固定化增殖细胞发酵半纤维素糖类的研究

’ j _- ／7 ／ ／ f 《食品与发酵工业 》 Food and Fermentation ]adusLries ?-／ l994 No．1 固定化增殖细胞发酵半纤维素糖类的研究@ ／ 夏黎明 丁红卫@ 余世袁 一 — — — — 南京林五 产化工系) 摘 要：采用海藻酸钠包埋及进一步增殖培养．将休哈塔假丝酵母(c R)的细胞密集固定在凝 胶珠层．大大减小了传递阻力．为该菌的 半好气 发酵创造了有利条件。试验结果表明，cacl 浓度 2 为 宜 ，凝胶中掺入适量的 Al 0 (1．2 )能明显增加凝胶珠的机械强度及使用寿命。固定化增殖细胞能够利用 己 糖和戊糖及 80g／i的混合糖c己糖与戊糖各占一半)．经 12h发酵 ，糖的利用率达 90．5 (相同条件下的游离细 胞发酵需 48h)。混合糖发酵的适宜条件为：温度 34~36℃；初始糖浓度 80g／L*通气量 3．3mi／ml发酵体积 ·h。 固定化体哈塔假丝酵母能成功地发酵玉米秆水解液 、杨术水解藏及亚硫酸盐制浆废 液．酒精得率达理论值的 90％以上 ，具有广阔的实际 应用前景。 关蕾词 ， 休哈栅缔母ZJ簿 ．砭哆 醪妒 利用生物技术 ，以可再生的农林植物纤 维为原料制取酒精 ，是近年来国际上所关 注 的重点课题之一 植物纤维原料(特别是阔叶 材)常含 25～4O％的半纤维素．通常人 们认 为构成半纤维素的戊糖不能被微生物直接发 酵为乙醇．从生物量转化的角度上考虑 ．这是 一 个很大的浪费 近十几年来．国际上在戊糖发酵这一领 域的研究取得了一些突破性的进展，不少微 生物 已被发现能将木糖转化为酒精 】．其中 休哈塔假丝酵母(0 )是最引人注 目的菌种之一。该菌在“限氧供应 条件下能 够发酵己糖和戊糖 ，将其应用于木材亚硫酸 盐制浆废液的发酵 ，已取得了重要进展【 。 鉴于采用游离酵母细胞发酵的传统 具有周期长．生产能力低，设备庞大，操作复 ① 国家 自然科学基金资助项目 @ 88级丰科生，现在地址 ：南京市太厂区工业局 杂等缺点．本试验采用固定化休哈塔假丝酵 母细胞，对戊糖和木质纤维原料水解糖液(含 戊糖和己糖)进行发酵。由于该菌需要。半好 气”的发酵条件．所以采用包埋法固定时，首 先必须克服凝胶珠内都固定化细胞的厌氧发 酵 ，同时，还应增加凝胶珠的机械强度 ，以便 能在振荡发酵条件下维持较长的使用寿命 。 这些棘手的问题无疑给研究工作增添了一定 的难度。近年来．国外已有人对树干毕赤酵母 (尸 )进行了 固定化研究[ ，但有 关固定化休哈塔假丝酵母发酵半纤维素糖类 的研究内容．国内外均未见报道。本研究从体 哈塔假丝酵母细胞的固定化着手，进一步探 讨了固定化细胞的发酵特性 ，并证实了这种 固定化生物催化剂发酵木质纤维原料水解糖 液的可能性 。 维普资讯 http://www.cqvip.com 材 料 与 方 法 1．菌种 本实验中所用的菌种是休哈塔假丝酵母 R(Carc／uta e ) 。菌种移植在木糖 蛋白 胨 酵母汁琼脂斜 面培养 基上，于 4℃下 保 存 。 2．培养基组成(g／]) 液体生长培养基：术糖 20，蛋 白胨 5，酵 母汁 3； 固定化细胞增殖培养基：木糖 50，葡萄 糖 50，蛋白胨 3，酵母汁 2，5，CaCI2 0．25，Mg- SO。0．25，KH Od 2．5； 发酵培养基 ：除糖以外 ，含有 CaC12 2．5， M O 0．25．KH2POt 2．5，尿素 0．24。 3．海藻酸钠 温洲助剂厂出品，分析纯。 4．A12O3 粒度 l 00～200目，pH值的范 围为 4．3 ±0．5，上海五四农场化学试剂厂出品。 5．固定化细胞的制备 将斜 面 菌种 移入到液体 培养基 中，于 30"C．150rpm下活化两天 ，取 2m]菌液与 3 的海藻酸钠溶液 (68m1)于常温下混合，再加 入 】．2 的 AI O ，在无菌条件下充分搅拌均 匀后，用注射器滴加到 2 的 CaC12水溶液 中，于 4℃下静置固化 1 Oh。 6．固定化细胞的增殖 将制成的凝胶粒子 (直径为 3mm左右) 放入增殖培养基中，与 30 C，l50rpm条件下 增殖培养，每隔 12h更换一次新鲜培 养液 ． 共增殖 48h 7，发酵 采用重复式分批发酵法。固定化凝胶粒 子用无菌水清洗三遍后 ，转入发酵培养基中。 发酵容器采用 250ml三角瓶或 lL自制生化 反应器。在前一种情况下，凝胶粒子堆积体积 和发酵液体积的比例为 2；3，总体积 80ml。 将三角瓶 于恒 温振荡器中，1 50rpm，初始 pH值 5．0，以后不加控制 。当发酵在 自制生 化反应器中进行时．发酵液为 170mi，凝胶粒 子 1 60m1．用尼龙网将其分格成 2～3层．由 蠕动泵限速输入的空气在搅拌子的作用下分 散在发酵液中，温度控制在 32c，pH同 。 8．分析 方法 活细胞数测定按 Wada 等所采用方法 进行 还原糖测定采用 3．5一二硝基水杨酸 (DNS)法 。乙醇 含量 用气 相 色 谱 法 测 定 。 结 果 和 讨 论 · 、休哈塔假丝酵母细胞的固定化 1．CaCI 的适宜浓度 CaC1 浓度是影响固定化凝胶粒子性能 的一个重要因素，其最 适浓度需根据具体 的 实验条件加以确定。本试验在固定化凝胶粒 子制备过程中．分别采用 1 ．2 ，3 ，4 的 CaCI 溶液 结果发现 ，当浓度为 1 时．由 于 ca 浓度低 ．与海藻酸根螯合形成海藻酸 钙凝胶的作用较弱，凝胶粒子的强度低．稳定 性差 ，溢出的 自由细胞较多．当 CaCI 浓度为 3 或 4 时，虽然凝胶粒子的机械强度明显 提高，自由细胞很少，但弹性变小，对糖的利 用率也有所下降，在 ca。一浓度大的情况下， 凝胶珠的外层迅速钙化变硬，而内部钙化程 度仍较低，由于外层的凝胶网格过于紧密，使 得固定化粒子的弹性和扩散性能降低．其稳 定性和发酵性能均不理想。相比之下 ，2 的 CaCI 浓度较为适宜 ，在此溶液中成形的凝胶 粒子机械强度较好，富有弹性 ，对糖的利用率 高．发酵性能很好 2，A1 O。对固定化凝胶粒子性能的影响 海藻酸钠具有价格便宜 ，易于 成形．无 毒，不被绝大多数微生物分解等优点，是 目前 最为广泛应用的一种固定化生物载体，其缺 点是钙化成形后的强度较差，使用寿命不够 理想口]。采用聚乙二胺、单宁、戊二醛等包裹 硬化处理海藻酸钙凝胶 “ ，虽可加强凝胶 的强度，但增加了反应物和产物的扩散阻力 ， 梅山公 ” 的研究结果表明．在包埋液 中添 加 SiOz．可以大大提高固定化微生物颗粒 的 t 0 ‘ 维普资讯 http://www.cqvip.com 维普资讯 http://www.cqvip.com 二、固定化增殖细胞的发酵特性 1．对 己糖 、戊糖及混合糖的利用 采用固定化增殖休哈塔假丝酵母细胞在 250mi三角瓶中，于 34℃，150tpm条件下，对 浓度为 80g／L的木糖、葡萄糖和混糖 (葡萄 糖 ：木糖一l，1)分别进行发酵试验 。结果表 明，三种发酵底物的酒精得率均在理论值 的 90 以上(消耗每克葡萄糖或木糖的乙醇理 论得率分别为 O．5l与 0．46)，但是发酵速度 差异较大(见图 2)。 时间(h) 圈 2．固定化增殖细胞对 己糖、戊糖及馄糖的利用 ●．●木糖f △ △混合糖； 0()葡萄糖 从图 2中可以看 出，固定化休哈塔假丝 酵母能够迅速利用葡萄糖，发酵 4h，糖的利 用率便可达 94．2 。相比之下，对木糖的利 用速率则较慢．发酵 4h．只有 48．2％的木糖 被利用 ，经 1 后 ，利用率才选 75．5 。通常 认为，真核微生物对戊糖的代谢途径比己糖 代谢更为复杂。木糖发酵首先需将木糖还原 成木糖醇，然后氧化为木酮糖，进一步磷酸化 后进 碡酸戊糖循环途径，并最终生成乙 醇E⋯。在葡萄糖和木糖共存的情况下，体哈 塔假丝酵母通常先利用葡萄糖 “]。从对混 合糖的利用 曲线可 看出，在发酵 4b内，糖 的利用速率较快 ，有 73．7 的糖被利用 ，其 中大部分是葡萄糖。此后，随着葡萄糖量的减 步 ，对木糖的利用开始占主导地位，利用速率 逐渐变慢 ，经 12h发酵后，糖的利用率 可达 90．5 在另一组对比试验中，采用自由的休 哈塔假丝酵母细胞 ，对 80g／L的混合糖 (葡 萄糖与木糖各占一 半)进行 48h发 酵．糖利 用率为 88．6 。由于固定化细胞技术利用凝 胶载体提供的微环境，可以获得高密度的细 胞，有利于加快生化反应．所以能大大缩短发 酵周期。 2．糖的初始浓度 糖的初始浓度直接影响到生产效率。为 了确定固定化休哈塔假丝酵母发酵所适宜的 糖浓度，本试验采用了一系列不同初始浓度 的混合糖(葡萄糖和木糖各一半)．在 34℃下 振荡发酵 12h，分别测定固定化 细胞对糖 的 利用率。实验结果(图 3)表明．在混合糖发酵 情况下，糖的初始浓度以 80g／L左右较为适 宜．发酵 12h．糖的利用率可超过 90 ．当糖 的初始浓度太于 lOOg／L时，由于木糖的绝 对含量增加 ，糖的利用率有所下降。 一 l 哥 茁 君 鞋 糖的初始旅度(＆以) 圈 3． 糖的初始浓度与利用率的关系 本试验中所采用的固定化凝胶粒子体积 与发酵液的体积比为 2；3，若进一步增加凝 腔粒子的数量．或延长发酵时间，刚初糖浓度 仍可进一步提高。 3．最适发酵温度 一 般认为，体哈塔假丝酵母的最适发酵 温度为 30~32"C[“。本实验在 30~40"C范围 内，研究 了固定化 休哈塔假 丝酵 母在 12h 内，对 6og／L混合糖(葡萄糖和木糖各一 半) 的利用情况。结果发现，在 34～36℃下，固定 维普资讯 http://www.cqvip.com 化细胞对糖的利用率最高(95．7～96．6 )， 凝胶珠中的细胞形态正常 ，每毫升凝胶 中的 活细胞稳定在 3×10 左右 当温度为 40c 时 ．糖的利用率为 88．7 ，凝胶珠中的话细 胞数略有下降(1．6x1 0。／m1)。在实际应用 中，酒精发酵在较高温度下进行对于加快反 应速度，缩 短生产周期 ，减少产物回收成本 等，都十分有利，但温度过高又会引起细胞死 亡，导致发酵能力下降。 4．通气量对发酵的影响 由于发酵液中同时存在戊糖和 己糖，而 己糖发酵并不需要供氧条件，因此 ，发酵过程 中的最适通气量必须经过实验才能加以确 定 为此，在 自制的生化反应器中，以 6og／L 的混合糖(葡萄糖与木糖各占一半)为基质． 研究了不同通气量对固定化休哈塔假丝酵母 细胞发酵影响 。图 4中展示了 3CC发酵 15h 的结果。 ( ) 00 95 90 ／ ／ 85 ／／ ／ a0 3 ．5 4一 ． 0—4 ． 5 盎 一 通 e量(mI，『nI-h) 图 4．通气量对固定化休哈塔假丝酵母发酵的影响 ●H●糖的利用率( ) ’ ×一×乙醇得率与理论得率之比( ) 从图 4可以看出，当每毫升发酵体积(包 括发酵液及凝胶珠的体积)每小时的涌气量 为 2．2ml时，糖 的利用率为 89 ，孵耩得率 为 0．4g／g消耗 的 糖，相 当 于理 论得 辜 的 82 。戊糖发酵需要特定的 半好气 条件，通 气量不足常常导致木糖醇的积累，使得酒精 的生成受到抑制。当通气量提高到 3．3ml／ml · h，糖的利用率达到 93．4 ，酒精得率上升 到最高 点(0．45g／g消耗的糖)，为理论得率 的 93 进一步加大通气量，虽然糖的利用 率有所提 高，但酒 精得 率 不再 上升 。Del_ genes 等认为，在通 气过量时，用于细胞增 殖生长的消耗加大 ，酒精得率受到影响 。通气 过量还可能促使酵母细胞将乙醇作为碳源加 以利用 本试验的结果与 Detgenes等的观点 基本一致 通常包埋 法 固定主要适用于厌氧微生 物，由于细胞在凝胶载体中高浓度聚集 ．空气 不足对于需氧微生物来说，是一个很严重的 问题 。尤其在凝胶粒子的中心部位，缺氧现象 更为突出 本试验采用低细胞浓度固定与进 一 步增殖培养相结合的方法，使细胞密集于 凝胶珠的表层，从而大大改善了通气条件 ，在 一 定程度上避免了凝胶粒子 内部细胞的厌氧 发酵现象。 三 术质纤维原料水解液的发酵 将玉米秆水解液、杨木水解液及亚硫酸 盐制浆废液0 用石灰 中和至 pH5、3，为了便 于对比，分别添加适量木糖和葡萄糖 ，使得总 含糖量为 6og／L，其中戊糖和 己糖约各占一 半。采用固定化休哈塔假丝酵母，在 250ml 三角瓶中，36℃下进行发酵试验 ．实验结果 (图 5)表明，固定化增殖细胞能成功地发酵 上述三种木质纤维原料水解液，生产周期 比 游离细胞发酵 明显缩短．糖的利用率及酒 精得率普遍较高。其中尤以对杨木水解液的 发 酵 结 果最 佳 ，发 酵 15h，糖 的利 用率 达 90 ，酒精 浓度为 24．9g／L；发酵 1811，糖 的 利用率为 93 ，酒精浓度 达到 25．7g，L，酒 精得率超过理论值的 90 。 木质纤维原料水解穰含有大量的发酵抑 制物质[ ，如木质素降解产物、醋酸、甲酸 、 糠醛等 ，在亚硫酸盐制浆废液中，还含有 SO： 等有毒物质。由于本实验所采用的菌种对发 酵抑制物具有较高的忍耐力 ，加之高浓度细 胞被包埋在凝胶载体内有利于减少有害物质 的抑制作用 ，所以使得发酵能够顺利地在木 质纤维原料水解液中进行。 短年来 ，国内外对于固定化细胞的研究 维普资讯 http://www.cqvip.com 发展非常迅速 ，其应甩已涉及工业、医药 环 保 能源开发等各个领域【 。 ： 颦 艇 ，： {簟 ／ ， ／ ： ＼。— =二= ＼ 八．． 时问 ch) 圈 5． 木质纤维原料水解渡的乙醇发酵 制浆废液 b．杨木水解渡 c．玉米秆水解液 0—0乙醇 ●一●糖 ×一×pH 本实验采用固定化增殖细胞发酵己糖和 戊糖，固定化凝胶球的稳定性强 ，操作筒便， 发酵速度快，生产周期短，酒精得率高。由于 所固定的活细胞可 以重复使用 ，不但节省了 许多供细胞生长的糖，而且可以简化设备，减 少投资，使发酵工艺更加完善和便于控制。本 项研究在可再生资源的综合开发利用方面将 具有重要的理论价值和广阔的应用前景。 致谢 ：本文工作得到了南京林业大学程芝教授 的支持和帮助．谨致谢意。 参 考 文 献 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Forest Products Chemistry and Engineering，Nanjing Forestry University，Nanjing) ABSrR ACT By entrappirig into calcium alginate ge l and further incubation．Canada S 妇 R cells were dense— ly immobilized in the periDhery of the gel beads—thus reduced the internal diffusion limitation and cre ated favourable environment for sem iaerohic fermentation of CandMa She／mtae．The research results showed that 2 ~ lcmm chloride was suitable for im mobilization and that m ixing 1．2 aluminium oxide into alginate gel could improve the mecl'mnica]strength and permanence of the beads obviously． The immobilized growth cells could utilize both hexoses and pentoses，the utilization efficiency of 8Og／ L sugar mixture(eluco~e to xylose，1：1)was 90．5 after 12h fermentation(48h ~rmentation for free cells)．The optimal fermentation conditions of sugar mixture were as follows：temperature．34～ 36℃ ，initial sugar concentration，80g／L，and air supply rate，3．3ml／ml·h．It was found that tb3s im mobilized biocatalyst c．qn also effectively ferment spent sulDhire liq1101"，Corn stover hydroysate，and as— pen wood hyarolysate．Ethanol yields were 90 or higher of the theoretical，wh'ch presented broad prospe cts for indus trial applica tions． Key words ：Immobiliaztion，Hem icellulose，Ethanoi fermentation，Candida shehae l ⋯ ⋯ l ⋯ ' ⋯ l ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ l ～ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ， ， ， ⋯ ⋯ l ⋯ l ⋯ ⋯ ’ ⋯ l ， (上接 第 53页) 直至此时，为探讨振动对焊接的影响，对 操作者进行调查了解，才有人言及原来的主 驱动变减速器存在着抖动问题。正是这个一 般 的简单机械振动．严重地影响了 自动 电阻 焊设备优 良性能的发挥。 更换主驱动变速器，获得 了均匀平稳的 铜线速度 ，解决了原来存在的水平抖动问题 ， 垫平调正了联轴器两轴 的配合，减少了整机 (包括铜线)的振动。 结 论 与 建 议 全 自动电阻焊罐身生产线机头的振动， 对焊缝 的质量影响较大，可能导致焊接飞溅 ， 也可能造成焊接强度弱，使焊缝不平直 ，宽度 大小不一．颜色深浅不同。因此 ，必须采取完 善有效的措施，防止和消除机头产生振动。对 于主机的电力拖动系统 、机械传动系统和轮 系，要进行严格的振动检查 ，认真调试，以获 得良好的机械运行稳定性 。要设计主机安装 基础和她脚螺栓。在设备安装前，绘制安装基 础 图和地脚螺栓 图，认真施工，保证整机的机 械稳定性 。建议设备制造厂在设备使用说明 书中增加设备安装的基础图和地脚螺栓图； 在设备调试条文中，补充振动检查的要求；在 次品罐对策焊接 不良中，补充振动对焊接的 不良影响、检查内容和消除办法 从漳浦罐头厂的实践看，一条引进先进 技术的现代化生产线，只是采用了一般机械 安装调试的普通措施 ，就获得了十分满意的 效果，极大地提高了技术经济指标，显著地增 加了经济效益 。从 中我们吸取了有益的经验 教训 ，这就是 ：全自动电阻罐身生产线的防振 是一个值得引起制造栈和使用厂共同重视和 研究的课题 。 致谢 e谨 向汕头轻工业机械厂，特别是该厂技术 开发办．致谢 ! 维普资讯 http://www.cqvip.com