第8章 核酸分子杂交

null第八章    核酸分子杂交技术第八章    核酸分子杂交技术湖北医药学院 郭兴荣提要：内容提要：第二节 探针的设计与标记第三节 分子杂交第四节 核酸分子杂交技术的应用 第一节   核酸杂交的基本原理与分类目的与要求：目的与要求：1. 掌握 核酸分子杂交技术的基本原理及分类和应用，探针、原位杂交的概念 2. 熟悉 探针的类型及其标记方法，杂交信 号的检测方法 第一节    核酸杂交基本原理与分类 第一节    核酸杂交基本原理与分类 基 本 概 念基 本 概 念单链的核酸分子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交体的过程称核酸分子杂交（molecular hybridization） 利用核酸分子杂交检测靶序列的一类技术称核酸分子杂交技术 探针（probe）：用放射性核素或非放射性物质标记的一段单链或双链核苷酸，可于互补序列的待测核酸进行杂交，以探测它们的同源程度一、核酸分子杂交的基本原理与分类 （一）核酸分子杂交的基本原理 1、变性（denaturation） （1）定义： 在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，双链解链成为单链。 一、核酸分子杂交的基本原理与分类 （一）核酸分子杂交的基本原理 1、变性（denaturation） （1）定义： 在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，双链解链成为单链。 null（2）.引起核酸变性的因素酸 碱热变性剂 （尿素）有机溶剂 （乙醇）（3）、变性核酸的特点： 粘度下降 沉降速度增加 浮力上升 紫外吸收增加 （3）、变性核酸的特点： 粘度下降 沉降速度增加 浮力上升 紫外吸收增加 2、融解温度： 定义：在DNA热变性时，其A260的升高达最 大值一半时的温度。 2、融解温度： 定义：在DNA热变性时，其A260的升高达最 大值一半时的温度。 nullnull影响Tm的因素： （1） DNA碱基的组成 G-C含量越多 Tm值越高 A-T含量越多 Tm值越低null（2）溶液的离子强度 低离子强度 Tm值越低 高离子强度 Tm值越高（3）pH值 pH值5-9 Tm值变化不明显 pH<4 pH>11 不利于氢键形成 （4）变性剂 干扰碱基堆积力和氢键的形成 3、复性 变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程。 影响复性速度的因素： DNA浓度 DNA片段的大小 DNA片段复杂性 合适的复性温度 适当的离子强度 3、复性 变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程。 影响复性速度的因素： DNA浓度 DNA片段的大小 DNA片段复杂性 合适的复性温度 适当的离子强度 null4、杂交 4、杂交 定义 两条来源不同，但具有 互补序列的核酸，按碱基配 对原则复性形成一个杂交体， 这个过程即杂交，或称分子 杂交。分类 DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNAnull 二、杂交的基本分类二、杂交的基本分类 （一）液相杂交 （二）固相杂交 （三）原位杂交 （四）基因芯片技术点杂交/狭缝杂交 菌落杂交 Northern 杂交 Southern杂交nullMASA液相芯片二、杂交的基本分类二、杂交的基本分类 MASA是一种在悬浮液态体系中进行的生物分子间反应，并以100种不同荧光编码的微球作为探针的一类新型生物芯片技术。它集合了流式细胞技术、数字信号处理技术、激光技术及传统化学技术为一体，是一种新型生物分子检测技术。其反应体系中可以进行大分子蛋白、小分子蛋白、核酸等生物的检测 二、杂交的基本分类MASA技术的原理是用不同的荧光颜色对乳胶颗粒进行编码使之具有检测多个靶分子的能力 二、杂交的基本分类二、杂交的基本分类二、杂交的基本分类2.Southern blot3.Northern blot4.点杂交和狭缝杂交5.荧光原位杂交6.基因芯片1.菌落杂交1.菌落杂交1.菌落杂交null2.Southern blot3、 Northern印迹杂交 应用DNA探针检测特异mRNA的一种杂交技术，主要用于分析mRNA的转录或mRNA分子大小，其方法类似于Southern印迹杂交。 3、 Northern印迹杂交 应用DNA探针检测特异mRNA的一种杂交技术，主要用于分析mRNA的转录或mRNA分子大小，其方法类似于Southern印迹杂交。 null3.Northern印迹杂交4.点杂交和狭缝杂交 4.点杂交和狭缝杂交 DNA样品点到滤膜上1 变性 2 中和 3 固定DNA 4 与标记探针杂交 5 洗脱与显影探针DNA探针标记 变性将探针加到固定的DNA上 1、定义： 将标记探针与细胞或组织中的核酸按碱基配对原则进行特异性杂交，并应用组织化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因达的检测技术称为原位杂交（hybridization in situ)。 2、操作步骤： 载片的清洁与处理 组织与细胞的固定 探针 湿盒 1、定义： 将标记探针与细胞或组织中的核酸按碱基配对原则进行特异性杂交，并应用组织化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术称为原位杂交（hybridization in situ)。 2、操作步骤： 载片的清洁与处理 组织与细胞的固定 探针 湿盒 5.荧光原位杂交(fluoresence in situ hybridization,FISH)null5.荧光原位杂交(fluoresence in situ hybridization,FISH)null6.基因芯片是集成化的核酸分子杂交技术第二节 探针的设计与标记 第二节 探针的设计与标记 null（一）探针种类的选择 DNA探针是最常用的核酸探针，长度在几百bp以上的双链或单链DNA片段放射性或非放射性标记的RNA分子，用于探测与之互补的DNA或RNA链，RNA探针通常通过克隆相应DNA在体外转录合成而制备 RNA探针 寡核苷酸探针一般有17-50个核苷酸组成，可以是寡聚脱氧核醣核酸、寡聚核糖核酸和肽核酸null（二）标记方法 　1.探针标记物的选择 1）放射性标记 　125I，3H，14C用于蛋白质标记；32P，3H，35S 用于核酸标记，其中32P和35S使用频率高。32P标记核苷酸的α位或γ位，35S则是标记核苷酸的α位.null1）放射性标记 特点： ①检测特异性强；②灵敏度高；③对酶促反应无任何影响，也不影响碱基配对的特异性和稳定性；④易造成放射性污染；⑤半衰期短的同位素应用受到限制，随用随标记，立即使用，不能长时间存放。null（二）标记方法 　1.探针标记物的选择 2）非放射性标记 　i. 生物素 分离自蛋黄的水溶性维生素，它可以和分离自蛋清中的一种碱性蛋白—抗生物素蛋白牢固地结合。每个抗生物素蛋白可结合4个生物素分子。此外，链霉菌抗生蛋白与生物素结合更牢固，可大大提高其灵敏度。 生物素可以经过化学法与不同的化合物结合形成标记化合物。 ii. 半抗原 包括汞，2-乙酰胺二苯丙茂，地高辛配体和金属铕。 地高辛配体是一种脂质半抗原，可将其连在dUTP上，然后用酶将其掺入新合成链中。检测上述标记物的方法是利用二抗-酶偶联物反应和显色反应。（二）常用的非放射性标记 （二）常用的非放射性标记 优点：无环境污染，可较长时间贮存方法：1.酶标记法 2.化学标记法要求：标记物应具有耐热、对组织细胞无特异亲和性、分子量小，对探针杂交无影响或影响甚小，不影响DNA三维空间构象的形成。 常用的标记物：生物素（biotin）、地高辛（digoxigenin）、光生物素（photobiotin）、补骨脂素、2-乙酰氨基芴（2-acetylomino fluorene）null2.探针标记方法的选择 随机引物标记 DNA缺口平移标记 全程RNA探针标记 化学法全程标记 3′末端标记 5′末端标记 nullnullDNaseⅠDNA聚合酶Ⅰ （5’－3’核酸外切酶活性）DNA聚合酶Ⅰ（5’－3’核酸外切酶活性 5’－3’ 聚合酶活性）＋3dNTP＋1dNTP# DNaseⅠDNA聚合酶Ⅰ（5’－3’核酸外切酶活性5’－3’ 聚合酶活性）DNA切开模板DNA形成一到几个碱基的缺口掺入标记基团缺口平移DNA缺口平移标记全程RNA探针标记在△处酶切在◆处酶切从T7启动子转录从SP6启动子转录全程RNA探针标记一、设计原理一、设计原理 化学法全程标记 与地高辛标记的探针杂交加入与碱性磷酸酶结合的 抗地高辛抗体加入 底物BCIP/ NBTCSPD一、设计原理一、设计原理末端标记3’-末端标记5’3’3’5’5’末端突出的DNA5’5’3’3’3’末端标记的DNA完整双链DNAKlenowDNA聚合酶 32p—dNTP 变性32p末端标记的 单链DNA探针第三节 分子杂交第三节 分子杂交分 子 杂 交 原 理 及 流 程 图样 品 制 备电 泳杂 交转 膜结果显示探 针 制 备操作步骤一、核酸分子与固相介质的结合 操作步骤二、杂交三、信号检测一、核酸分子与固相介质的结合一、核酸分子与固相介质的结合(一）支持介质的类型和性质 硝酸纤维薄膜： 1）硝酸纤维素滤膜(Nitrocellulose filter, NCF) 可与三类大分子的结合，其机理不清楚，可能为被动吸附。 NCF不能结 合小分子DNA，RNA和蛋白质（<20,000） 优点：用于DNA，RNA杂交分析时结果可靠，灵敏，本底低。 缺点： 反复使用探针次数有限（2-3次）一、核酸分子与固相介质的结合一、核酸分子与固相介质的结合(一）支持介质的类型和性质 （2）尼龙膜 i. 阳离子尼龙膜 i) 容量大, 蛋白质可结合480μg/cm2 ii) 可结合不同大小的DNA，RNA和蛋白质。 iii) 韧性好 iv) 可用于电转移 v) 可进行反复多次杂交试验 vi) 广泛的化学耐受性和可高温消毒 ii. 尼龙66 广泛用于核酸印迹分析，静电荷可从pH4时阳离子状态转变为pH7时阴离子状态，电转移时要注意。 （3）离子膜 i. DEAE-纤维素纸 ii. CM-纤维素纸（二）核酸分子的转移（二）核酸分子的转移1、噬菌体/克隆的转移 一、核酸分子与固相介质的结合一、核酸分子与固相介质的结合一、核酸分子与固相介质的结合2、从凝胶上转移DNA 毛细虹吸转移 真空转移 正压转移 一、核酸分子与固相介质的结合一、核酸分子与固相介质的结合2、从凝胶上转移DNA 毛细虹吸转移： 利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上。 一、核酸分子与固相介质的结合一、核酸分子与固相介质的结合2、从凝胶上转移DNA 真空转移: 转移速度与凝胶的速度和厚度成反比，在相同转移率（50%）时，真空法比毛细管法快13倍，其损失仅6%，而毛细管法损失率20%。一般1-2小时可以完成。 正压转移: 原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。 一、核酸分子与固相介质的结合一、核酸分子与固相介质的结合3、电泳转移 主要应用与小片段DNA从凝胶上转移到薄膜。整个转移在低浓度溶液中进行，以避免过热导致凝胶变形，同时需要冷却装置。转移时间由DNA片段大小决定，一般需要3小时。一、核酸分子与固相介质的结合4. 各种转移方法的比较 i) 毛细管法：操作简便，不需要特殊转移仪器，但转移效率低,（扩散法为70%，毛细管法80%）耗时多。 ii) 电转移法：效率高，耗时少，需特殊转移仪，对转移条件要求较严。 iii) 真空转移法：效率高，耗时最少，需特殊真空转移仪。5. 转移的最佳条件 i) 固定基质的选择 ii) 转移前预处理：DNA和RNA分子变性 iii)大分子的转移 　对于分子量较大的DNA片段，必须进行原位断裂后再进行转移，断裂DNA分子最佳长度为1-2kb。 其步骤是： 0.25M HCl处理凝胶两次（每次15分钟）→水洗→0.5M NaOH/1M NaCl两次，每次15分钟→转移。 一、核酸分子与固相介质的结合一、核酸分子与固相介质的结合一、核酸分子与固相介质的结合（二）核酸的固定(1)、烘烤 80℃2小时，核酸与薄膜非共价键结合，易脱落。 (2)、紫外光固定 仅需几分钟，照射时间有薄膜湿度决定。核酸与薄膜共价键结合。 (3)、碱固定 利用碱溶液转印RNA或DAN，核酸与薄膜共价键结合。 null二、杂交 1.预杂交 2.杂交 3.洗脱 杂交的基本程序杂交的基本程序预杂交： （1）目的：减少非特异性杂交 （2）成分： 去污剂：1%SDS （可促进溶液对薄膜的覆盖，可 抑制RNase酶活性） 封闭剂：Denhard氏溶液 预杂交液中常加入鲑鱼精DNA，若标记探针是cDNA或RNA， 预杂交液中还需加入多聚A以阻止特异性结合, 42℃ 4-6h或过夜。杂交的基本程序杂交的基本程序 杂交： 探针100℃变性，迅速冷却，加入预杂交液中，42℃一天（8h）。 杂交杂交影响杂交的因素 （1）影响长探针杂交的因素 1）影响杂交速率和杂化分子稳定性的因素 ◇核酸分子浓度与杂交速率 ◇高浓度双链探针的杂交 ◇碱基组成：探针的Tm高，杂交速率快 ◇盐浓度：离子强度与杂交速率成正比；与杂交稳定性 也成正比。 ◇温度：与杂交速率成正比。 ◇甲醛：可降低Tm值。 ◇错配的核酸序列：错配降低杂交速率。 ◇杂交的加速剂杂交杂交（1）影响长探针杂交的因素2）酶联探针 3）杂交反应体积 4）杂交时间null洗 脱除去溶液 未反应的探针 与滤膜疏松结合的探针 非特异性结合的探针null 操作步骤： 2×SSC+0.1%SDS常温洗涤两次，1×SSC+0.1%SDS 65℃洗涤两次，每次15分钟。若使用低聚核苷酸探针，洗涤温度按下式计算： T=4GC+2AT * 高强度与低强度杂交：若具高度特异性同源序列，采用高强度杂交条件；若使低同源性DNA之间杂交，则采用低强度杂交条件。这两种条件之差异表现在杂交液和洗涤液的离子强度以及杂交和洗涤时的温度。 洗 脱三、信号检测三、信号检测（二）非放射性杂化分子的检测（一）放射自显影null （一）放射自显影 1.直接放射自显影 2.间接放射自显影放射自显影 放射自显影 三、信号检测null（二）非放射性杂化分子的检测 　 1.直接检测 　　 2.间接检测 　　 3.显色底物检测 　　 4.化学发光底物检测 　　 5.多探针检测null与地高辛标记的探针杂交加入与碱性磷酸酶结合的抗地高辛抗体加入 底物BCIP/ NBTCSPD三、信号检测第四节 核酸分子杂交技术的应用 第四节 核酸分子杂交技术的应用 第四节 核酸分子杂交技术的应用第四节 核酸分子杂交技术的应用二、Northern杂交技术三、原位杂交技术四、液相杂交技术一、Southern杂交技术一、 Southern杂交技术（一）单基因遗传病的基因诊断 （二）基因突变的检测一、 Southern杂交技术二、Northern杂交技术二、Northern杂交技术（一）RNA病毒的检测 （二）基因表达的检测三、原位杂交技术三、原位杂交技术 （一）细胞遗传学分析 （二）比较基因组杂交 （三）基因图谱绘制 （四）病原学检测 null线粒体DNA的8个突变位点膜杂交结果32563290331633943593360636183688野生型突变型四、液相杂交技术Northern杂交对基因代表水平的检测Northern杂交对基因代表水平的检测GAPDH靶基因病人组 对照组四、液相杂交技术null应用 • DNA染色体分析 • 三体分析 • 染色体作图 分裂间期研究 产前诊断 CGH Metaphase Chromosom 1, FITC Chromosom 12, TRITC Chromosom 17, FITC and TRITC Nucleoli Chromosom 13q14, FITC Chromosom 21, TRITC nullFISH显微摄影术间期细胞核 FITC/TRITC Double Filterset 24分裂中期和间期 FITC/TRITC/DAPI Triple Filterset 25null多种荧光数码片Human Chromosome 5 6 Cosmid Clones by courtesy of Th. Ried null24 色荧光原位杂交或 M-FISH分裂中期核型杂交技术临床应用总结杂交技术临床应用总结出生缺陷干预 唐氏综合征 地中海贫血 神经管缺损 苯丙酮尿症 G6PD SNPs 感染性疾病的鉴别诊断 药物敏感性 亲子鉴定肿瘤的分子病理学 血液病 乳癌 肝癌 胃癌 肺癌 膀胱癌 结肠癌DNARNA