大鼠全血中靛玉红的含量测定及其药动学研究

Strait Pharmaceutical Journal Vol 24 No．2 2012 2 注射用泮托拉唑钠的临床应用提示 通过临床观察可以看出，注射用泮托拉唑钠与上述 15种 药物确实存在配伍禁忌，临床用药建议：①护士在进行护理操 作前，要向处方医师。确认无误后方可执行医嘱。②在操 作中，不仅要注意同一液体瓶内药物的化学配伍禁忌问，还 要注意不同液体瓶药液在输液管内相遇时可能发生的化学反 应。③在临床输液中，应避免连续使用，如需联用，可于两组 液体之间换输氯化钠溶液或其他液体，以便将输液管内药液 冲洗干净；避免两种药物连续使用发生不良反应；用药过程 中。经常巡视病房，密切观察，发现问题及时处理。④临床中， 在我们使用任何两种药物时都应仔细观察及核对，以便发现 更多的在之前的护理工作中或文献中尚未见到的药物配伍禁 忌，以防发生意外，确保患者生命安全。提高护理质量。 参考文献 (1]王芳 ．酚磺乙胺注射液与泮托拉唑存在配伍禁忌(J]．医学理论 与实践，2009。22(4)：404． [2]朱静 ．注射用泮托拉唑与盐酸 甲氧氯普胺配伍禁忌(J]．医学信 息。2010。05：1151． 【3]商江丽，齐海妮 ．泮托拉唑、奥美拉唑与盐酸氨溴索存在配伍禁忌 [j]．中国误诊学杂志，2010，lO(18)． [4】朱婷 ．注射用泮托拉唑与 10％葡萄糖注射液存在配伍禁忌 【J]． 中国误诊学杂志，2010。10(9)：2032． ·药 理 · [5)王小红 ．注射用泮托拉唑与维生索 B6注射液存在配伍禁忌(J]． 华北国防医药。2008。20(3)：92． [6J伊丽萍 ．注射用泮托拉唑与乳酸左氧氟沙星之间的配伍禁忌 (J]． 医药世界，2009．11(12)：773． 【7]杨艺婷 ．注射用泮托拉唑钠与硫酸阿米卡星注射液存在配伍禁忌 【】)．医药世界，2009，11(8)：415． 【8]刘莎娜，李复，谢力 ．泮托拉唑与谷氨酸钠存在配伍禁忌 【J)．护 理学杂志，2009。24(9)：92． 【9]薛文华，杨海英。王卫卫，彭溢 ．泮托拉唑钠与注射用胸腺肽存在 配伍禁忌(J]．中国误诊学杂志，2010，10(34)：8334． (1O3苑士美 ．甲磺酸帕珠沙星氯化钠注射液与注射用泮托拉唑钠存 在配伍禁忌一例报告(J]．实用心脑肺血管病杂志。2011，19(1)： 20． (111吴春香 ．肌苷氯化钠注射液与注射用泮托拉唑钠存在配伍禁忌 (J]．全科护理，201l，9(205)：325． (12】王慧娟 ．注射用泮托拉唑钠与注射用白眉蛇毒血凝酶存在配伍 禁忌[J]．中国误诊学杂志，2011，II(1)：8． [13]范雪琴 ．注射用复方骨肽与泮托钠唑存在配伍禁忌(J】．中国误 诊学杂志，2011，11(5)；1078． (14]王晓岩 ．注射用泮托拉唑钠与注射用果糖二磷酸钠存在配伍禁 忌[J]．解放军护理杂志，2010。27(2A)：165． (15]孙风华，王书秀 ．注射用泮托拉唑钠与恩丹西酮注射液存在配伍 禁忌[J]．中国误诊学杂志，2010，10(9)：2032． 大鼠全血中靛玉红的含量测定及其药动学研究 孟宪书，郝小丽，何 淋，黄罗生 ，富志军 (中国药科大学 南京 211198) 摘要：目的 建立大鼠全血中靛玉红含量测定方法及大鼠体内靛玉红的药动学行为研究。方法 采用超声、碱化及液．液萃取等方法处理全 血样品；色谱条件：GLODSC18(4．6×250mm，5“m)色谱柱，流动相为甲醇．5％甲酸(68：32。v／v)，流速：lmL·min一。检测波长 289nm为检测条 件；以5．6mg·kg 的剂量大鼠尾静脉 i．v．和200mg·kg 的剂量大鼠i．g．给药，采用非那雄胺为内标物，测定给药后全血中靛玉红的含量并用 DAS 2．1．1软件计算药动学参数。结果 靛玉红在5．55—1l L0ng·mL 的浓度范围线性关系良好，最低定量限为5．55ng·mL_。，提取回收率 71．8±6．4％～80．7±6．5％；大鼠灌胃和静脉注射给药后其体内药动学过程分属二室模型和三室模型．绝对生物利用度 l0．I9％。结]沦 实验 表明本法操作简单，灵敏度高．重现性良好．结果准确可靠，可以用于大鼠体内靛玉红的药动学行为研究。 关键词 ：HPLC；靛玉红；大鼠；全血样品；药动学 中图分类号：R969；R927．2 文献标识码：A 文章编号：1006—3765(2012)．02．0023 04 Determination of indirubin in rat whole blood and its pharmacokinetics study MENG Xian-shu，HAO Xiao—li，HE Lin，Huang Luo—sheng ，FU Zhi—jun (China pharmaceutical university，Nanjing Jiangsu 2I1198，China) 作者简介：盂宪书，男(1986．7一)。中国药科大学2009级硕士研究生(在读)。联系电话：15851871796，E．mail：mttnt2OO2@163．c。m *通讯作者：黄罗生，联系电话：025。84520679，E mail：huangluosheng@hotmail．corn；富志军，联系电话：025．83323238，E mail：fozh~un56@ya hoo．com．cn · 23 · 海峡药学 2012年 第 24卷 第2期 ABSTRACT：OBJECTIVE To establish fl HPI C method。to determined the content of indirubin in rat whole blood sample，and study the pharmacokinetics activity of indirubin in vivo．METHODS The whole blood sample was pre-processed by ultra—sonic extraction。alkalization and liquid—liquid extraction．Chromatographic conditions were using a reverse—phase GI ODS column(4．6×250mm，5 m)，with a mixture of methanol一5％ formic acid(68 ：32，v／v)as mobile phase at a flow rate of 1．0mI ·min_。and UV detection at 289nm．Pharmacokinetics study was conducted by determ ination of indrubin in whole blood sample and calculated the pharmacokinetics parameters after i．V．and i．g．administration at dose of 5．6mg‘kg一 and 200mg‘kg一 。respectively．RESUL The calibra— tion curve of indirubin was linear at a range of 5．55～ 11 10ng·mI 一 ．The lower limit of quantification was 5．55ng·mI 一 ．The extraction recovery was 71．8±6．4％ ～ 80．7±6．5％ ．The absolute bioavailability of indiru． bin was 10．19％ ．CoNCLUSIoN The present HPI C method was specific．simple and sensitive for determination of indirubin in rat whole blood sample and successfully estimated the pharmacokinetics parameters and bioavail— ability of indirubin． KEY WORDS：HPLC；Indirubin：Rat；Whole blood sample；Pharrnacokinetics 靛玉红(Indirubin)又名炮弹树碱 B，系双吲哚类生物碱， 主要来源于十字花科植物菘蓝(Isatis tinctoria L．)、爵床科植 物马 蓝 (Baphicacom cusia Brem．)和 玉 蕊科 植 物 炮 弹 树 (Couroupita guianensis Aub1．)。靛玉红是治疗慢性粒细胞性 白血病的传统中成药当归龙荟丸中有效组分青黛的主要活性 成分(“，具有选择性抑制肿瘤细胞 DNA合成( ，改变细胞膜 通透性C3}及抑制周期蛋白依赖激酶(cylin—dependent kinases， CDKs)HJ等多种药理活性。 目前靛玉红的检测手段主要有放射标记法和 HPLC法， 前者设备要求高、灵敏度较差，后者灵敏度高、专属性较好，故 被广泛使用c 。现已报道的 HPLC测定方法分别以血浆【‘-’] 和血清 【8】为样品检测大鼠静脉给药后靛玉红血药浓度，尚无 关于大 鼠灌胃给药后血药浓度测定的报道。靛玉红口服吸收 差【9J。血药浓度低。采用血浆作为检测样品需要较大取血量。 本实验首次使用 HPLC对大鼠灌胃后全血中靛玉红含量进行 测定．采用液一液萃取法对样品进行处理，分别对大鼠尾静脉 注射给药和灌胃给药后的靛玉红血药浓度进行测定并计算其 药动学参数和口服生物利用度。 1 1．1 仪器 岛津 Shimadzu Lc2O1O—HT高效液相色谱仪(含 四元泵．在线脱气机，UV检测器，柱温箱。自动进样器，LC Solution工作站)；湘仪 TGL-16高速台式冷冻离心机；Dragon Lab MX—S型涡旋混匀器；Thermo Finnpipette移液器。 1．2 试剂和药品 靛玉红(批号：110717—200204；供含量测 定用)、内标物非那雄胺(I．S．)品(批号：10611—200301； 供含量测定用)均购自中国药品生物制品检定所；靛玉红原料 药购自杭州华东医药集团康源制药有限公司(批号：110101； 纯度≥90％)；甲醇为色谱纯(江苏汉邦科技有限公司)；水为 超纯水；其他试剂均为纯。 1．3 动物 雄性 SD大鼠．体重(300±10g)，由江苏大学实 验动物中心提供．合格证号：SCXK(苏)2009—0002。 2 方法与结果 · 24 · 2．1 色谱条件 色谱柱为GLODSCl8(4．6X250rnm。5tLm)； 流动相为甲醇一5％甲酸(68：32，v／v)；流速 ：1mL·rainI1；检测 波长289nm；柱温 35℃；进样量 2OraL。 2．2 标准品储备液和内标溶液的配制 标准品储备液：精密 称取靛玉红标准品适量。加甲醇制成每 1mL含 11．Igg的溶 液。 内标溶液：精密称取内标物非那雄胺适量。加甲醇制成每 lmL含 99 g的溶液。 2．3 生物样品处理方法 取冻存全血，室温下解冻；冰浴下， 超声破碎处理，制备成全血样品，备用。取处理好的全血样品 400~L，置 lOmL离心管 中。内标 液 40 L。涡旋 1min；加 入 lmol·L NaOH溶液 50t~L，涡旋 imin；加入乙酸乙酯 3mL， 立即振摇后。涡旋 10min；4500r·rain 离心 10min。取上层有 相机2．55mL；重复萃取 1次，合并萃取液，40℃水浴吹干；残 渣用 IO0~L流动相复溶。14000r·min*1离心 5min，取上清液， 备用。 A C 圉 1 A．空白全血 B．对照品 +内 标 C．给药全血(1．I．s．；2．靛 玉红 ) B 2．4 方法学 2．4．1 系 统 适 应 性 和 专 属 性：靛 玉 红 的 保 留 时 间 约 22．5min。内标物非 那雄胺的 保留时间约为 13．0min。全血 空白对样品测定无干扰。全血 空白样品、全血空白加药样品 和给药后全血样品的色谱 图 (见图 1)。以靛玉红和非那雄 胺的色谱峰计。理论塔板数均 Strait Pharmaceutical Journal Vol 24 No．2 2012 不低 3000，分离度 R>1．5，能够满足样品分析检测要求。 2．4．2 标准曲线和线性范围：精密吸取靛玉红储备液适量， 分别 加 甲醇制 成 浓度 为 11．1，5．55，1．11。0．555，0．222。 0．111和 0．0555／．tg·mL 的靛 玉红 标准 品溶 液，分 别取 40 L，加入到 400~L全血 中，涡旋混 匀，配制成血药浓度 为 5．55，11．1，22．2，55．5，111，555。lll0ng·mL 的全 血样 品， 按 2．3．项下步骤操作。以靛玉红和内标物非那雄胺的峰面 积的比值 Y对靛玉红的浓度 c进行线性回归。权重系数为 1／ C2，得到回归方程为 Y=0．0375X+0．00237．R2=0．997。表 明靛玉红血药浓度在 5．55～lll0ng·mL 范 围内呈现良好 的线性关系。最低定量限为 5．55ng·mL—i o 2．4．3 提取回收率：分别取高、中、低 3个浓度的靛玉红标准 品溶液各 40t~L，加入到 400tLL空白全皿中，涡旋混匀，分别配 制成为血药浓度为 22．2，111，555ng·mL 的全血加药样品。 按 2．3项下步骤进行操作，测定全血加药样品中靛_臣红和内 标物的峰面积，每个浓度平行做 3份。另取此三个浓度的标 准品及内标液各 40t~L，加甲醇至 lOObtL，20ⅡL进样，每个浓度 平行 3份。 提取回收率=稀毒 蕹耋鲁 ×100％ 高中低 3个浓度的提取回收率分别 为 71．8±6．4％， 79．8±2．5％和 8O．7±6．5％；内标物非那雄胺的回收率为 78．3±1．1％％，均满足样品分析检测要求。 2．4．4 精密度 ：分别取高、中、低 3个浓度的标准品溶液及 内 标液各 40止 ，加入到 400}￡空白全血中，分别配制成为血药浓 度为22．2，III，555ng·mL_1的全l血加药样品。按 2．3项下步 骤进行操作。测定全血加药样品中靛玉红和内标物的峰面积， 每个浓度平行做 6份，连续测定3d，结果(见表 1)。 衰 l 全血样品精密度结果 In=6) 2．4．5 稳定性：配制高、中、低 3个浓度的全血加药样品，分 别进行短期稳定性、冻融稳定性和制备后室温放置稳定性试 验。短期稳定性是将配制好的全血加药样品在室温下放置 6h后，按 2．3项下步骤进行操作；冻融稳定性是将已制备的 全血加药样品 一20℃冷冻保存 24h后，在室温下使其解冻，按 2．3项下步骤进行操作 ；制备后室温放置稳定性是全血加药 样品按 2．3项下步骤进行操作后，将所得样品在室温下放置 12h后进行测定。以上 3组稳定性实验，每个浓度平行 5份， 结果(见表 2)。 2．4．6 药动学应用：①给药方案；SD大鼠5只。体重 300± 10g，禁食过夜。按 200rag·kgI1(DMSO：H2O 10：90，v／v)剂 量灌 胃给药，分别在灌胃前和灌胃后 2、4、8、12、14、16、18、 24、36、48、72h眼眶静脉取血 0．5mL于 1．5mL肝索化 EP管 中，一20℃冷冻保存，备用。SD大鼠 5只，体重 300±10g，禁 食过夜。按 5．6mg·kg-1(DMSO：PEC-400：0．9％ NaC1 0．5： 45．5：‘50．v／v／v)剂量尾静脉注射给药，分别在注射前和注射 给药后 2rain、5min、10rain、20rain、40min、lh、2h、3h、4h、5h眼 眶静脉取血 0．5mL于 1．5mL肝索化 EP管中。一20℃冷冻保 存，备用。②样品处理及药动学参数计算；取冻存全血，按 2．3．项生物样品处理方法步骤操作。用 DAS 2．1．1程序拟 合并计算药动学参数，结果表明靛玉红灌胃后体内药动学过 程符合二室模型，尾静脉给药后体内药动学过程符合三室模 型．主要药动学参数(见表 3)；经 DAS 2．1．1程序拟合后的灌 胃和静注后大 鼠全血中的靛玉红血药浓度时间一曲线(见图 2)。 表 2 全血样品稳定性结果 (n=5 J 稳定性 ——————垒 坚 竺壁圭垒旦 ——— 22 ． 2ng·mL一 lllng·mL一‘ 555ng·mL 裘 3 i-v_s．6mg·kg-1及 i．g．200rag·kgI1给药后的平均药动学参数 l11=5) B 圉 2 A．大鼠 i．v．5．6mg·kg 给药后全血中靛玉红 C-t曲线圉； B．大鼠i．g．200mg·kg-1给药后全血中靛玉红 C-t曲线田【n=5l 3 讨论 靛玉红 口服后血药浓度较低，如使用 HPLC测定血浆中 的靛玉红含量，需要加大取血量才能满足测定要求，但取血量 过大容易导致大鼠死亡并会到影响大鼠体内正常的代谢活 动。有报道称由于靛玉红水溶性差，大量聚集于血细胞内【7J， 后经预实验证实，故本实验选择检测全血样品中靛玉红含量 的方法。 全血样品内源性干扰较多。所以在优化样品处理方法时 曾尝试采用蛋白沉淀、酸化及碱化等多种方法处理样品，实验 表明采用 1tool·LI1氢氧化钠溶液碱化，除杂效果最好。可满 · 25 · 海峡药学 2012年 第 24卷 第 2期 足测定要求。在此基础上考察了氯仿、二氯 甲烷 、叔_r基甲 醚、环己烷 、正己烷、正庚烷 、乙酸乙酯、丙酮等多种有机溶剂 的萃取效果．其中乙酸乙酯萃取效率最高，可满足分析测定要 求。故本实验选择 lmol·L 氢氧化钠溶液作为碱化试剂，乙 酸乙酯作为萃取溶剂。 大鼠灌胃靛玉红后的血药浓度达峰时间 T 诅x为 16．4h， 可以看 出靛 玉红吸收较为缓慢，并且血药浓度 C。～ 仅为 0．022±0．01mg·L一1，绝对生物利用度只有 10．19％。造成这 种现象 的原 因可能与首过效应以及靛玉红的水溶性差有 关[6]。 综上所述．采用超声、碱化及萃取等方法对大鼠全血样品 进行处理．可有效去除杂质、减少采血量，经本法处理的血样 可满足实验及分析要求。方法操作简便、重现性好。为研究 靛玉红大鼠体内药动学过程提供了一个简便可靠的方法。 参考文献 (1】Ralph Hoessd，Sophie Leehrc．Jane A．Endicott et a1．Indirubin．the active constituent of a Chinese antileukaemia medicine，inhibits cyclin． dependent kinases【J]．Nature Cell Biology．1999．1：60-67． [2]张镭．吴冠芸，邱长春。等 ．靛玉红治疗慢性粒细胞自血病疗效原 理的研究 ．Ⅵ．靛玉红对无细胞体系 DNA合成的抑制作用(J]． 中国医学科学院学报。1985，7(2)：112—116． [3]王学琦。甘午君，杨天楹．等 ．靛玉红对慢性粒细胞 白血病细胞表 面的作用【J)．天津医药，1984．12：707．710． [4]王通，曾耀英，肇静娴，等 ．靛蓝和靛玉红对小鼠T细胞活化与增 殖的影响[J]．中国药科大学学报，2005，36(5)：444．447． (5】李长玲，藉秀娟 ．靛玉红及其乙基和十八烷基衍生物在动物体内 命运的比较【J]．药学学报，1983，18(5)：332—338． (6]X．Y．Deng，S．N．Zheng．G．H．Gao et a1．Determination and pharma— cokinetlc Study of indirubin in rat plasma by high-perfofine．ice liquid chromatography[J)．Phytomedicine，2008，15(4)：277·283． (7】李珂佳，蒋学华 ．RP-HPLC测定大鼠静脉注射靛玉红后的血药浓 度(J]．华西药学杂志，2007．22(3)：333．334． (8)殷志爽，王维聪，游远，等 ．HPLC测定大鼠血清中靛玉红的含量及 其药代动力学研究(J]．中国中药杂志，2010，35(9)：1148．1151． (9]周静，吴正红，平其能，等 ．靛玉红磷脂复合物的制备及理化性质 研究(j]．中国医药工业杂志，2006，37(6)：394．397． 新疆紫草水提部位对小鼠 T淋巴细胞亚群和血液学指标的影响 米克热帕·阿布都买买提 一，买尔旦·马合木提 ， ，古丽仙·胡加‘(1．新疆医科大学附属肿瘤医院 乌鲁木齐 83001 1；2．新疆医科大学药剂教研室 乌鲁木齐 83001 1) 摘要：目的 观察新疆紫草水提部位对免疫抑制小鼠的免疫调节作用。方法 以腹腔注射环磷~ -(CTX)制造小鼠免疫抑制模型，应用新疆 紫草水提部位给小鼠连续灌胃15天，经流式细胞仪对小鼠T淋巴细胞亚群进行测定，用血细胞分析仪测定血液学指标。结果 新疆紫草水提 部位能显著增加免疫低下小鼠的CD；、CD4+T淋巴细胞的百分含量，增高cD ／cD 比值．降低CD／T淋巴细胞的百分含量；同时提高血液中红 细胞、白细胞、淋 巴细胞计数和提高血红委白量、淋巴细胞百分比。结论 新疆紫草水提部位可以有效地调节机体的兔疫功能。 关键词：新疆紫草；T淋巴细胞亚群；血液学指标；流式细胞仪 中图分类号：R969 文献标识码：A 文章编号：1006．3765l2012)．02．0026．03 Effects of water extraction s ite of Arneb ia euchroma(Roya1)Johnston on subgroups of T lymphocytes and haematological Indexes in mice Mikerepa·Abudumaimaiti ，Maierdan·Mahemuti ’孙 ，gulixian·hujia (1．The tumor Hospital affiliated to Xinjiang Medical University，Urumqi 83001l，China；2．Department of pharmaceutics，Xinjiang Medical University，Urumqi 8300112，Chian) ABSTRACT：OBJECTIVE To investigate the Immunomodulatory effects of water extracts from Arnebia euchro— ma(Roya1)Johnston(AE)OD immune deficil mice．METHODS The immune deficit mice modal were induced with cyclophosphamide(CTX)by ip．The water extracts of AE were given to the mice by ig for 1 5 days continu一 作者简介：米克热帕·阿布都买买提．女。硕士研究生。研究方向：中药民族药研究。联系电话：15292852913。E-mail：mkrpyl(~126．eom 通讯作者：买尔旦·马合木提，男(维吾尔族)。教授，硕士生导师。主要从事中药民族药的开发工作。联系电话：09917968007。E．mail：maierdan60 @sina．com 基金项目：国家自然科学基金(项目编号：81060356) · 26 ·