瑞舒伐他汀钙胶囊人体生物等效性研究

武警医学2012年7月第23卷—第7期—edJChinPAP．垫：!』!!瑞舒伐他汀钙胶囊人体生物等效性研究郭结，史小四，朱哲，王惠，强烈应567【摘要】目的评价瑞舒伐他汀钙胶囊在健康人体中相对生物利用度及生物等效性。方法随机、自身双交叉、单剂量口服试验制剂或参比制剂10mg，采用液相色谱一串联质谱(LC—MS／MS)法测定血浆中药物浓度，药动学参数采用DAS软件处理获得。结果两种制剂峰浓度(C⋯)分别为(7．32±4．21)ng／ml和(7．37±3．23)ng／ml，达峰时间(Tm)分别为(4．3±1．3)h和(3．4±1．6)h，半衰期(t)分别为(11．57±8．18)h和(10．70±5．26)h，0～t药时曲线下面积(AUCo)分别为(64．8±28．0)rig／(m1．h)和(71．0±28．0)ng／(m1．h)，0～o。药时曲线下面积(AUCo)分别为(66．1±28．3)ng／(m1．h)和(72．2±28．8)ng／(m1．h)；相对于参比制剂，试验制剂的生物利用度为(93．2±18．5)％(以AUC。一计)、(93．6±17．6)％(以AUC。一计)。试验制剂和参比制剂的C、AUC。和AUC。一经对数转换后进行方差分析，两制剂间差异无统计学意义。结论试验制剂瑞舒伐他汀钙胶囊和参比制剂瑞舒伐他汀钙片具有生物等效性。【关键词】瑞舒伐他汀；生物等效性；液相色谱一串联质谱【中国图书分类号】R969．1BioequivalenceoforalrosuvastatincalciumcapsulesinhealthyvolunteersGUOZhe，SHIXiaosi，ZHUZhe，WANGHui，andQIANGLieying．DepartmentofPharmacy，SecondHospitalofBeijingMunici—palCorps；ChinesePeoplegArmedPoliceForces，Beijing100037，China【Abstract】ObjectiveTostudythebioavailabilityandbioequivalenceofthetestedandreferencerosuvastatincalciumcap—sulesinhealthymalevolunteers．MethodsAccordingtothecrossoverdesign，eachvolunteerwasorallygiven10mgrosuvastatincap·sulesortablets．TheplasmaconcentrationsweredeterminedbyLC／MS／MS．PharmacokinetieparameterswereobtainedusingDASpro—gram．ResultsC⋯were(7．32±4．21)ng／mland(7．37±3．23)ng／ml，T⋯were(4．3±1．3)hand(3．4±1．6)h，Tl／2were(11．57±8．18)hand(10．704-5．26)h，AUC0一were(64．8±28．0)ng／(ml·h)and(71．0±28．0)ng／(ml·h)，AUC0一were(66．1±28．3)and(72．2±28．8)ng／(ml·h)，respectively．Therelativebioavailabilitywas(93．2±18．5)％inAUC0一tand(93．6±17．6)％inAUCn一．ThedataofthereferenceandtesteddrugswerenotdifferentasshownbyFtest．ConclusionThero—suvastatincalciumcapsulesandrosuvastatincalciumtabletsarebioequivalent．【Keywords】rosuvastatin；bioequivalence；LC／MS／MS瑞舒伐他汀是一种选择性、竞争性的HMG—CoA还原酶抑制药，可通过抑制内源性胆固醇的合成而发挥明显的降血脂和抗动脉粥样硬化的作用。本试验以阿斯利康制药有限公司上市原研药瑞舒伐他汀钙片为参比制剂，研究浙江京新药业股份有限公司研制的瑞舒伐他汀钙胶囊的人体生物利用度及生物等效性。1仪器和1．1仪器13本ShimadzuTechnologiesInc．20A—UFLC高效液相色谱系统(包括LC一20AD溶剂输作者简介：郭酤，女，1959年出生。本科学历，主任药师。主要从事临床药学工作。作者单位：100037，武警北京总队第二医院药剂科送泵、SIL一20AHT自动进样器、CTO一20A柱温箱、CBM一20A系统控制器、DGU一20A3在线脱气机)；美国AppliedBiosystemInc．API3200型三重四极杆串联质谱联用仪，配有电喷雾离子化源(ESI)及An—alyst1．4．2数据处理软件；天津奥特赛恩斯仪器有限公司MTN一2800D氮吹浓缩装置；科大创新股份有限公司中佳分公司SC一3616台式低速离心机；海门市其林贝尔仪器制造有限公司QB一600型高速振荡混合器。1．2药品供试制剂(T)：瑞舒伐他汀钙胶囊(浙江京新药业股份有限公司，5mg／粒，批号：1011151)；参比制剂(R)：瑞舒伐他汀钙片(商品名：可定；阿斯利康制药有限公司，10mg／片，批号GC872)；瑞舒伐他汀钙对照品(浙江京新药业股份有限公司提供，批号：20070103A，含量为97．23％)；内标克拉霉素对照品(购自中国药品生物制品检定568武警医学2012年7月第23卷第7期MedJChinPAPF，Vo1．23，No．7，July，2012所，批号：130558—200501，含量为99．0％)。1．3试剂空白血浆：航天中心医院输血科提供或来自于健康受试者。甲醇为色谱纯(Fisher，批号：101437)。2方法与结果2．1受试者、给药及样品采集2O名男性健康受试者，年龄(24±3)岁，体重指数(19～24)；受试者均无药物和食物过敏史，无呼吸道、消化道、内分泌、心血管等病史；试验前2周内未服任何药物，3个月内未参加过药物临床试验和献血；受试前经体检心脏、肝、肾功能均正常；无烟酒嗜好；自愿签署知情同意书¨。试验于2011—01至201l一03完成。20名受试者按单剂量自身双交叉对照设计被随机分为试验组(T)、对照组(R)两组。第1周期：两组受试者分别口服试验制剂和参比制剂，经清洗期2周。第2周期：两组受试者分别口服参比制剂和试验制剂。受试者于试验前1天下午人I期临床试验病房，禁食不禁水约12h_lJ，于第2天早晨空腹口服试验制剂或参比制剂10mg，分别于服药前(0h)及服药后0．5、1．0、2．0、3．0、4．0、5．0、6．0、8．0、10．0、12．0、24．0、36．0、48．0、72．0h于上肢静脉取血约4．0ml，置肝素抗凝管中放置1h，2500r／rain离心10rain，分离血浆置一7O℃冻存，备用。20例健康志愿者除1例脱落退出试验外均完成全部试验。2．2检测方法与样品的处理2．2．1色谱与质谱条件色谱柱：Shim—PackVP—ODS柱(5Ixm，150mm×2．0intoI．D，日本岛津公司)，柱温：30℃；流动相：甲醇一5mmol／L乙酸铵(含0．5％甲酸)(65：35，V／v)，流速：0．3ml／min；进样量：7l。离子源：多重反应监测(MRM)，瑞舒伐他汀：[M+H]+，m／z482．2一m／z258．2，克拉霉素：[M+H]+，m／z748．5一m／z158．4；离子喷雾离子化源(ESI)，离子Spray电压：5300V；550；源内GS1(N2)：50psi；GS2(N2)：60psi；帘Gas(N2)：20psi；解簇电压(DP)63V和45V，碰撞能量(CE)47eV和3OeV；碰撞气CAD(N2)：3psi；Q1分辨率为u—NIT，Q3分辨率为LOW。2．2．2对照品溶液及内标溶液的配制精确称取瑞舒伐他汀钙对照品5．34mg，加甲醇一水(1：1，v／V)于lOm1容量瓶中溶解，定容至刻度，浓度相当于500．0g／ml的瑞舒伐他汀母液。精确量取瑞舒伐他汀母液300l于5ml容量瓶中，加甲醇一水(1：1，v／V)定容至刻度，配制成浓度为30．0g／m1的瑞舒伐他汀储备液，分别用甲醇一水(1：1，V／V)稀释至300．0、240．0、150．0、50．0、15．0、5．0、1．5、0．5ng／ml。精确称取克拉霉素对照品6．06mg，用甲醇溶解于10ml容量瓶中并定容至刻度，配制成浓度相当于600．0ml的克拉霉素母液。以甲醇一水(1：1，V／V)将母液稀释至浓度为10．0rig／ml的克拉霉素内标溶液100ml，于4℃冰箱中保存。2．2．3血样处理血浆300Ixl，精密加入内标溶液120Ixl，甲醇一水(1：1，V／V)301、0．05mol／L乙酸水溶液200Ixl、乙醚一二氯甲烷(3：2，V／V)溶液3ml，涡流30S，振荡10rain，3500r／rain离心5rain，取上清液在40C《=恒温浴，用N2吹干，残渣用150l甲醇水溶解，涡流30s，全部溶液转移至进样瓶中进行HPLC—MS／MS测定。2．3方法学的评价2．3．1方法专属性分别取6个不同来源的空白血浆各300Ix]，以等体积的甲醇一水(1：l，V／V)代替内标溶液，按“2．2．3血样处理”项操作，得到色谱图，其中1个空白血浆样本处理后的色谱图见图1A；取瑞舒伐他汀浓度为0．05ng／rnl的SD血浆样本，按“2．2．3血样处理”项操作，得色谱图1B；取1名受试者给药后收集的血浆样本，按“2．2．3血样处理”项操作，得色谱图1C。结果明，瑞舒伐他汀和克拉霉素的保留时间分别约为3．49rain和2．70rain，空白血浆中的内源性物质不干扰瑞舒伐他汀和内标克拉霉素的测定。2．3．2曲线与定量下限取适量血浆，加入不同浓度的对照品溶液，内标溶液及其他溶液，按“2．2．3血样处理”项下操作，以血浆中待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权(w=i／x)最小二乘法进行回归运算．¨2j，求得的直线回归方程，y--'m0．199x+0．000722(r=0．9984)，即为工作曲线。每个分析批建立一条工作曲线，每浓度2样本，连续测定3个分析批。血中瑞舒伐他汀的最低检测限为0．5000rig／ml。2．3．3精密度与准确度试验精确配制瑞舒伐他汀，使其浓度分别为0．150、1．50、24．0ng／ml(低、中、高)的QC样本血样，按“2．2．3血样处理”项下操作处理后进样测定，每浓度6样本，连续测定3个分析批，以同一分析批的标准曲线计算QC样本的浓度，根据Qc样本的测定结果，计算方法的准确武警医学2012年7月第23卷第7期MedJChinPAPF，Vo1．23，No．7，July，2012一蓉一骥靛一誉一醺霞Max．13．8cps482．2—258_20．51．5253．5f／In_m0．51．52．53．5一一骥靛罂AB一善一骤靛罂CMax．4．9cps．748．5—}158．4O．51．52．53．5l／rainIVlaX．．oe4cps．z．、、748．5—158．43／O．5l52．535t／minMax．19e4cps．2．79748．5—÷158．4^Ⅱj／0．51．52．53．5569图1瑞舒伐他汀和内标克拉霉素的典型MRM色谱图A：空白血浆；B：瑞舒伐他汀浓度为0．0500rig／ml的SD01血浆样本加入克拉霉素内标溶液(10．0ng／m1)；C：01一II一07点血浆样本加人克拉霉素内标溶液(10．0ng／m1)。I：瑞舒伐他汀；Ⅱ：克拉霉素度与精密度。批内相对标准偏差(RSD)分别为6．3％、3．2％和4．1％，批问RSD分别为10．1％、0．7％和2．1％。2．3．4提取回收率试验精确配制瑞舒伐他汀，使其浓度分别为0．15、1．50、24．0ng／ml(低、中、高)的QC样本血样，每浓度6样本，按“2．2．3血样处理”项下操作，获得瑞舒伐他汀和克拉霉素的峰面积。同时另取空白血浆300l，以等体积的甲醇一水(1：1，v／v)代替内标溶液，按“2．2．3血样处理”项下操作，残渣中分别加入3个浓度为1．50、15．0、240．0ng／ml(低、中、高)的Qc溶液30l和内标溶液120I*1，每浓度6样本，涡流30S，全部转移至进样瓶中进行HPLC—MS／MS定量分析，获得瑞舒伐他汀的峰面积和克拉霉素的峰面积。以每一浓度前种处理方法所得瑞舒伐他汀的峰面积(各6个样本)除以后种处理方法所得瑞舒伐他汀的平均峰面积(每浓度6个测定值的平均值)，计算瑞舒伐他汀提取回收率及内标克拉霉素提取回收率。其中低、∞印印0∞∞∞加∞0∞∞如加0一兽一醺莨∞舳∞加0∞∞∞∞0∞踟加如加0一长一世骥捉罂570武警医学2012年7月第23卷第7期MedJChinPAPF，Vo1．23，No．7，July，2012中、高3个浓度血浆样本中瑞舒伐他汀的提取回收率分别为(92．6±4．6)％、(87．9±1．5)％和(88．7±2．4)％，平均提取回收率为(89．7±3．6)％，血浆样本中内标克拉霉素的提取回收率为(82．3±2．2)％。2．3．5稳定性试验精确配制瑞舒伐他汀，使其浓度分别为0．150、1．50、24．0ng／ml(低、中、高)的Qc样本血样，每浓度3样本，分别于室温下放置8h、一20℃冷冻、室温融化，于放置前后和冻融前、冻融3次和一20℃冷冻放置24d，按“2．2．3血样处理”项下操作处理后进行测定，根据测定结果进行稳定性的计算J。所有的测定浓度与理论浓度的相对误差(RE)均在4-15％以内，表明血浆样本在室温下放置8h内、反复冻融后及血浆样本冻存24d稳定。2．3．6未知血浆样本的测定及质量控制按“2．2．3血样处理”项下操作，第1、2、3、4分析批分别测定1—5，6、8～11，12—16和17～20号受试者的未知血浆样本，所有未知样本和QC样本的测定均按既定顺序，连续4个分析批完成。以同一分析批的工作曲线计算未知样本的浓度。每个分析批随行低、中、高(0．150、1．50、24．0ng／m1)3个浓度的QC样本。相同浓度的QC样本为一组，每个分析批测定3组Qc样本。未知血浆样本的测定和质量控制：第1、3分析批各有1个高浓度Qc样本的测定浓度与理论浓度的RE大于15％(小于20％)，其余QC样本的测定浓度与理论浓度的RE均在4-15％以内，表明所有未知样本的测定结果准确可靠。采用DAS2．1．1软件处理血药浓度一时间数据，用非房室模型方法计算药代动力学参数。达峰时间(T⋯)、峰浓度(C)用实测值表示，用梯形法计算曲线下面积(AUC)。对AUC、AUC。一及C取对数后，进行方差分析和双单侧t检验，T用非参数法分析，以考察两制剂的生物等效性。2．3．7血药浓度一时间曲线及药代动力学参数19名受试者口服单剂量试验制剂和参比制剂后不同时间瑞舒伐他汀平均血药浓度一时间曲线见图2。采用DAS2．1．1软件，非房室模型方法计算19名受试者VI服单剂量试验制剂和参比制剂后药代动力学参数，结果见表1。2．3．8生物等效性评价采用DAS2．1．1软件，将试验制剂和参比制剂的AUC、AUC。一和C对数图219名受试者口服瑞舒伐他汀钙胶囊(试验制剂，T)和瑞舒伐他汀钙片(参比制剂，R)后瑞舒伐他汀平均血药浓度一时间曲线表119名受试者口服不同瑞舒伐他汀制剂的药代动力学参数结果(±)转换后进行方差分析、双向单侧t检验和90％置信区间计算J。方差分析结果表明，试验制剂和参比制剂间AUC0_f、AUC。一、C⋯差异无统计学意义；双向单侧t检验结果表明，试验制剂没有超过规定的参比制剂的高限和低限，拒绝无效假设(P<0．05)；90％置信区间计算结果表明，试验制剂均数在高方向没有大于或等于参比制剂均数的125％(P<0．05)，在低方向也没有小于或等于参比制剂均数的80％(P<0．05)。两个制剂的T⋯采用非参数法检验，结果表明试验制剂与参比制剂间T⋯差异无统计学意义。3讨论评价国产瑞舒伐他汀钙制剂的人体相对生物利用度，有必要建立快速、灵敏、准确的测定人血浆中瑞舒伐他汀浓度的方法。国内、外已有关于液一质联用(LC—MS)法测定血浆中瑞舒伐他汀浓度的报道，但有一定的局限性，如方法灵敏度较低、检测时间较长、血浆用量较大、提取回收率低等J。本试验建立了高效、灵敏、准确、专属性强的LC—MS法，成功测定人血浆中瑞舒伐他汀浓度，对于同类制剂的人体生物等效性试验的评价具有重要意义。本方法采用克拉霉素做内标，乙醚一二氯甲烷武警医学2012年7月第23卷第7期MedJChinPAPF，Vo1．23，No．7，July，2012溶液萃取，液相色谱串联质谱测定血浆中瑞舒伐他汀浓度并进行生物利用度及生物等效性研究，结果显示健康受试者单剂量空腹口服瑞舒伐他汀钙10mg后，其药代动力学参数比较接近。经方差分析检验，各药代动力学参数在两组问的差异无统计学意义；对两制剂的C⋯、AUC等参数以双向单侧t检验法和(1～2or)置信区间法进行了统计，按照生物等效性判断标准，试验制剂和参比制剂具有生物等效。文献[4—8]报道药动学参数差异较大，这可能与个体差异、分析方法的准确性、灵敏度和基质效应等有关。因此，在瑞舒伐他汀钙制剂人体生物等效性试验中，为了准确地得到瑞舒伐他汀的药动学参数，合适的采血时间(至少应至给药后72h)以及灵敏的分析方法(定量下限≤0．0500ng／m1)十分重要。【参考文献】[2][3][4][5][6][7]『8]魏振满，丁晋彪，胡琳，等．拉米夫定片人体生物等效性研究[J]．中国药业，20ll，20(1)：9—11．钟大放．以加权最小二乘法建立生物分析标准曲线的若干问题[J]．药物分析杂志，1996，16(5)：343—346．571郭拮，魏振满，丁晋彪．盐酸舍曲林片、分散片人体生物等效性研究[J]．武警医学，2008，19(12)：1106—1109．张红，梁超，程晓华，等．高效液相色谱一质谱法测定瑞瑞舒伐他汀钙胶囊的药动学和生物等效性[J]．中国新药与临床杂志，2006，25(12)：909—912．张红，熊玉卿．单次口服瑞舒伐他汀钙片在中国健康志愿者的药代动力学[J]．中国临床药理学杂志，2007，23(4)：268—271．李春盈．液相色谱一串联质谱法测定人血浆中瑞舒伐他汀浓度及临床药代动力学研究[J]．中国临床药理学与治疗学，2007，12(7)：819—823．XuDH，RuanZR，ZhouQ，eta1．Quantitativedeter-ruinationofrosuvastatininhumanplasmabyliquidchro—matographywitbelectrosprayionizationtandemmassspectrometry[J]．RapidCommunMassSpectrom，2006，20(16)：2369一2375．文爱东，毕琳琳，罗晓星，等．LC—MS／MS法测定中国健康志愿者血浆中瑞舒伐他汀浓度及药动学[J]．解放军药学学报，2007，23(2)：110—113．(2012—03—02收稿2012—04—27修回)(责任编辑梁秋野)(上接566页)[2]MiettinenM，SobinLH，LasotaJ．Gastrointestinalstro—maltumorsofthestomach：aclinicopatho1ogic，immuno—histochemical，andmoleculargeneticstudyof1765easeswithlongtermfollowup[J]．AmJSurgPathol，2005，29(1)：52—68．[3]沈镭，刘之中，成之铮．胃肠间质瘤的概念和诊治方法的演变[J]．国外医学消化系统分册，2005，25(3)：160—162[4]Cichoz—LachH，Kasztelan—SzczerbinskaB，SlomkaM．Gastrointestinalstromaltumors：epidemiology，clini—calpicture，diagnosis，prognosisandtreatment[J]．PolArchMedWewn，2008，118(4)：216—221．[5]MiettinenM，SobinLH，Sarlomo—RikalaM．Immuno．histochemicalspectrumofGISTsatdifferentsitesandtheirdifferentialdiagnosiswithareferencetoCD117(KIT)[J]．ModPathol，2000，13(10)：1134—1142．[6]FletcherCD，BermanJJ，CorlessC，eta1．Diagnosisofgastrointestinalstromaltumors：aconsensusapproach[JJ，HumPathol，2002，33(5)：459—465．[7]侯英勇，王坚，朱雄增，等．胃肠道间质瘤76例的临床病理及免疫组织化学特征[J]．中华病理学杂志，2002，31(1)：20—25．[8]FletcherCD，BermanJJ，CorlessC，eta1．Diagnosisofgastrointestinalstromaltumors：aconsensusapproach[J]．IntJSurgPathol，2002，10(2)：81—89．[9]秦新裕，刘凤林．胃肠道间质瘤的研究进展与展望[J]．中华普通外科杂志，2007，22(8)：561—563．[10]BaiJ，WangY，GuoH，eta1．Endoscopicresectionofsmallgastrointestinalstromaltumors[J]．DigDisSci，2010，55：1950—1954．[11]SamiianL，WeaverM，VelanovichV．Evaluationofgas—trointestinalstromaltumorsforrecurrenceratesandpat—ternsoflong—termfollow—up[J]．AmSurg，2004，70(3)：187—191．[12]KitamuraY．Gastrointestinalstromaltumors：past，pres—entandfuture[J]．JGastroenterol，2008，43(7)：499—508．[13]DematteoRP，BallmanKV，AntonescuCR，eta1．Adjuvantimatinibmesylateafterresectionoflocalised，primarygastrointestinalstromaltumors：arandomised，double—blind，placebo—controlledtria1．[J]．Lancet，2009，373(9669)：1097—1104．(2012—03—02收稿2012—04—17修回)(责任编辑武建虎)