固定化细胞内组分有效扩散系数测定时无反应发生条件的确定

D 一 《食品与发酵工业》 Fc,od and Fermentation Industries 夕 、／ 固定化细胞内组分有效扩散系数测定时 无反应发生条件的确定 主造墼： ●___——‘———一 — ————— —一 (天津大学 化工系) 摘 要 ：在无反应发生条件下进行 固定化细胞内组分有教扩散系数测定时，常常要使细胞失去活性 。本文 通过显徽形态观察及重量变化测定t分析了常用的几种失活细胞的方法对细胞本身的影响。测定了由各种不 l司方式得到的无活眭固定化细胞内葡萄糖与乙醇的有效扩散系数，并与有活性固定化细胞内组分的有效扩散 系数进行了比较。提出了一种便于使用，既可保护底物不被消耗， 可以测得更接近实际值的有效扩散系数的 无反应发生条件：苯甲酸处理法。 差键词：固定化细胞，有教扩散系数，苯甲酸 前 言 底物和产物在固定化婀胞内的有效扩散 系数是分析生物化工实验数据及设计生化反 应器的一个重要参数，文献中有关有效扩散 系数的研究报道还不多 ，这类数据的获得主 要还依赖于实验测定。实验测定有效扩散系 数De可以在两种萋件下进行；一种是反应与 扩散同时存在+另一种是测定时没有反应发 生。前一种条件需要了解有关细胞的反应动 力学知识，并要求饵反应扩散模型，这样，De 的求取是麻烦的，而且容易受到更多因素的 影响．因此对 De的测定及系统研究大多数选 择了后一种条件。当在后一种条件下进行 pe 测定时，有以下几种方法来保证底物不被消 耗 ：一种做法是使细胞失去反应活性 ；另一 种做法是利用与底物分子量及分子结构相同 或相近的替 代物 (不被细胞所转化 )来进行 t 现在南开大学高分子化学研究所 ·20 · 脚 的测定而细胞保留有活性t如用木糖替代 葡萄糖”f第三种做法是对于多底物厦应，分 别测定在缺乏另外其它底物的条件下，某一 底物在固定化活细胞内的有效扩散系数 第三种做法对于单底物反应显然是不台适 的，第二种做法常常受到类似物的不易获得 等因素的限制，相比之下，第一种做法更有普 遍适应性。 使细胞失活有许多方法 ]，用于 De测定 时文献报道 的方 法有：用氧化 汞或紫外光 波 j杀死微生物细胞．用有机溶剂如 甲苯 一、 乙醇溶液 杀死细胞，高温杀死细胞 。由 这些不同的处理细胞的方式得到的无活性固 定化细胞中组分的De是否不同?差别多大? 目前文献上尚无报道。研究这些失活方式对 细胞本身并进而对固定化细 胞中组分 De 的 影响，在这 个基础上选择细胞失活方法使得 维普资讯 http://www.cqvip.com 在无活性条件下得到的 De尽可能接近有活 性条件下的 De，遭就是本文的目的 实 验 方 法 用于实验的细胞是酵母细胞，菌种代号 “济南 1500”，实验测定的是葡萄糖和乙醇在 聚丙烯酰胺凝瞳固定化酵母细胞中的有效扩 散系数 一 、细胞的处理方法 1．热 杀死 (开 水 煮 1h或 蒸 汽 灭 菌 12D℃ ，20rain)。 2．乙醇溶液 杀死 (50 的乙醇水溶液浸 泡 lh)。 3．苯甲酸溶液杀死 (0 3 的苯甲酸溶液 浸泡 ) 二 细胞活性的测定 把处理过的细胞加到一定浓度的底物溶 液中，保温 3h，检测有无产物的生成即可知 有无活陛。蛮验证明上述三种处理方法均可 使细咆完全戋活 三、固定化细胞的获得方法 l_活细胞被热杀死后．离心算湿重用于 固定化。 2．活缅陋用乙醇溶液杀死后．离心算湿 重用于固定化 3．活细胞离心算 湿重用于固定 化．然后 热杀死。 4．活细胞离心算湿重用于固定化，在有 苯甲酸存在下进行测定(对葡萄糖)。 5 活细胞离心后算湿重用于固定化，直 接用于 De的测定(对乙醇)。 方法 1～3是文献中有报道的，方法 4是 作者 自行提出的 。细胞形态及大小由显微镜 {景 ’刚定 四、细胞量的表示方法 用一定转速 (4500rpm)下离到的湿 重和／或在一定干燥条件下(1 20℃)得到的千 重表示细胞量 ．细胞干湿 比为两者的比例 有效扩散系数的测定采用稳态流动双室 隔膜法 进行 ，细胞的培养及详细的固定化 缅胞制备方法 ，底物与产物的分析方法 可在 相应的文献中 找到 ，在此不再详述。 实 验 结 果 与 分斯 一 、热处理对凝胶中组分 De的影响 实验测定了热处理对于组分在聚丙烯酰 胺凝胶中有效扩散系数的影响，实验结果 · 如表 1所示 由表 1可见，凝胶经水煮与否并 不引起组分在其中的 De的明盟变化 ．而且这 个变化可以忽略(小于重复实验误差，其 为 2．93 。 表1．热魁理对凝段中葡萄糖De的髟响 !兰 ! !：型 !! ： l !：!! 二、苯 甲酸的存在对 De的影响 苯 甲酸存在与否对 的影响如表 2所 示。由表2可见，苯甲酸对De的影响也可以 忽略。 表2 革甲酴对壤胶中葡萄糖 的影响 诗萄糖摊度fI(茸／m ) ．{ 3O 60 ×l 0 l 苯甲酸 (3‰】 8．32 2 85 1．26 (m ／s) l 无苯甲酸 a 27 2．80 2．31 两个De的最大相对误差( )}1．53。1．79 2 i 5 三、不同细胞处理方式对细胞本身的影 响 显微镜镜检结果表明 活细胞内部结构 较清晰，苯甲酸处理的与之差别不大，而热杀 死及乙醇杀死的细胞内部不很清晰。从细胞 大小来看，活细胞最大，苯甲酸处理的次之， 热杀死及乙醇处理的细胞中可 看到一些昭 显收缩了的小细胞，乙醇处理的细胞加水后 ， 细胞大小又有所增加。在j种处理后的细胞 中都未观察到 自溶现象。 测定了三种处理情况下细胞的重量变化 及干湿比，结果在表 3中给出，表中q为细胞 重量损失．定义为 ； 一 煎塑避 堂 维普资讯 http://www.cqvip.com 表 3．处理方式对细胞的影响 处理方式 活细胞 苯甲酸杀死 热系死 乙醇系死 q( ) O 8 22 26 37 干重 ／湿 重 (活 ) 0 2I 5 0．1 92 0．1 86 O．1g3 干重／湿重(死) ● 0．209 0．251 O．306 用承重新泡 1．5h后的 q( ) 基本不变 基本不变 】5．8】 由表 3可以看出 ：(1)细胞量损失 q：乙 醇 处理> 热杀死 >苯 甲酸 处理 ．而 且乙醇 处 理 的细胞损失量有一大半是可逆的，热杀死 及苯甲酸处理的损失量是不可逆的 (2)细胞 量的损失不是细胞 自溶造成的．细胞量的损 失太部份是水，但又不都是承。用苯甲酸处理 更长的时间+q还增大 ，但小于另两种处理方 式的 q。实验还观察到，用上述几种方法杀死 旨的固定化细胞中，葡萄糖的 De与 De铡定 时溶液中有无苯 甲酸的存在无关，前面也已 由实验证明了苯甲酸的存在对凝胶中葡萄糖 的有效扩散系数的影响可略，所以．固定化细 胞中组分 De的测定实验 中可以用苯甲酸溶 液作为葡萄糖的保护剂．可防止测定过程中 象葡萄糖这类底物被其它微生物所消耗并省 去对溶液的灭菌步骤。 四、不同方法制备 的固定化细胞 中组分 的 De 用由实验方法中给出的五种方法得到的 固定化细胞进行 De测定 的结果 列于表 4 中．表 4中 是湿细胞重量与固定化细胞重 量之 比，分析数据时．忽略细胞含量的微小差 异及组分平均浓度的差异的影响是合理的。 表 4．用不同方法杀死细胞方式得到的同定化细胞中的 De (gig 1 0．234 l 0．243 l 0．237 1 0．237 0．24 0 固定化细胞树备方法 l方法I I方法2 l方法3 i h 法4 方法5 (a)葡萄糖 (测定u,j-~若甲酸存在) 上下室平均浓度(kg／m ) 28．74 31．5l 3I．70 30．84 G× 1 0 (mz／s) 2．03 2．35 2．25 2．42 K O．828 0．8 42 0．84I 0．830 (b)乙醇(测定时无苯甲酸存在) 上下室平均浓度(kg／m。) 28 22 28．74 27 26 I 2 ．48 28 37 D ，× 1 0。。(m Is) 4．22 i 4．64 4 44 4．60 4 54 l 0．83 0 【 0 840 0．843 0．836 0．813 由表 可以得到：(])两个组分在由不同 方法得到的固定化细胞中的分配系数 K 是 基本相同的，即不同的处理细胞的方式并不 影响组分在固定化细胞中的浓度分配 (2)无 论对于葡萄糖还是对于乙醇，用方法 1制备 的固定化细胞中组分的 De要明显地小，这可 由变性细胞的特性、细胞量 (干重)不同以及 固定化细胞中的孔隙来得到解释 (3)对于乙 醇的 De，用苯 甲酸处理 的固定化细胞 中的 与固定化活细胞中的 De值最接近，而且 从葡萄糖 自身 De在几种不同情况下的差别 与 乙醇 自身 De在几种情况下的差别相对应 来看．用方法 2．3． 得到的固定化细胞来进 行无反应发生条件下的 De测定是可行的，尤 其以方法 4得到的固定化细胞进行 De测定 更接近固定化活细胞的情况 用这种方法测 得的 De数据很好地模拟了有 内扩散阻力影 响时的反应动力学数据_I 。 结 论 通过对不同处理细胞方式的比较、分析 及实验测定，找到了一种保证测定 De时无反 维普资讯 http://www.cqvip.com 应发生的条件 ：用苯甲酸处理。逆 不仅使测 得的 De值更接近固定化活细胞中的 De值 ． 而且使用方便 ：将组分溶解在苯 甲酸溶液 中 直接用于固定化活细胞中 De的测定，既可抑 制细胞活性，又省去了制备固定化细胞前后 需要杀死细胞的手续 ，还可以防止底物或产 物在测定过程中被别的微 生物所 消耗(尤其 象葡萄糖这类底物)，减少了待测定溶被需要 灭 菌及安装测定过程中需要无 菌操作的麻 烦。 考 文 献 M．；Enzyme M icrob Teehno] [2]FurusaM S．et a1．；J．Chem．Eng Jpn．．1 985．1 8 (5)．369 3]WiUianson K．et al{J．Water P．C．F．．1978． 48(2)，28l [{：白毓谦等；《微生物实验技术}．山东大学出版 社，济南．I 987 [5~Matson J．V．et a1．；Water Re~earch．1976，18． 877 ：6]№efsma J．G．et a1．~BJotechno1．BJoeng．1979． 21．1 711 [?]Hannoun B．J．M．et a1．{ibm ．1986，28．629 [8jMa unaga T． a1．+ibJd．，1980，22，2607 [9]FuruJ M．et a1．；J．Ferment Techno／ ，1985．63 (2)，1 67 [1O3李清彪等 ；离子交换与吸附+1992，8(8)，(替 出版) [11]李清彪等 ；高校化学工程学报 ，1992．6(3) ：l 2]李清彪；天津大学博士毕业论文，】996 Determination of Non——reaction——occurring Condition for M easuring the Effective Diffusivity of a Substrate in the Immobilized Cell M atrix Li Qingbiao Chen Hongfang (Department of Chemical Engineering ．Tianjin University．Tianjin) There exist different method s of inactivating cells which give a notl reaction oc curnng condition tinder which the effective diffusivity of a substrate in the immobilized eell m atrix is ofcen measured． Based OYJ micrographic observ~ation of size and shape of the cell and determination of we培ht change of ceils ．the effect of the various inactivating m ethods on the cell itself was examined ．The effective dif- fusivities of gl uc0se and ethanol in the inactivated yeast cell—occupied polyaerylamide gels obtained from the various methods were determined and compared with the diffusivity in the active immobilized cel1．So the method called as“benzoic acid—trea ting method ”ha s been proposed which is convenient to work，provides a non—substrate-consuming condition and gives a more reasonable value of diffusivity than other methods． Key words：Imm obitized cell，Effective diffusivity，Benzoic acid 参 ¨C 耐 R ) ] ( n 5 言； 维普资讯 http://www.cqvip.com