酵母乳糖酶对牛乳乳糖水解作用的研究

《食品与提酵工业》 Food ＆ Fermentation Industries 1991 8 酵母乳糖酶对牛乳乳糖水解作用的研究 郭杰炎 毛敏伟 孙玉华 (复旦大学 微生物学与微生物I程系) 摘要i采用乳酸克鲁维酵母的乳糖酶 ( 一乳糖苷酶)对乳糖溶液、喷 雾 干 燥 脱 脂 奶 以及全脂奶进行7试验，以确定将乳糖转化威单糖的最适条件。当牛奶中酶浓 度 为8 u／m] 时，于4O。c反应 2小时或 4。c反应24小时，约60 的乳糖得以水解。随着乳糖浓度的增高， 水解程度也有所提高。当酶浓度为lOO／ml时，于40。c反应2小时，90 乳糖得以水解 。用 自制的乳酸克鲁维酵母的乳糖酶和加拿大lactaid Inc．生产的乳糖酶制剂]actaidf5解 乳糖无 大的差异。 关键词：乳糖酶，乳糖水解作用 乳糖酶，即 F一半乳糖 苷 酶 (E．c 2． 8． 1．23)能水解乳糖为半乳 糖 和 葡 萄 糖，降低牛乳中乳糖的含量，制造低乳糖牛 乳。这种低乳糖牛乳能适合乳糖不耐症者饮 用，而我国^群中特别是成年人中普遍存在 乳糖不耐症者 ( )。同耐，由于乳糖的 溶 解 度较小，在炼乳和冰淇淋等含浓缩牛奶的乳 制品中乳糖往往容易产生结晶析出，影响产 品的风味和质量，乳糖水解为单糖后溶解度 增大，便可消除此蔽( 。此外，低乳 糖 牛 乳在制造酸奶时也有利于酸的形成和提高乳 酸含量《。)。因此研究乳糖酶对牛乳乳 糖 的 水解作用，对改善我国人民的饮食结构，充 分发挥牛乳的保健作用和发展乳制品新品种 具有一定的现实意义。 本文报道了用自制的乳酸克鲁维酵母乳 糖酶制剂对乳糖、鲜乳和脂脱乳粉复原乳以 及乳清中乳糖的水解作用，并且比较了进 口 酵母乳糖酶与自制乳糖酶的水解效果。 材 料 与 方 法 一 、 乳糖酶 1．产酶菌株 乳酸克鲁维酵 母 (K】u yveromyces]actic)Y1 2一l菌株，由我们实 验室分离(“。 2．液体乳糖酶 将发酵液离心收集酵 母细胞，经氯仿 (或高压泵)破壁，离心得 无细胞抽提掖，再用丙酮和硫酸 铵 分 别 沉 淀，最后溶于pH6．8 0．1M的K：HPO．缓 冲 液 (含Mg”和Mn”)。酶活力约3800u／m] (ONPC)。 8．粉状乳糖酶制剂酵母细胞经溶剂处 理后直接进行真空干燥，制成粉状制剂，酶 活力在1600~2000u／~。 二、牛乳 鲜牛乳 由上海乳品五厂提供。 脱脂乳粉 上海市牛奶公司工业科提供 以乳粉：水 =1；8配成复原乳。 ． 婴儿乳粉 上海乳品二厂生产光明牌婴 ·19， 维普资讯 http://www.cqvip.com 儿乳粉。 三种牛奶配好后，先经 70～80 C保 温 20分钟，然后供试验用。 兰 、乳糖水解条件；一般情况下取牛乳 50m]于大试管中，加乳糖酶至一定 浓 度 ， 摇匀后置40。C水浴或冰箱中水解。 四、方法 1．牛乳中乳糖测定 按轻工部颁 GB5413--85方法进行。 2．葡萄糖含量测定 用葡萄糖氧化酶 一 过氧化物酶法测定，具体如下： (1)试剂 葡萄糖 氧 化 酶 (GOD) (singma产品)配成 6 u／ml。辣根过 氧 化 酶 (pOD) (东风厂产品)配 成 10u／ml。 邻联甲苯胺 (TOD) (分 析 纯 )，先 用 95 乙醇溶解，再用pH5．1缓冲液 配 成 1．5 rllM液。 醋酸一醋酸钠缓冲液 ，pH5．1，0．1M。 (2)溯定步骤 取 待 涮 液 1．0ml加 TOD2 ．0m1．pOD0．fiml，35。C水浴保 温 5 分钟，然后加入GOD液0．5ml，迅速摇 匀并 准确计时，在35。C下反应20分钟左 右 ，然 后测定62finm处光密度值。在上述条件下， 葡萄糖浓度在 100～500ug／ml，反应时间在 10～40分钟范围内，葡萄糖浓度 与 0．D．e s 呈线性关 系。 每次测定时必须取一合适的已知浓度的 葡萄糖液作标准管。 (8)葡萄糖含量计算 样品中葡萄糖含量 (mg／m1) 一 搓遏管9．D值 A 一标准管0．D值 ⋯ ‘“ A为标准管中葡萄糖浓度 (mg／m1) n为样品稀释倍数。 羽 定乳糖酶水解液中葡萄糖浓度时，将 样品先煮沸加热 3分钟以中止反应。测定牛 奶样品时先加等体积的l0 三氯醋酸以中止 反应和沉淀蛋 白，过滤后用pH5．1缓冲液 稀 释，再作为葡萄糖含量测定用。 ·20 · 3．乳糖水解率计算 乳糖水解率 = mg ／ m l ×l00 乳糖含量 ( ⋯ ⋯ 结 果 与 讨 论 一 ， 酵母乳糖酶对乳糖的水解作用 添加液体乳糖酶至最终 浓 度 为 3 u／ml 和 6 u／ml，在40。C水浴下分别水 解 5 的 乳糖溶液和新鲜牛乳 (乳糖含量4．7 )或 脱脂复原乳 (乳糖含量 5 )，结果列于圈 1．图2和图 3。可以看出，我们所研制的 乳酸酵母乳糖酶，不仅能有效地水解溶液中 的乳糖，而且对鲜乳和复原奶 中的乳糖也有 良好的水解作用。在 3 u／ml酶浓度 下40。C 作用 2小时，可将60 左右的乳糖水解为葡 萄糖和半乳糖。若水解 5小时，水解率 可 达 80 以上，这些结果与Hernand ez等的报 道 相近 (。)o ≥ 饕 ·芒 图 1．乳搪酶对溶 液中乳糖 的水解作 用 比较图 l、图 2和图 3发现，它们的水 解率基本相近，明牛奶午并不存在对乳酸 酵母乳糖酶有明显作用的抑制因子 二，乳糖酶浓度与乳糖的水解关系 测定了不同浓度的乳糖酶 (粉剂)对鲜 牛乳或复原乳的水解作用，结果列于图4录l 图 5，可以 看 出 在 1～10~／m1酶 浓 度 ， 40 c下水解乳糖，随着酶浓度增高 ，水 解 维普资讯 http://www.cqvip.com 小 时 图 8．乳糖酶对复原乳乳糖的水解作用 率也加大，虽然在较高浓度 (8～lOu／m1)， 这种趋势呈现平缓。提高酶浓度有利于缩短 水解时间，但两者并不呈严格的比倒关系。 例如，在lOu／ml酶浓度下作用 3O分 钟 ，其 水解率 相 当 于 8 u／mrF作 用2小 时 ，或 6 a／ml下作用 l小时。 (图 4) 三，乳糖酶对乳清乳糖的水解 用蒸馏水将乳清粉配成7．2 和 H．4％ 的溶液 (经测定乳 糖 含 量 分 别 为 5．46和 10．9％)，加入粉状乳糖酶制剂至最终浓度 为 6 u／m】，40。C水解 1～ 5小时，结果如 图 6所示。与鲜牛乳或复原乳相比，乳清乳 糖水解率似乎要低些，特别是作用时间长时 (4～5小时)更为明昆。此外，乳糖浓度 酶浓度 (T!_ mi) 因 4．不 日酶浓度对 鲜乳 乳糖 的水解作用 I 2 0 4 5 小 时 图6．乳糖酶对乳清乳糖的水解作用 ·2l · 维普资讯 http://www.cqvip.com 四、冰箱环境下乳糖酶对牛乳乳糖的水 解作用 牛奶在常温下放置掇容易腐败变质，室 温下用乳糖酶加工制备低乳糖牛奶难以保证 牛奶的质量。据报道，乳酸酵母 乳 糖 酶 在 4。C c e)或甚至在一13。C( )仍具有水 解 乳 糖的活力。困此我们测定了冰箱温度 (4～ 5。C和 8～10。C)下乳糖酶对牛乳乳糖的 水解作用。结果列于表 1。 1 6h 2 0h：曲 注 { ；～ u／111【 T 6 l 78．8 ． 艋庸乳耪 复垮(乳 l^|／m【 ．I 89．2 0．1辩艏乳粉 原乳 1n℃ }u m【 2．0 76．9 l 8． 婴儿奶粉 I～ 311,11【 {g．6 58．?6 3．1脱艏乳粉复 原乳 j℃ n u／m【 61．4 5 ．8 70．1脱脂乳析复 原乳 在 4～5。C下， 8 u／ml酶浓度作 用24 小时，乳糖水解率可达80％，若放置在 8～ 10。C下作用，水解18tb时就可达75 。 此外 ，从表中还表明，酵母乳糖酶对婴 儿乳粉中乳糖的水解作用基本接近于复原乳 乳糖的水解。 五、 自制乳糖酶与进口乳糖酶对乳糖水 解作用的比较 从国外得到的加拿大 Laeta id Inc．生产 的液体乳糖酶 (商品名La etaid，由乳 酸 酵 母生产)，根据产品说明，每 夸 脱 牛 乳 (1．14升)加酶液 5滴，冰箱中放置24小时 可使70 牛乳乳糖水解。我们将进 口酶与 自 制乳糖酶同时进行水解牛乳乳糖，结果列于 表 2。表明按该产品说明书添加的酶量基本 上能达到水解70％的水平 ，同时从表 2也可 看出，自行研制的乳糖酶制剂在 酶 浓 度 为 8 u／ml时，其水解乳糖的效果与进 口 酶 基 本 相当 六、乳糖酶对牛乳乳糖水解的扩大试验 在实验室扩大试验 时 取 新 鲜 牛 ~Lsoo ml，加粉状乳糖酶至酶浓度为8．2u／ml，4 ·22 · 表2，自制乳糖酶与进 口酶对 ＼＼ 水解 耀’摩＼ 1 6 JI 2O 11 741l { ＼ }{ 一 自；5町3ll／~II 7 6，1 7 8．8 81．8 1Ⅱ℃ 进 口 7 3．1 8 2．3 2．2 ～ 自制 311／．11l L 49．6 5 8．7 6 3．1 ； C 进 口 4，5 60．3 6 ．U ～ 5。C冰箱放置24小时，经测定乳糖 水 解 率平均为68．8 。进一步扩大试验时 ，由上 海乳品五厂提供未消毒的新鲜牛乳25 L，加 酶至最终浓度约 5 u／ml，4。C冰库放 置24 小时，然后按常规进行巴氏消毒，取样测定 乳糖水解率为78～80％，经测定牛乳理化指 标符合国家标准。 上述结果表明，我们研制的酵母乳糖酶 对于工业化生产低乳糖牛乳具有 潜 在 的 价 值。 参 考 文 献 1． Yao Xiaoheng (就 晓斯)et alj chi- Ⅱe8e Med．J． (中华 医学杂志，英 文 版 ) ， 100 (4)： 316， 1987 2．张树政主编j 《酶 制剂I业*，科 学 出 版社，1684，第818万。 3． V．S．O Lea ry and J．H． W oyehik| J． Food S ei．，41，761， 1976 4．郭杰炎，周士惠j复旦学报 (自然科 学版)， (待发表)，1990 5．R．Hernandez and 】．A．Asenioj J． Food Sei．， 47，1895，1982 6． A Glee and F．V．KosiKowski| 】． Dairy Sci．，86， 396， 1988 7． R． J． Baer and M ． Loen stei ；J． Dai rY Sei ． ，62， 1041，1979 (下转第18页) 维普资讯 http://www.cqvip.com The Optimization of Yeast Autolysis Condition and Volatile Compounds of Yeast Autolysed Extract Shen Guohui Liu Yangming Shi Xiang Cheng Liguo (Wuxi Institute of Light Industry) Ahstract The effects of yeast autoly si s by adding thiam in，glucose and gradually incr‘ easing tem perature to incubation were studied ． Orthogonal experiments showed that yeast autolysl s tim e could be shorten to 6 ～ 8 hours when pH 5 ．5 ， inc— ubation temperature 57。C，concentraction of adding thiamin 0．10 (w／w) ， tim e span of temperature increa sing 60m in ． were used． The effects of Yeast autoly sis treated wlth neutral protease 1398 Wete also inve stigated ． Autolysi s tim 。， yield of protein and am ino—acid wore n0t as good a s those of above technology on both optim um conditions． V olatile com pounds of autolysed yea st extract We re i solated with SDE and identified -#ith GC-MS． Total 63 compounds， in which 20 compounds were sulfur—containing，were iden— tified KeY w0 rds} Yeast， Volatile com pounds， Extract (上按第22页) Lactose Hydrolysis of Milks By Kluyve romyces lactis Lactase Cuo Jieyan Mao W eimin Sun Yuhua ’ (Dcpa rtment of Mi crobiology and Mi crobial Technology'， Fudan UniyersitY， Shanghai) Ab st ract Laetase(日一galactosidase)from KluBverom~／ces tactis WaS te sted on 1a CtOSe SO‘ luti0n。Spray dried skim railks and whole m ilk s to determ in e optimum conditions for con verting loctose to monosugars．An enzyme concentration of 8 u／ml in milk incubated 2 hours at 4O。C or 24 hour s at 4。C， hydrolyzed about 6O of the 1actose． And with the in ereasing of lacruse con cgntratlon， the extent of hydrolyzatiOll is inc reased．An en yme ouncentration，of 10u／ml in milk in cu— bated 2 hours at 40。C， hydrolyzed 90 of differnce in lacto se hydrolysi s between the duced by Lact aid Inc． in Canada) Key words： lactase， lactose hydroly sis ·1g · lactose． There was no signifi cant la ctis lact afle and the Laetaid (pro— 维普资讯 http://www.cqvip.com