这方面的工作还没有引 起足够的重视。关于对乙酰氨基酚的研究，国内文献 报告较多的是各个剂型药物含量的测定，其血药浓度 测定以及药动学研究的报告相对较少，特别是关于急 性中毒的血药浓度检测分析的报告更是罕见。因此， 本实验通过建立RP—HPLC法测定大鼠血浆中对乙酰 氨基酚浓度，研究大鼠单剂量口服不同剂量(包括急 性中毒剂量)对乙酰氨基酚的药代动力学特征，为该 药临床应用提供参考依据。 FJ．200高速分散匀质机(上海标本模型厂制造)； QL一901旋涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公 司)；TGL一36G高速台式离心机(上海安亭科学仪器 厂)；LXJ一Ⅱ离心沉淀机(上海医用分析仪器厂)；BS310S 电子天平(北京塞多利斯天平有限公司)。SD大鼠，SPF 级，体重(25O±20)g，由广西医科大学实验动物中心提 供，实验动物使用许可证号：SYKG桂2003-0005。 1．2 药品与试剂 对乙酰氨基酚对照品(含量 99．5％，德国 Dr．Ehrenstorfer公司，Lot：40728)；茶碱 (含量 ≥99．5％，美 国 Sigma公司，Lot：12507283)。 对乙酰氨基酚片(每片含对乙酰氨基酚500 mg，中美 天津史克制药有限公司，批号：09050394)；甲醇(色 谱纯，美国 Fisher Scientific公司，Lot：083997)；实验 用水为双蒸馏水。 1 材 料 2 方法与结果 1．3 仪器与动物 高效液相色谱仪，包括 LC一30AT 工作泵和SPD-30A紫外检测器(日本岛津公司)； 2．1 色谱条件 色谱柱：Welchrom—Cl8(4．6 mill X250 mm， 5 txm，美国Welch公司)；保护柱：Phenomenex ClsODS 广西医学 2010年 2月第32卷第2期 (4 mm×3 mm)；流动相 ：甲醇 一水(20：80，v／v)；流 速：1．0 ml／min；紫外检测波长：248 nm；柱温：3OclC； 进样量：20 。 2．2 血浆样品处理 取大鼠血浆 100 Ixl置于1．5 ml 离心管中，加人 300 IXl的色谱 甲醇(内含内标物茶 碱)，漩涡震荡 2 rain后高速离心 (10 000 r／min) 10 min，分离上清液，吸取 20 l进样 ，峰面积内标法 定量分析。 2．3 方法学评价 0 1 2 3 4 S 8 7 8 9 1 0¨ 12 I3 Il l5 1 6 科 Ej i A 135 2．3．1 方法专属性：分取大鼠空白血浆、大鼠空白血 浆加对乙酰氨基酚标准品和大鼠口服对乙酰氨基酚 后的血浆，按照“2．2”项下血浆样品处理方法操作， 得到相应的色谱图，如图 1所示，对乙酰氨基酚和茶 碱完全分离，分离度大于 1．5，理论塔板数按对乙酰 氨基酚计大于4 000，对乙酰氨基酚、内标茶碱的保留 时间分别约为 7．2 rain、10．9 rain，血浆中杂质峰不干 扰对乙酰氨基酚的测定。结果表明：本方法具有较高 的专属性。 图1 对乙酰氨基酚血浆样品色谱 Fig 1 Chromatograms of paracetamol in plasma A为空白血浆，B为空白血浆 +对乙酰氨基酚，C为血浆样品 A—blank plasma，B—blank plasma paracetamol，C—sample plasma 2．3．2 标准曲线与线性范围：分别配制对乙酰氨基酚浓 标准血浆样品(血浆 中对 乙酰氨基酚浓度分别为 度为2．0 ml、10．0 rnl、50．0 ml、150．0 Hll、 250．0 Ixg／ml、500．0 Ixg／ml、700．0 g／ml的标准系列 血浆样品，按照“2．2”项下血浆样品处理方法操作，记 录待测物对乙酰氨基酚峰面积 (As)和内标峰面积 (Ai)，以As和Ai的比值(As／／Ai)为纵坐标，对乙酰氨 基酚的质量浓度(C，Ixg／m1)为横坐标进行线性回归， 结果得到 As／Ai=0．017C一0．0164，对乙酰氨基酚在 2．0—700．0 g／ml范围内线性关系良好(r：0．9997)， 最低定量限为2．0 g／ml。 2．3．3 精密度实验：分别配制低、中、高3种浓度的标准血 浆样品(血浆中对乙酰氨基酚浓度分别为 10．0 ml、 150．0 lag／m1．500．0~Jm1)，按“2．2”项下血浆样品处理 方法操作，测定峰面积，按回归方程计算实测浓度，考察 方法的13内变异和5 d内的日问变异，结果见表 1。 表1 大鼠血浆样品日内和日间精密度( ±s。n：5) Table 1 Wi~in．．day and between．．day precisions of parac．． etamol in rats plasma(x±s， =5) 1O．oo 1O．52±0．86 8．15 10．70±0．86 8．02 150．00 152．54 4-3．41 2．24 152．81±3．48 2．28 5o0．00 499．37±7．73 1．49 493．76±10．73 2．17 2．3．4 回收率实验：分别配制低、中、高 3种浓度的 10．0 g／ml、150．0 Ixg／ml、500．0 Ixg／m1)，每种浓度 平行配5份，按“2．2”项下血浆样品处理方法操作， 记录峰面积，以对乙酰氨基酚峰面积和内标峰面积的 比值代人标准曲线方程求算浓度，以测得浓度与加人 浓度比值计算相对回收率，结果见表 2。 分别配制低、中、高3种浓度的标准血浆样品(血浆 中对乙酰氨基酚浓度分别为10．0 oe／na、150．0 g／ml、 500．0 tJec'n~)，每种浓度平行配5份，按“2．2”项下血浆 样品处理方法操作，记录对乙酰氨基酚峰面积为A1；另 取以甲醇稀释相应浓度对照品溶液直接进样，记录峰面 积为A2。按公式：F=(A1／A2)×100％计算提取回收 率，结果见表2。 表 2 大鼠血浆样品相对 回收率和提取回收率( ±s，rt=5) Table 2 Relative recovery and extraction recovery of paracetamol in rats plasma( ±s，n=5) 2．3．5 稳定性实验：为考察血浆样品在采集后和贮存 中的稳定陛，分别测定了其在室温和一20℃冷冻条件 136 下的稳定性。分别配制低、中、高3种浓度的标准血浆 样品(血浆中对乙酰氨基酚浓度分别为 10．0 Ixg／ml、 150．0 Ixg／ml、500．0 g／m1)，各浓度血浆样品分别于 配制后 1 h,4 h,8 h、12 h和冷冻 1 d、3 d、7 d、14 d后 取出，解冻、提取测定。结果显示 RSD均小于 10％， 证明血浆样品在室温 12 h内是稳定的，在 一20~C冷 冻条件下至少可以保存 14 d。 2．4 药代动力学实验 SD大鼠24只，雌雄各半，体重 (250±20)g，随机分为低剂量组、中剂量组、高剂量组 (即按体重分别单剂量口服对乙酰氨基酚为300 mg／kg、 600 mg／kg、1200 m#kg)，每组8只。对乙酰氨基酚片用 生理盐水溶解稀释成浓度分别为25 mg／ml、50 mg／ml、 100 mg／ml的3种药液，3组大鼠禁食 14 h后分别按 Guan~xi Medicaf Jo~r／／,af，Feb．2010，Vo1．32，No．2 体重口服灌胃这 3种药液 1．20 ml／lO0 mg，于给药前 (0 h)和给药后 0．33 h、0．5 h、1 h、1．5 h、2 h、3 h、 4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、16 h和 24 h眼球取血约 0．3 ml，置于肝素化试管中，立即 3 000 r／min离心 10 min分离血浆，按“2．2”项下血浆样品处理方法操 作，测定血浆中对乙酰氨基酚的浓度，得到平均血药 浓度 一时间曲线，见图2。血药浓度数据采用中国药 理学会编制的3P87药代动力学程序经计算机自动迭 代拟合，以实测值与理论值比较及 AIC值判断，结果 显示 3组剂量对乙酰氨基酚在大鼠体内的药代动力 学过程均呈一级吸收的二室开放模型，主要药代动力 学参数见表 3。 表 3 3组剂量组对乙酰氨基酚药代动力学参数( ±s，n=8) Table 3 Pharmacokinetie parameters of paracetamol in three dose groups( ±s-n=8) 图2 3个剂量组对乙酰氨 基酚的平均血药浓度 一时间曲线 Fig 2 Mean plasma concentration—time curve8 of paracetamol in three dose groups 3 讨 论 本实验采用方便、实用的RP HPLC，以甲醇直接 沉淀血浆中的蛋白，所需血浆样品量小，经旋涡和离 心后直接取上清液进样分析测定，前处理过程操作简 便，在处理大批量血浆样品时可大大减少工作量和节 省时间。我们参照大量有关文献 曲J，从提取方法到 仪器分析的色谱条件本实验都做了较多的筛选和摸 索，使测定方法具有精密度高、重现性好、专属性强的 特点，药物与血浆中杂质具有较高的分离度，能满足 体内低浓度药物检测及药代动力学和生物利用度研 究的需要。 关于对乙酰氨基酚的研究，唐春萍等 观察了l0 名男性健康志愿者单剂量口服 500 mg，结果其药 一时 曲线符合口服吸收有滞后时间的一级动力学一室模 型，得到对乙酰氨基酚 的 T ／2k =(0．14-4-0．07)h， T1／2k。=(2．71±0．93)h。曾勇等 研究 6只Beagle 犬单次口服复方氨酚那敏缓释片 l片，结果显示对乙 酰氨基酚的消除均符合一室消除模型，得到 T1 为 (1．30±0．25)h，C 为(6．49±2．15) ml，T1／2k。为 (0．93±0．13)h。我们的研究显示乙酰氨基酚在大鼠 体内的药代动力学过程均呈一级吸收的二室开放模 型，其半衰期也相对较长。我们的一些数据，用一室 模型也能较好拟合，但拟合程度比不上二室模型，至 广西医学 2010年2月第32卷第 2期 于是否因为选择不同房室模型或由于动物种系不同 而引起药动学参数与这些文献存在较大差异，还需要 进一步的研究和证实。 本实验中，我们可以观察到对乙酰氨基酚300 mg／kg 剂量组和 600 mg,／kg剂量组的半衰期 (包括 T 和 Tl／2。)和清除率 C1／F基本相同。而 1 200 mg／kg剂量 组的消除半衰期 T]／2a却比上述两剂量组较长，清除率 也较小，且 AUC也不与其给药剂量成正比，推测其可 能原因是由于药物剂量的急剧增加导致其代谢的酶 途径饱和，消除半衰期随之延长。这样由于只有少量 的药物处于消除状态(即更多的药物被保留)，随着剂 量的增加 AUC并不成比例增加。或是由于药物剂量 急剧增加，代谢 产生过 量 的 N一乙酰对苯 醌亚胺 (NAPQI)，耗竭谷胱甘肽后导致肝细胞变性坏死，进 而抑制了与之代谢相关的酶系，致使药物半衰期延长 和清除率降低。我们在预实验中观察到单次 口服灌 喂 1 200 mg／kg时会诱发大鼠急性肝损伤，而本实验 1 200 mg／kg剂量组中反映药物消除速度的指标T。／2k 测相对较大，由此可以推测其消除半衰期的延长很可 能与对乙酰氨基酚中毒诱发的急性肝损伤有关。 对乙酰氨基酚在治疗剂量时，毒性很小，几乎没 有不良反应，已经逐渐取代了阿司匹林的解热镇痛作 用。对乙酰氨基酚为弱酸性药物(PKa为 9．5)，其在 胃肠道极易吸收l9 J，本实验中 3个剂量组的 T 和 c 均验证了此观点。临床上急性中毒患者的病情多 种多样，有时很难弄清是否服用了此药以及服药的具 体时间，此时血药浓度的检测就显得尤为重要。用 RP—HPLC法测定可疑中毒病人血中对乙酰氯基酚浓 137 度具有准确、快速的优点，可有效地帮助临床医生确 诊，防止漏诊 ，快速有效地救治患者，对提高医疗质量 有重大意义。 参 考 文 献 毕小平 ，谢 茵 ，张太强，等．光化学荧光法测定血浆中 对乙酰氨基酚的浓度[J]．山西医科大学学报 ，2007，38 (11)：1 002—1 004． 陈晓玲 ，熊灿琼 ，郭艳华 ，等．高效液相色谱法测定对乙 酰氨基酚栓 的含量 [J]．时珍国医国药，2006，17(7)： 1 208—1 209． 伏光华 ，刘梅娟 ，韩 静 ，等．高效液相色谱法同时测定 复方氯唑沙宗片中两组分血药浓度[J]．中国药学杂志， 2000，5(11)：763—765． 郭红英 ，王曼丽 ，赵志刚，等．对 乙酰氨基酚栓剂人体相 对生物利用度和生物等效性 [J]．中国新药杂志，2004， 13(9)：831—834． 王川平 ，任进民，亢泽坤 ，等．复方对乙酰氨基酚片在健 康人体的药代动力学和相对生物利用度[J]．中国临床 药理学杂志 ，2006，22(2)：130—133． 王 玉 ，张 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