抵当汤及其加味方体外抗肿瘤活性研究

抵当汤及其加味方体外抗肿瘤活性研究¹ 施华平1,孙敏捷2 ,郁红礼3 ,周玲玲3 ,马健1* ( 1 南京中医药大学基础医学院, 江苏 南京 210046; 2 中国药科大学药学院, 江苏 南京 210009; 3 南京中医药大学药 学院,江苏 南京 210046) 摘要:目的 探讨抵当汤及分别加入柴胡、桂枝、黄芪 3个加味方汤剂对人乳腺癌 MCF-7 细胞、人结肠癌 HCT-28 细胞、 人肝癌 H epG-2 细胞的体外抗肿瘤活性的影响。方法 用 MTT 法研究抵当汤及 3 个加味方制剂对 MCF-7 细胞、HCT- 28 细胞、H epG-2 细胞的生长抑制作用。结果 抵当汤对 MCF-7、H epG-2 细胞有明显的生长抑制作用( P< 0. 01) ,分别 加入柴胡、桂枝、黄芪 3 个加味方汤剂对 3 种癌细胞生长抑制作用有明显提高( P< 0. 01) ; 4种汤剂在 72 h 内对 M CF-7、 HCT-28细胞的毒性呈时间依赖性, IC50值在加味方后显著降低,加入柴胡、桂枝方 IC50值可减少至原方的0. 79倍至0. 25 倍。结论 抵当汤对体外肿瘤细胞有活性作用,而加入柴胡、桂枝、黄芪的 3 个加味方活性作用均大于原方抵当汤活性 作用,其中加入柴胡、桂枝的活性作用强于黄芪,抵当汤及加味方对人乳腺癌 MCF-7 细胞的生长抑制最为明显。 关键词:抵当汤; 抵当汤加味方;体外抗肿瘤活性; MTT 法 中图号: R285. 5 文献标志码: A 文章编号: 1000-5005( 2010) 04-0274-04 Study on in Vitro Antitumor Activities of Didang Decoction and its Jia Wei Formula SHI Hua-ping1 ,SUN Min-j ie2 ,YU Hong-li3 ,ZHOU Ling-ling 3 ,MA Jian1* (1Clinical College of N anj ing Univer sity of Chines e Medicine . N anj ing J iangsu ; 2Pharmacy Depar tment, Nanj ing pharmacehnical univ er s ity , N anj ing J iangsu ; 3Pharmacy College, N anj ing Univ er sity of Chinese Medicine Nan- j ing , J iangsu 210046 ,China) ABSTRACT:OBJECTIVE the purpose o f this study is to pr obe into the influence of Didang Decoction and its com- binations with radix bupleuri, cassiatw ig or Astr agalus mongholicus on the in Vitro Antitumo r Activities o f Mamma- ry Cancer MCF-7 cells, Co lon Cancer H CT-8 cells and H epatoma H epG-2 cells. METHOD M TT method w as adopt- ed to study the inhibit ing effects o f D idang Decoction and its three Jia Wei Formulae on Mammary Cancer MCF-7 cells, Colon Cancer H CT-8 cells and H epatoma H epG-2 cells.RESULT Distinct inhibiting effects o f Didang Decoction on Mammary Cancer MCF-7 cells, Colon Cancer H CT-8 cells and H epatoma HepG-2 cells w ere detect ed, and after the above thr ee Jia Wei Formulae w ere r espectiv ely added to Didang Decoction, an r emarkably incr eased inhibiting effect was obser ved. The four Decoctions, as to t he to xicity o f the MCF-7、HCT-28 cells, wer e time-dependent. The IC50 value dr opped dramatically after adding the Jia Wei Fo rmula, and it even declined to 0. 79 t imes to 0. 25 times of t he or iginal.CONCLUSION Didang Decoction has act ive effect on the in V itro tumor cells, and this effect is en- hanced after adding the Jia Wei Formulae like radix bupleuri, cassia tw ig o r A strag alus mongho licus, and the effect is more obvious in the decoction w ith radix bupleur i o r cassia tw ig , w hile the most ev ident inhibit ion of Didang Decoc- t ion and its Jia Wei Formulae w as observed in br east cancer cell MCF-7. KEY WORDS: Didang Decoction; Didang Decoction Jia Wei Formula; in V itr o Antitumo r Activit ies; MTT M et hod; MCF-7 cell; H CT-28 cell; H epG-2 cell 抵当汤是张仲景5伤寒杂病论6中主要用于治 疗太阳阳明蓄血证和妇人杂病经水不利、瘀血日 久之证的经典活血化瘀方,现代文献报道可用于 治疗多种恶性肿瘤, 为证实抵当汤及加味方的抗 肿瘤作用,本文采用 MT T 实验法[ 1] 研究抵当汤 及其加味方对体外肿瘤细胞的活性作用,并通过 )274) 南京中医药大学学报 2010年 7 月第 26 卷第 4 期 JOURN AL OF NANJIN G TCM UNI VERSIT Y Vol . 26 No.4 July . 2010 ¹ 收稿日期: 2010-02-03;修稿日期: 2010- 03-09 基金项目:国家/ 重大新药创新0科技重大专项( 2009ZX09310-004) 作者简介:施华平( 1973- ) ,男,江苏南通人,南京中医药大学助理研究员,本校 2006级博士研究生。* 通信作者: 025-85811928 细胞实验了解仲景活血化瘀方的配伍规律和活血 化瘀方中加入行气、补气、温经药后的药效作用。 1 材料 1. 1 仪器 IX71-F22FL/ PH 荧光倒置显微镜: Olym- pus; T hermo Labsy stems MK3酶标仪: T hermo Elect ron Corporat ion; IGO150 型 CO2 培养箱: Thermo Elect ron Corpo ration; SW-CJ-1F 洁净 工作台:苏州安泰空气技术有限公司; Fo rma3111 型水套式 CO 2培养箱:上海智理科学仪器有限公 司。 1. 2 材料 MCF-7细胞、HCT-28 细胞、HepG-2 细胞: 中国科学院上海细胞库; 小牛血清:杭州四季青生 物工程材料有限公司,批号: 080823; DMEM 基础 培养基: 美国 GIBCO公司,批号: 498387;青霉素 G钠盐、硫酸链霉素: 美国 AMRESCO公司, 无菌 水配置,过滤除菌, 分装小瓶,-20 e 保存; 胰蛋白 酶:美国 AMRESCO公司,用 PBS配成 0. 05%胰 蛋白酶溶液, 过滤除菌, 分装小瓶,-20 e 保存; MT T: 美国 AMRESCO公司;分析纯二甲基亚砜 ( DM SO) :上海凌峰化学试剂有限公司。 2 方法 2. 1 细胞培养 MCF-7、HCT-28、HepG-2 细胞为贴壁生长 型细胞,使用 DMEM 培养液(含 10﹪小牛血清, 100 U/ mL 青霉素, 100 U/ mL 链霉素, pH7. 4)在 37 e , 5% CO 2 培养箱中全湿度培养。细胞生长 至 80%融合时传代, 传代时用 D-Hanks洗涤 2~ 3次后, 0. 05%胰蛋白酶消化, 倒置显微镜下观察 消化细胞,胞质回缩,细胞间不再连接成片时明 消化适度。吹打制成细胞悬液, 离心吸除上清液 加入新鲜培养液重新制成单细胞悬液, 以适当的 细胞密度分装至干净培养瓶,放入 CO 2 培养箱中 继续培养。传代后隔天换液。 2. 2 抵当汤及加味方提取液的制备 2. 2. 1 抵当汤剂量换算 抵当汤原方水蛭 30 个(熬) , 虻虫 30枚(熬, 去翅足) , 桃仁 20个(去皮尖) ,大黄 3两(酒浸) , 经换算成水蛭 6 g,虻虫 3 g,大黄 9 g,桃仁 6 g。 2. 2. 2 抵当汤制剂制备 水蛭 102 g, 虻虫 51 g ,大黄 153 g ,桃仁 102 g。以上药物同一批次购于南京中医药大学附属 医院中药房,以上 4味药物经生药鉴定为真品,水 煎煮 3次,过滤, 浓缩成1 000 mL 药液,每毫升含 0. 408 g 生药, 灭菌, 4 e 保存备用。 2. 2. 3 抵当汤 3个加味方制剂制备 以抵当汤原方为基础每剂分别加入柴胡 6 g,桂枝 9 g ,黄芪 10 g。 抵当汤方加柴胡: 水蛭 24 g ,虻虫 12 g, 大黄 36 g, 桃仁 24 g , 柴胡 24 g。以上药物同一批购 买,经生药鉴定为真品,水煎煮 3次,过滤,浓缩成 450 mL 药液,每毫升含0. 266 7 g 生药,灭菌, 4 e 保存备用。 抵当汤方加桂枝: 水蛭 24 g ,虻虫 12 g, 大黄 36 g, 桃仁 24 g , 桂枝 36 g。以上药物同一批购 买,经生药鉴定为真品,水煎煮 3次,过滤,浓缩成 450 mL 药液,每毫升含0. 293 4 g 生药,灭菌, 4 e 保存备用。 抵当汤方加黄芪: 水蛭 24 g ,虻虫 12 g, 大黄 36 g, 桃仁 24 g , 黄芪 40 g。以上药物同一批购 买,经生药鉴定为真品,水煎煮 3次,过滤,浓缩成 450 mL 药液, 每毫升含 0. 302 g 生药, 灭菌, 4 e 保存备用。 2. 3 MCF-7细胞抵当汤孵育后的形态学观察 MCF-7人乳腺癌细胞株给药 20 g / L 抵当 汤,于倒置显微镜下观察给药 48 h 后的细胞形 态,以正常培养细胞为对照。 2. 4 MTT 法测定抵当汤及加味方汤剂对细胞 增殖的影响 2. 4. 1 抵当汤及加味方汤剂稀释液的制备 将药液用 PBS 缓冲溶液 2 倍稀释后经 0. 22 Lm 滤膜过滤除菌, 给药时以此为起始浓度稀释 后给药。 2. 4. 2 实验过程 本实验以阿霉素作为对照物, 通过 MTT 分 析法测定抵当汤及加味方汤剂对 MCF-7、HCT- 28及 HepG2细胞的抗肿瘤活性。取处于对数生 长期的肿瘤细胞 MCF-7 制成密度为 1. 0 @ 105 cell/ mL 的细胞悬液, 取 96孔细胞培养板, 设置 不加细胞只含培养介质的空白调零孔, 以及不加 药液的阴性对照孔。对于给药孔, 每孔加入 100 LL 的细胞悬液和 100 LL 不同浓度的上述汤剂, 每个浓度的化合物设 5个复孔,在 37 e 、5% CO2、 1 640+ 10%小牛血清培养基中培养 48 h 后每孔 加 20 LLMT T( 5 mg/ mL) ,反应 4 h 后弃去上清 )275)施华平,等: 抵当汤及其加味方体外抗肿瘤活性研究 第 4 期 液,每孔加如 150 LLDMSO, 吹打均匀。用酶标 仪在 570 nm 处测吸光度。 细胞增殖抑制率( IR) = ( 1- 试验组 OD 平均值/对照组 OD平均值) @ 100% 剂量对数线性回归法计算半数抑制浓度 IC50 值。 2. 4. 3 给药方案 ( 1)抵当汤对各细胞株的生长抑制作用: 抵当 汤给药浓度为 20 g/ L ; 阿霉素给药浓度为 1. 25 mg/ L; 给药时间为 48 h。 ( 2)抵当汤加味方制剂抗肿瘤作用的时间依 赖性:给药时间为 12、24、48、72 h; 给药浓度为 MCF-7 细胞 5 g/ L, HCT-28 细胞 25 g / L (因 MCF-7细胞对抵当汤比较敏感, 在抵当汤低浓度 下就可以较大程度的抑制该细胞的生长,因此选 择 5 g/ L 作为考察时间依赖性的实验浓度)。 ( 3)半数抑制浓度 IC50值:抵当汤各加味方制 剂给药浓度为 MCF-7 细胞: 0. 312 5、0. 625、 1. 25、2. 5、5、10、20 g/ L ; H CT-28 细胞: 1. 61、 3. 125、6. 25、12. 5、25、50、100 g/ L; HepG-2 细 胞: 0. 625、1. 25、2. 5、5、10、20、40 g/ L。给药时间 为 48 h。 3 结果 3. 1 形态学影响 插页 Ò图 1是 MCF-7细胞在抵当汤孵育 48 h前后的显微镜照片。可以发现: 空白对照组 MCF-7细胞呈正常生长状态,细胞铺展、分裂,形 态规则,分布也比较均匀。加入抵当汤( 20 g/ L) 给药 48 h后,抑制作用明显,细胞皱缩碎裂, 大部 分细胞空泡化严重, 剩下细胞骨架,呈明显的死亡 状态。 细胞形态观察实验证明, 本文中所研究的抵 当汤剂对 MCF-7细胞生长有明显的抑制作用,可 就抵当汤及加味方制剂对肿瘤细胞生长的抑制作 用做进一步的研究。 3. 2 抵当汤对各细胞株生长抑制作用 结果见表 1。 表 1 抵当汤及阿霉素对各细胞株的生长 抑制作用( Šx ? s, n= 4) 组别 抵当汤/ % 阿霉素/ % MCF-7 83. 33 ? 2. 93 77. 78 ? 2. 21 HCT-28 8. 471 ? 2. 60 81. 56 ? 2. 48 H epG-2 73. 23 ? 2. 64 88. 97 ? 3. 47 表 1是抵当汤稀释液( 20 g / L )及阿霉素溶液 ( 1. 25 mg/ L )对各细胞株的生长抑制作用结果。 由表可以看出, 抵当汤对 MCF-7、HCT-28、 HepG-2细胞均有一定的杀伤能力, 尤其是 MCF- 7和 HepG-2细胞,在给药 48 h后即可抑制细胞 生长的 70%以上,与阳性对照阿霉素的细胞抑制 效果相当,显示了明确的抗肿瘤效果。抵当汤对 HCT-28细胞的抑制作用稍弱, 但是在延长时间 由 48 h至 72 h后,抑制作用由( 8. 471 ? 2. 60) % 提高至( 24. 37 ? 3. 58) % ,证明抵当汤可能具备抑 制 HCT-28细胞的能力,但是给药浓度或培养时 间可能还需要进一步调整,才可以显示更好的生 长抑制效果。提示可以采用这 3 种细胞株用 MT T 法研究抵当汤的抗肿瘤作用, 而且抵当汤 对 MCF-7、HCT-28、HepG-2这几种常见的肿瘤 细胞有明确的生长抑制作用, 值得进一步研究其 体内外抗肿瘤作用及机制。 3. 3 抵当汤及加味方制剂抗肿瘤作用的时间依 赖性 抵当汤及加柴胡、桂枝、黄芪加味方( 5 g/ L ) 对于 MCF-7细胞生长抑制作用的时间依赖性如 插页 Ò图 2所示,各汤在 72 h 内对 MCF-7细胞 的毒性随时间增加而增加,证明确实有生长抑制 作用,并且, 抵当汤的毒性最低, 而抵当汤加柴胡 的毒性最高。在给药 72 h差距较大, 生长抑制率 分别为( 79. 28 ? 7. 46) %、( 43. 17 ? 2. 49) %。可 见抵当汤加味方可明显改善抵当汤的体外抗肿瘤 作用。 插页 Ò图 3 为各加味方汤剂 ( 20 g/ L ) 对 HCT-28细胞的毒性随给药时间变化趋势图, 由 图可以看出,各汤在 72 h 内对 HCT-28细胞的毒 性随时间增加而增加,证明确实有生长抑制作用, 并且抵当汤的毒性最低, 而抵当汤分别加入桂枝、 柴胡、黄芪的 3个加味方毒性作用均远高于抵当 汤。在给药 72 h 差距较大, 抵当汤抑制率为 ( 24. 37 ? 3. 58) %,其他各汤均为 85%以上,可见 抵当汤加味方可显著改善抵当汤的体外对 HCT- 28细胞的毒性作用。 综合 2种细胞各时间点细胞毒性可以看出, 对于 MCF-7及 HCT-28细胞,加入柴胡和桂枝后 的抵当汤加味方的细胞毒性可显著增强,而加入 黄芪的汤剂的改善作用相对较弱, 但是也比抵当 汤有所提高。 )276) 南京中医药大学学报 2010年 7 月第 26 卷第 4 期 3. 4 抵当汤及各加味方汤剂的抗肿瘤作用比较 因为 MCF-7及 HepG-2细胞对抵当汤比较 敏感,所以在抵当汤低浓度下就可以较大程度的 抑制该细胞的生长, 因此选择 10 g / L 作为考察时 间依赖性的实验浓度, 而 H CT-28细胞则需要抵 当汤较大浓度下才可以显示细胞毒性, 因此本实 验中选择 25 g/ L 各加味方汤剂考察不同加味方 汤的毒性差异。 插页 Ò图 4为给药 48 h后抵当汤及加味方 汤剂对 MCF-7、HCT-28、HepG-2 3 种细胞的生 长抑制作用,可见 3 种细胞对加味方汤剂的敏感 度较好, 和抵当汤相比, 毒性都有显著增加,尤其 是抵当汤加柴胡方,在 3种细胞的生长抑制作用 均可达 60%以上,抵当汤加桂枝方也可以明显提 高抵当汤的抗肿瘤作用,能明显提高抵当汤的抗 癌活性,抵当汤加黄芪方汤剂对抵当汤的提高作 用稍弱。 3. 5 抵当汤各加味方汤剂的抗肿瘤 IC50 MT T 实验测定化合物的 IC50一定程度上可 以反映化合物的抗肿瘤活性 [ 2] , 一般按照下面的 标准判断:单体纯品化合物,其 IC50 < 10 Lmo l/ L 认为有细胞毒活性, 为阳性结果;活性强弱: IC50 < 5 Lmo l/ L 认为活性强; IC50为 5~ 10 Lmo l/ L 为较强; IC50 > 10Lmol/ L 则认为无明显活性[ 3]。 对于抵当汤这种中药汤剂,无法求算其准确的摩 尔浓度,只能以质量浓度来判断活性强弱。结果 见表 2。 表 2是抵当汤及抵当汤加柴胡、桂枝、黄芪 3 个抵当汤加味方对 MCF-7、H CT-28、HepG-2 3 种细胞的 IC50结果, IC50值越小,表明抗肿瘤活性 越强,因此,由表可见,各汤剂对 MCF-7细胞的生 长抑制最为明显, 抵当汤、抵当汤加柴胡、抵当汤 加桂枝、抵当汤加黄芪分别为( 8. 918 ? 0. 385)、 ( 4. 016 ? 0. 245)、( 3. 644 ? 0. 165)、( 7. 006 ? 0. 415) g/ L ,并且抵当汤加桂枝、抵当汤加柴胡对 MCF-7的抑制作用最为明显, 而黄芪次之( P< 0. 01)。对于 HCT-28及 HepG2细胞也和 MCF- 7一致, 加入桂枝、柴胡的抵当汤体外毒性改善更 为明显,抵当汤加桂枝方、抵当汤加柴胡方 IC50值 显著降低( P< 0. 01) ,可减少至原方的 0. 79倍至 0. 25倍。 表 2 抵当汤及其加味方汤剂的各细胞株 IC50 ( Šx ? s, g / L , n= 4) 组别 MCF-7 H CT-28 H epG-2 抵当汤 8. 918 ? 0. 385 76. 870? 2. 744 13. 860 ? 0. 543 抵当汤+ 柴胡 4. 016? 0. 245* * 19. 990 ? 0. 654* * 8. 248 ? 0. 352* * 抵当汤+ 桂枝 3. 644? 0. 165* * 19. 430 ? 0. 844* * 10. 950 ? 0. 755* * 抵当汤+ 黄芪 7. 006? 0. 415* * 57. 490 ? 1. 832* * 15. 210 ? 0. 919 注:与抵当汤组比较, * P < 0. 05, * * P< 0. 01。 4 讨论 抵当汤加入柴胡、桂枝、黄芪的 3个加味方活 性作用均大于原方抵当汤活性作用, 其中加入柴 胡、桂枝的活性作用相比黄芪又更为明显,抵当汤 及加味方对人乳腺癌 MCF-7 细胞的生长抑制最 为明显。 从抵当汤和其加味方的抗肿瘤活性来认识方 剂的配伍规律, 在活血化瘀方中加入行气药、温经 药和补气药后作用都有不同程度的增加。疾病常 因正气不足, 脾胃虚损所致, 胃主降浊而排糟粕、 脾主升清而化精微, 脾气不升则水液停滞,瘀血生 焉, 行气药具有行使阳道, 鼓动血中之气而行瘀 滞,故仲景常在活血化瘀药中加入行气之药, 如薯 蓣丸中柴胡等。桂枝是仲景在用于活血化瘀方面 最多的药物之一,桂枝色赤而入血,善行四肢而不 守, 味辛能行滞散结, 性温可通阳化瘀并善开结 气,在活血化瘀药中加入桂枝能行滞散结,如桂枝 茯苓丸等。凡虚弱之体, 其脉道必然不充,气血虚 损,血行迟缓, 久则凝而成瘀, 中医理论云: /气为 血帅,血为气母0,加入补气药应能推动血行,有助 于活血化瘀,但在本实验中加入黄芪效果不是十 分明显,在以后的实验中进一步探讨。 参考文献: [ 1]秦婷婷,唐东平. 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