啤酒酵母和糖化酵母的杂交

《☆品与发 酵工业》 Fo od＆ F erm entaticn Industries 1991 No． 4 啤酒酵母和糖化酵母的杂交 王英凯 唐尔明 王薇青 (轻I业部食品发酵I业科学研究所) 摘要；本文进行了生产用啤酒酵母07和糖化酵母Saccharomyces dfastaticus 175窖的种问 杂交，试图通过杂交的方法将糖化酵母的DEX基因重组入杂交子中并得以表达。实验表明， 杂交子不仅能够水解和发酵糊精即获得并表达 了DEX基因，而且在细胞形态、巨大茵落形态、 DNA含量以覆产抱能力等方面均不同于单倍体双亲株1303 a his dex和2002 口sde DEX。 遗传分析表明，杂交种N3204的51个减数分裂产物其糊精发酵特性以及遗传标记均出 现 j双 亲类型的分离或重组现象。这些结果郜证 明，通过传统的杂交方法可以获得啤酒酵母和糖化 酵母的杂交种。与生产用啤酒酵母亲棘07比较，杂交种N3204和N3216在IL啤酒发酵过 程 中 显示酒精产生速率快，发酵度 高等较优 良的发酵特性。 关键词 啤酒酵母，耱化酵母，杂交 前 言 低糖或低热量啤酒的主要特 点 即 残 糖 低，发酵度高。要达到这一目的，必须将约 占麦升碳水化台物25 的非发酵性糊精水解 成可发酵性的单糖，以便啤酒酵母利用。糊 精的水解可以通过向麦汁中外加葡萄糖淀粉 酶的方法来完成。但是，如果我们通过遗传 改造的方法使得啤酒酵母能够 白行产生葡萄 糖淀粉酶，即可不必外加此酶，从而达到生 产低糖啤酒的目的 众所周知，一般生产用的啤酒酵母不能 利用糊精J糖化酵母由于具有DEX或STA基 因，产生葡萄糖淀粉酶，故而能够水解利用 糊精，但是却不适合用来生产啤酒。因此， 人们试图通过杂交、原生质体融合以及转化 等方珐将糖化酵母的DEX基因转移到啤酒酵 母 中去( ， ，并使其得到表达，产生 葡 萄糖淀粉酶 。现在，这一设想已经在实验室 用啤酒酵母的改造中获得成功。 ·窑4· 然而，对于生产用啤酒酵母而言，要达 到遗传改造的目的并非易事。主要原因是它 们的多倍体特性，使得融合子和转化子一般 都不太稳定’而杂交方法的运用又因为生产 用啤酒酵母产孢困难、孢子成话率低而受到 限制。最近，作者对生产用啤酒酵母的产孢 情况做了一番撵讨(。)，提高了其产孢百 分 率，并制备了具有交配能力的标记 单 倍体 (。， e) ， 从而使得用杂交方法改造生产用啤 酒酵母的工作成为可能。本文即基于此，对 生产用啤酒酵母O7和糖化酵母1752进行了杂 交实验，并在IL发酵规模上比较了杂交种和 亲株啤酒酵母O7的啤酒发酵特性，为今后低 糖啤酒的试制提供适宜的酵母菌。 材 料 与 方 法 (一)菌株 本文使用的菌株列于表 l中。以 YEPD 斜面方法保存于 4。C冰箱中，每 6个月转接 一 次P为保证菌株的纯度，使用Ric ds( ) 维普资讯 http://www.cqvip.com 的巨大茁落形态技术定期检查。 亵 1．奉文使用的酵母菌株 07 1752 1303 2002 ~3204 N3216 ISacchsromyces J上面啤酒酵母， lcerevisiae 西德引进 lSaccharomyces j糖化酵母，IFFI fdisatat|cu8 j保藏 MAT a his d exl菌株07的标记单 I倍体 MAT 0 ade DEXj菌株1752的标记 I单倍体 1303×2002 1303x 2002 (二)培养基 1．完垒培养基 (YEPD) ： 酵 母 膏 1．0 ，鬻白胨2．0，葡萄糖2．0 ，琼 脂 粉 1．5 ， pH5．5～6．0。 2．基本培养 (MM)l Difco ye ast nitrogen base w／o Amino acid 8 0．67 ， 葡萄糖2．0 ，琼脂粉1．5 ，pH5．5～6．0。 8．Mc Chky产 孢 培 养 基 ：乙酸 钾 1．0 ，酵母膏0．25 ，葡萄培0．1 ，琼脂 粉 1．5 ，pH5．5～6．0。 4．糊精发酵培养基：酵母膏0．45 ， 蛋白陈0．75 ，糊精2．0 ，pH5．5--6．0。 5．糊精水解培养基t酵母膏0．45 ， 蛋白陈0．75 ，糊精2．0 ，琼脂粉1．5 ， pH5．5～ 6．0 6．酵母巨大菌落培养基 5 Be麦 芽 汁，明胶l0％，pH自然。 7．麦芽汁液体培养基： 5 Be麦芽汁， pH自然。 8．加酒花麦芽汁培养基；12。Brix，pH 自然。 上述培养基全部于0．7kg／cm 灭菌l5分 钟，4。C冰箱保存备用。 (三)相反交配型单倍体的杂交以及营 养互补杂交种的检出 将培养至18--24t]~时的两个相反交配型 的营养缺陷型单倍体细胞离心洗涤 2～8次 以去除残留的营养物，用无菌水或生理盐永 制成细胞浓度约为l0‘～l0s的细胞悬液，混 台后E工适当的稀释度涂布在基本培养基上， 28 C培养 8～4天。将营养互补长成的大菌 落挑至McCIary产孢培养基上，21。c培 养 7 ～ 14夭，镜检产孢情况。凡具有产孢能力的 便初步认为是培养互补杂交种。 (四)具糊精发酵能力的营养互补杂交 种减数分裂产物的遗传学分析 将其糊精发酵能力的营养互补杂交种细 胞诱导产孢至成熟，然后以孢子群体分离方 法 ( ’制得单倍体菌株，进行DEX基困 及 遗 传标记的分离和重组分析 1．DEX基因的分离和重组分析 凡具糊精发酵能力的杂种必具有DEX基 因。这里以杜氏管测定法(‘)检验杂交种减数 分裂产物——单倍体的糊精发酵能力，借以 分析DEX基困在这些单倍体中的分配情况。 2．遗传标记的分离和重组分析 将上述所获单倍体细胞用矛签逐一点种 在 MM，MM+his、MM+ade、MM+his+ ade和CM鉴别培养基上 ，28。C培养，然后比 较上述鉴别培养基上菌落的生长情况。 (五)糊精水解能力的测定 将培养至48小时的待剃菌株的细胞点种 在糊精水解培养基乎板上，28。c培养 4～ 5 天后，向平板中滴入碘液，糊精部分变为澡 紫色，这时观察点种的菌落周围或底部的颜 色变化。几具有糊精水解能力的菌株由于能 够向培养基中分泌葡萄淀粉酶，水解了菌落 周围的糊精，从而产生透明圈。 (六)糊精发酵能力的测定 啦 杜氏管测定法( 进行。将培养至48小 时的待据菌株的细胞反复离心洗涤可能残留 的糖分和营养物，接种于杜氏发酵管中，28。C 培养 l一15夭。每天观察杜氏小管的顶部是 否形成气泡。凡能发酵糊精的菌株由于能蝣 产气，便在杜氏小管的顶部形成气泡。若培 ·25‘ 维普资讯 http://www.cqvip.com 葬至l5天的未见气泡生产的便认为该菌株不 具备翱精发酵能力。 (七)酵母巨大菌落制备 按Richards方法‘7)进行。 (， )细胞DNA含量的测定 采用改进的Marmur技术提取酵 母 细胞 的DNA(5)，然后用紫外测定法测定细 胞 的 DNA含量( )。 (九)150ml啤酒发酵 将培养至48．tJ,时的斜面种子 接 人装 有 10ml 5 Be 麦汁的液体管 中，25。C培养48小 时，然后转接人装有150ml 12。Brix加 酒花 壹汁的三角瓶中，13。c发酵 5～7天，每天 用酒精测定仪LION ALCOMETER DA一1 测定酒精的生成量。 (t-)2L啤酒发酵 酵母种子采用逐级扩大培养完成。将培 捧至48tb时的斜面种子接入10m1 5 Be 麦汁 试管中，25。C培养48小时再转入10ml 5 Be ， 友汁中，21。C培养48d~N。，然后转接人150m1 12。Brix的加酒花麦汁 [{1，18。C培养 8天 ， 即完成酵母种子的培养。然后 以大约0．35 9， (w／V)的离心酵母接种量接入 装 有 2 L 12 Bfix加酒花麦汁的量筒中，13。C发 酵 5 ～ 7天。每天测定酒精生成量，发酵前后铡定 外观糖度。其中，外观糖度用Brix糖度表测 定，酒精用LION ALCOMETER DA一1洒 精测定仪测定。 结 果 与 讨 论 (--)啤酒酵母和糖化酵母的杂交 运用群体杂交技术，我们在基本培养基 成功地获得 了啤酒酵母1303 8 hi s ade千¨ 糖化酵酵母2002 ade DEX的营养互补杂交 子代。在进行糊精水解和发酵试验中，发现 并不是所有在MM上生长的杂交子都能水解、 发酵糊精。在供试的160株杂交子中， 只 有 16株能水解、发酵糊精 (见表 2)，占总数 ∞1o 。可能的解释是糖化酵母的DEX基因 ·26 未能组入所有杂交子的染色体D A中或者是 由于其他基因的抑制显性作用而使得组人的 DEX基因未能得到表达。然而，与其他育种 方法相比，我们不难得出这样的结论，杂交 能以较高的频率使特定性状组入杂交子代中 并得以表达。因此，杂交不失为一种较为有 效的育种手段。 表 2．糖化酵母糊精基因 (DEX) 的转移以及在杂交中的表达 (二)营养互补杂交种的鉴定 本文的 l三要目的在于说明通过传统的杂 交方法能略将糖化酵母的DEX基因转移到杂 交子中，并能够稳定地遗传和表达。 1．杂交亲株与杂交子遗传性状的比较 我们从所获杂交子 中筛选到两株糊精水 解和发酵能力较强以及啤酒发酵速度较快的 杂交种N3204~HN3216，通 过 它 们 与 亲 株 1 303和2002在细胞形态、巨大菌落形态 ，产 孢能力、水解和发酵糊精能力阻及细胞DNA 含量几方面的比较，说明它们是发生核融合 的真正杂交子。 从表 3可以看出，杂交亲株1303和2002 不能产孢，而杂交种N3204和N3216都 能 产 地，说明其交配型基因呈杂合状态(8／ )存 在J形成的子囊除了 8一孢和 2 孢外，还产 生了很多的 4一把子囊 (见图 1)，说明杂交 子很有可能是二倍体细胞，这一点也可以从 细胞DNA含量上得到证实，1X3204和 N3216 细胞DNA含量基本上是亲株1303和2002的二 倍}反映在细胞形态上，杂交子细胞明显大 于亲株的细胞 (见图 2)。此外，表 8和图 3也表明，杂交子N3204和N3216同其 糖 化 酵母亲株一样均能水解和发酵糊精，说明它 维普资讯 http://www.cqvip.com 表3．杂交亲株l303和2002与杂交子N3204和N32l6遗传性状比较 1303 I (4—6) 2002 f (3 — 5 x N3204 (5 — 7) N3216 I (5— 7) + l + l + 2．84 2．79 5．04 5．40 们的确获得并表达 _r DEX基因。 图4杂交子和亲株的巨大菌 落 形 态 显 爪，N3204明显不同于亲株1303和2002的菌 落形态。1303菌落中央呈很高的 突 起 状 ， 2oo2~扁平生长，中央哑状，而杂交种N3204 一 方面类似2002呈扁平生长，另一方面又类 似1303中央呈 凸状，然而突起不高。 2．杂交子减数分裂产物的表型分折 为了更好地说明杂交子的遗传背景，这 里以N3204为例，用遗传分析的方法分 析丁 其减数分裂产物的遗传特性 ，列于表 4中。 因 1．杂 种N3204fi9孢子 形态 (240×) 杂 交 种 N3204 图 2．杂交fftN320d与其亲抹1303~2002细胞 形态 (240×) ·27 · ^ ^ ^ ) 7 6 9 9 一 一 一 一 5 4 6 6 ； ( × ( × 维普资讯 http://www.cqvip.com 不发酵 圈 -3． 图 4．杂交种N3204与亲株1303和2Oo2巨大茵落形态 表 4．杂交种N3204减数分裂产物的裘型分析 4 7．84％ 台计i23． 3．92 3 27．45 5．88 43．15 O O 100 一 般说来，杂交子代性状的分离和重组， 必然反映出杂种本身的遗传组成及其双亲的 遗传背景。表 4的数据表明，在糊精发酵方 面，出现了发酵和不发酵两种表型的分离j ·2B· 同时，杂交种N3204的减数分裂产物 其遗传 标记除有亲株类型的分离外，还出现亲株遗 传标记重组新类型——双缺陷型和原养型。 这标志着重组在杂交子中的两个 不 同 种 的 互 ～ i 2 9 5 ● 2 5 5 l 2 l 4 2 ● 9 2 6 “ n 维普资讯 http://www.cqvip.com 双亲基因，在减数分裂中发生了 分 离 和 交 换，也说明我们所获得的杂交种N3204是一 个经过棱配而形成的稳定的台棱型 (Synk— t~yon)杂交细胞。上述实验结果都证 明 了 我们所获得的啤酒酵母和糖化酵母种间杂交 种的真实性，也说明通过传统的杂交方法有 可能改造啤酒酵母的特性，获得稳定的杂交 种。 (兰)啤酒发酵试验 至此，我们已经获得了能够利用糊精的 啤酒酵母杂交种，那么它们是否具有深度利 用麦汁中各种塘类，从而提高啤酒发酵度的 特点呢?为此，我们将啤酒酵母与糖化酵母 杂交种 (1303×2002)和啤酒酵母多倍体亲 株07在l$Oml啤酒发酵中作了比较，发现 几 乎所有的杂交予共酒精生成速率及生成量都 优于亲株O7，共中以N3204和N3216性 能 最 佳。进而我们将此两株杂交种和亲株07进行 了2 L啤 酒 发酵试验，进一步说明了它们具 有快速发酵的特点 (见图 5)。此外，杂交 种N3204和N3216的最终外观发酵度(86．1 年l185．2 )都 显著高 于 啤 酒 酵 母 亲 株07 5 4 ^ 3 鬻 翦 2 1． 圜 5．杂 交种N3204和N3216与亲 棘 啤 酒酵母07在2 L啤酒发酵 中酒精生成速 率及 生成量 (每天测定酒精) 圳 观 发 酵席( 0 6． l t 5． ” 一 —— 一 1 ． r _ 图 6．杂交种N3204和h'3216与啤 酒 酵 母 亲株 07 2 L啤酒 发酵 6天后的 最终 外观发酵度 (69．6 ) (见图 0)。说明DEX基因的存 在，同化和发酵了亲株07所不能利用的大分 子糖类如糊精，这样既提高了麦汁中糖类的 利用速率 ，又提高了啤酒的最终发酵度。 结 论 本文的结果指出，生产用啤酒酵母的改 造可以通过杂交方法来实现，同时，杂交种 中DEX基因的引入，水解了原来啤酒酵母所 不能利用的糊精等大分子糖类，使得麦汁中 塘类的利用速率以及啤酒的最终发酵度得到 r提高，实现了我们改造啤酒酵母的目的， 为以后低热量啤酒的研制提供了可能。 主 要 参 考 文 献 1． Barney， M ． C． ， Ja nsen， G．P． and Helhert， J．R．I Journal of ASBC， 38：1— 5 。 1980 2 ． Em eis， C ． C． } Proc．ASBC，P． 58— 62， 1971 8 ． H0 ckney， R ．C ． and F reem an， R ． F． } “Advance$in Protoplasts Research》 ，P．139一 l44， Budapest： ·29· 维普资讯 http://www.cqvip.com m an Press． 1980 4．Lodder， J．， <