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2 蛋白质

2012-10-25 14页 doc 131KB 89阅读

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2 蛋白质第二章 蛋白质 第1节 概述 •字源 “蛋白质”英文名称protein,来源于希腊文protos(首要的,最基本的意思)。 •蛋白质的化学组成 蛋白质是一种高分子含氮化合物,分子量一般在一万到一百万,甚至高达数百万。 一、蛋白质的定义 一切生物体中普遍存在的,由天然氨基酸通过肽键连接而成的生物大分子;其种类繁多,各具 有一定的相对分子质量、复杂的分子结构和特定的生物功能;是表达生物遗传性状的一类主要 物质。 二、蛋白质的化学组成 1、元素组成 主要元素:C、H、O、N、少量S 其他元素:P和一些金属元素...
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第二章 蛋白质 第1节 概述 •字源 “蛋白质”英文名称protein,来源于希腊文protos(首要的,最基本的意思)。 •蛋白质的化学组成 蛋白质是一种高分子含氮化合物,分子量一般在一万到一百万,甚至高达数百万。 一、蛋白质的定义 一切生物体中普遍存在的,由天然氨基酸通过肽键连接而成的生物大分子;其种类繁多,各具 有一定的相对分子质量、复杂的分子结构和特定的生物功能;是达生物遗传性状的一类主要 物质。 二、蛋白质的化学组成 1、元素组成 主要元素:C、H、O、N、少量S 其他元素:P和一些金属元素(Fe,Cu,Mn,Mo,Co,Zn,Mg,Ca等) 蛋白质元素组成的特征是∶ 无论样品来源如何,其含N量比较稳定,一般在15-17%,平均16%。 蛋白质含量和含氮量关系: 将16%取倒数得到6.25,称为蛋白质换算系数,即1克的N相当于6.25克的蛋白质。这是凯氏定氮 法测定生物样品中蛋白质含量的基础。测定出含N量,乘以蛋白质换算系数,可推算出样品的 粗蛋白含量。 粗蛋白% == N% ( 6.25 2. 蛋白质的基本结构单位 比较: A. 淀粉 → 兰糊精 → 显红糊精 → 消色糊精→ 麦芽糖 → 葡萄糖 B. 蛋白质→ 多肽 → 寡肽 → 二肽 → α-氨基酸 结果表明氨基酸是蛋白质的基本结构单位。 三、蛋白质的分类 1、 根据蛋白质的分子形状分类 球状蛋白质----近似球形或卵圆形,易溶解、能成结晶。 纤维状蛋白质----分子形状不对称,类似棒状或纤维状。多数不溶于水。 2、根据蛋白质的化学组成分类 简单蛋白质----完全水解产物只有氨基酸,如∶溶菌酶 结合蛋白质----由简单的蛋白质和非蛋白质成分结合而成。其中非蛋白质成分称为辅基, 往往是小分子有机物或无机离子,常见的有:血红素、黄素核苷酸、辅酶A、磷酸, Fe2+、Cu2+等。如∶血红蛋白(血红素) 3、结合蛋白质的溶解度和组成分类 简单蛋白质 清蛋白∶溶于水。 球蛋白∶微溶于水,而溶于稀盐溶液。 谷蛋白∶不溶于水、醇及盐溶液,但溶于稀酸或碱。 醇溶蛋白∶不溶于水,但溶于70-80%的乙醇。 精蛋白∶ 溶于水及酸性溶液,呈碱性。 组蛋白∶ 溶于水及稀酸性溶液,含较多的精氨酸和赖氨酸。 硬蛋白∶不溶于水、盐、稀碱、稀酸溶液。 结合蛋白质 核蛋白:辅基为核酸 脂蛋白:与脂类结合而成 糖蛋白:与糖类结合而成 磷蛋白:含羟基氨基酸与磷酸结合而成 血红素蛋白:以血红素为辅基 黄素蛋白:以黄素核苷酸为辅基 金属蛋白:辅基为金属离子 4、根据蛋白质的功能分类 活性蛋白质∶ (1)生物催化剂—酶; (2)一些蛋白质具有激素功能,如:胰岛素; (3)运动蛋白质,如:肌球蛋白和肌动蛋白; (4)贮藏蛋白质,如:卵清蛋白、酪蛋白; (5)运输蛋白质,如:血红蛋白; (6)免疫蛋白质,又称为抗体; (7)起接受和传递信息作用,如:受体蛋白; (8)起代谢调控作用蛋白质,如:阻遏蛋白; 非活性蛋白质∶ 是一类结构蛋白质,行使形态学功能,作为有机体的结构成分,多起保护和支撑作用,如胶原 蛋白和角蛋白。 四、蛋白质的分布和生物学意义 蛋白质、核酸是生命的主要基础,怎样证实? 从分布看:蛋白质存在于一切生物体中……。 从功能看:表现在形态学、生理活性、营养三方面……。 第二节 氨基酸(Amino acid,简写AA) 一、蛋白质的水解 蛋白质可以被酸、碱和蛋白酶水解,在水解过程中逐渐降解成分子量越来越小的肽段,直到最后成为氨基酸的混合物。 水解过程:蛋白质→多肽→寡肽→二肽→氨基酸 根据蛋白质的水解程度可分为∶完全水解 部分水解 三种水解方法的优缺点比较∶ 1、酸水解∶6mol/L盐酸或 4mol/L硫酸煮沸水解20小时左右,可实现完全水解。 优点∶不引起消旋作用,得到的是L-氨基酸。 缺点∶色氨酸完全被酸破坏,羟基氨基酸和酰胺被部分破坏。 2 、碱水解∶5mol/LNaOH共煮10-20小时,即可完全水解。 缺点:在水解过程中,绝大多数氨基酸有不同程度的破坏,并且产生消旋作用,得到的是L-AA 与D-AA的混合物。 优点:在碱性条件下色氨酸保持稳定,可作为酸水解的补充。 3、酶水解∶在蛋白酶催化下水解。 优点:不产生消旋作用,也不破坏氨基酸。 缺点:在一种酶催化下往往水解不彻底,需要几种酶的协同作用才能使蛋白质完全水解,并且酶水解所需时间较长。 工业上常用来生产蛋白质不完全水解产物,如:微生物培养基等。 常用的蛋白酶有: 动物蛋白酶 植物蛋白酶 微生物蛋白酶 二、氨基酸的结构与分类 蛋白质氨基酸 常见氨基酸(20种) 天然氨基酸 不常见氨基酸 非蛋白质氨基酸 1、常见氨基酸(基本氨基酸)的结构通式 AA的结构特点∶除Pro都是α-AA; 除Gly都具有光学活性(有D-型和L-型两种光学异构体)。 氨基酸的构型是以甘油醛或乳酸作为基准相比较而确定的: L-甘油醛 L-乳酸 L-氨基酸 D-甘油醛 D-乳酸 D-氨基酸 蛋白质分子中出现的氨基酸都是L-型的(Gly除外)。 2、常见氨基酸的分类及结构 20种常见氨基酸有各自的中英文名称,中文缩写,英文三字母缩写符号和单字母缩写符号。 有三种主要分类方法 (1)根据R基团的酸碱性 中性氨基酸:Gly、Ala、Ser、Thr、Cys、Met、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Pro、Trp、Gln、Asn 碱性氨基酸:Lys、Arg、His 酸性氨基酸:Asp、Glu (2)根据R基团的结构 脂肪族氨基酸: Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Cys、Met、Gln、Asn 、Asp、 Glu、Lys、Arg 芳香族氨基酸:Phe 、Tyr 杂环族氨基酸: Pro、Trp、 His (3)根据R基团的电性质 非极性氨基酸:Ala、Val、Leu、Ile、 Phe、Trp、Met、Pro 不带电荷的极性氨基酸:Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln 带电荷氨基酸 带正电荷:Lys、Arg、His 带负电荷:Asp、Glu 必需氨基酸的概念 在20种常见氨基酸中有8种氨基酸在人体内不能通过其它物质合成,必须从食物中获取,称 为必需氨基酸,它们是: Thr、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Lys、Met 3、不常见氨基酸和非蛋白氨基酸 20种由遗传密码编码,参与蛋白质组成的为基本氨基酸(常见氨基酸),蛋白质合成中一些常见氨基酸被修饰衍生形成不常见氨基酸。 已发现的氨基酸中大多数不参加蛋白质分子组成,称为非蛋白氨基酸。 它们主要参与: 细胞的结构物质 活性物质的分子组成 代谢中间产物 三、氨基酸的理化性质 (一)物理性质 1.     晶形和熔点 α-AA均为无色晶体,不同AA晶形不同 AA熔点较高,明显高于一般有机物。 如:Gly 240℃ 乙酸16.5℃ 乙胺-80℃ 2.     溶解性 AA都能溶于酸性或碱性溶液中,少数能溶于有机溶剂。溶于水的能力与R基团的极性有关 3.旋光性 20种AA中,除Gly外,皆具旋光性 有公式: [α]Dt =α/C×L 或 C = α/ [α]Dt×L 当溶剂、温度、pH一定,[α]Dt值是常数。 4.紫外吸收性 Tyr、Trp、Phe在近紫外区有吸收高峰: Tyr:λmax=275nm, ε275=1.4×103 Trp:λmax=280nm, ε280=5.6×103 Phe:λmax=259nm, ε259=2.0×102 使蛋白质在280nm处有紫外吸收高峰,且吸光度与其浓度成正比。可作为定量分析的依据。 (二) 化学性质 1、氨基酸的酸碱性质 人们原先认为,氨基酸以不解离的中性分子形式存在。后来发现氨基酸熔点很高,一般在200º 以上,远远高于一般的有机物;并且氨基酸能使水的介电常数增加,而一般有机物会使水的介 电常数下降。说明了氨基酸以兼性离子(两性离子)形存在。 (1)氨基酸的两性解离 维持氨基酸晶体的作用力是静电引力(离子键),形成离子晶体;而一般有机物以范德华力构 成分子晶体,所以氨基酸的熔点比一般有机物高得多。兼性离子(偶极离子)形式的氨基酸是 强极性的,所以增加介电常数。 (2)等电点的概念 溶液在一定的pH时,AA的氨基和羧基的解离度完全相同,此时,AA分子所带的正、负电荷相等,主要以兼性离子形式存在,即AA分子的净电荷为零,它在电场中既不向阳极移动,也不向阴极移动,此时,AA溶液所处的pH就称为该AA的等电点(用pI表示)。 AA在溶液中的带电状态与溶液pH的关系∶ 当pH=pI时,净电荷为0; 当pHpI时,AA带负电。 当溶液pH偏离pI越远,AA所带的净电荷数目越多。 K1 = ([A+-][H+])/[A+] p K1 = -log K1 K2 =([A-][H+])/[A+-] p K2 = -log K2 K1 K2=([H+] 2 [A-])/ [A+] 在等电点时[ A+] = [ A-] K1 K2= [H+] 2 等式两边取负对数得: -log[ H+]2 = -log (K1'·K2') 整理后得: pI=(pK1 + pK2)/2 已知甘氨酸的p K1' = 2.34,p K2' = 9.60,则甘氨酸的等电点 : pI = (2.34 + 9.60)/2= 5.97 再如谷氨酰胺的p K1' = 2.17,p K2‘ = 9.13,则谷氨酰胺的等电点 : pI =(2.17 + 9.13)/2= 5.65 已知天冬氨酸p K1'=2.09,p KR'=3.86,p K2'=9.82 pI = (p K1' + p KR')/2 = (2.09 + 3.86)/2= 2.98 已知赖氨酸p K1'=2.18,p K2' =8.95, p KR'=10.53 pI = (p K2' + p KR')/2 = (8.95 + 10.53)/2= 9.74 对于一氨基一羧基的AA(中性AA): pI=(pK1 + pK2)/2 对于一氨基二羧基的AA(酸性AA): pI=(pK1 + pKR)/2 对于二氨基一羧基的AA(碱性AA): pI=(pKR + pK2 )/2 氨基酸的滴定曲线∶ (1)反映在不同的pH条件下,AA的带电状态、两性解离及等电点。 (2) 给出氨基和羧基的解离常数∶ pH=pK + lg[质子受体]/[质子供体] pH=pK1时,[A+] =[A±]; pH=pI时,[A+] = [A-],净电荷为0; pH=pK2时,[A±]=[A-]。 2、 氨基酸的重要化学反应 (1) α-氨基的反应 1 与亚硝酸反应 是范氏(Van Slyke)定氮法测定氨基酸含量的原理。Pro是亚氨基酸,无此反应。Lys、Arg的侧链基团也能与亚硝酸反应,但速度慢,不会产生干扰。 2 与甲醛反应 此反应进行完全时pH在12-13,无合适的指示剂指示反应终点。故不能直接用NaOH滴定未知浓度的氨基酸。 由于甲醛的存在,氨基酸在pH9左右可完全解离,释放出的H+可以用NaOH直接滴定,酚酞指示剂可以指示滴定终点。 甲醛滴定法也是常用的测定氨基酸含量的方法。 (2)α-羧基的反应 脱羧脱羧酶专一性很强,可用于测定特定氨基酸的含量。 成盐 (3)氨基与羧基共同参与的反应 ① 成肽反应 如:Gly与Ala反应生成以下两种二肽 ②与茚三酮反应 该反应非常灵敏,常被用来定性定量测定氨基酸。Pro与茚三酮反应并不释放NH3,而是直接生成黄色化合物。 总结常用的测定氨基酸含量的方法: 范氏定氮法 甲醛滴定法 茚三酮法 脱羧酶法 等等。 四、氨基酸的分离制备和分析鉴定 目前分离分析常用方法——层析法 层析技术三个条件: ⑴.水不溶性惰性支持物; ⑵.流动相(溶剂系统) ⑶.固定相(附着在支持物上的水或离子) 具体技术有: 吸附层析、离子交换层析、分配层析和分子筛过滤层析等 (一)纸层析 属于典型的分配层析,以滤纸作为支持物,固定相是吸附在滤纸上的水,流动相是进行展层所 用的有机溶剂。不同的氨基酸分子由于侧链基团不同,它们在固定相和流动相中的溶解度是不 同的。当在一定温度和溶剂系统中达到溶解平衡后,氨基酸在流动相和固定相中的浓度比为常 数,称为分配系数Kd。 带有非极性侧链的氨基酸如Leu、Ile、Phe、Trp、Val、Met、Pro等在流动相中的溶解度大,分 配系数Kd大,迁移速度快;而带有极性侧链的氨基酸如Glu、Asp、Lys、Arg、His、Ser、Thr 等在流动相中的溶解度小,分配系数Kd小,迁移速度慢。由此不同氨基酸因Kd值不同得以分离。 (二)离子交换层析 离子交换剂构成: 基质 + 可解离的活性功能基团 基质(不溶性高分子惰性支持物) 离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖凝胶 活性功能基团 酸性解离基团(带负电荷)——阳离子交换剂 碱性解离基团(带正电荷)——阴离子交换剂 离子交换树脂分离氨基酸主要基于 ⑴. 氨基酸的带电情况 (与树脂电离基团静电作用) ⑵. 氨基酸的R基团非极性大小 (与树脂非极性苯环的疏水作用) 使用磺酸型阳离子交换树脂,将氨基酸混合物溶液调至pH3左右 ,此时正电荷数碱性氨基酸 (A2+)> 中性氨基酸(A+)> 酸性氨基酸(A0),即碱性氨基酸与离子交换树脂结合最牢固, 中性氨基酸次之,酸性氨基酸无法结合在离子交换树脂上。洗脱顺序: 酸性AA→中性AA →碱性AA。 同为中性氨基酸时,根据疏水相互作用,洗脱顺序: 极性AA →脂肪族AA →芳香族AA 例:pH3.0的柠檬酸缓冲液中有Lys、Asp、Leu、Thr四种氨基酸,用732阳离子交换柱进行分离,用pH由低到高的梯度缓冲液进行洗脱,洗脱顺序: Asp → Thr → Leu → Lys 使用阴离子交换剂时洗脱顺序: 碱性AA→中性AA →酸性AA 第三节 蛋白质的一级结构与功能 一、蛋白质分子的基本化学结构 ---- 一级结构 一级结构又叫初级结构、基本化学结构或共价结构(Primary structure ),现规定(IUPAC):一级结构即指肽链中氨基酸的排列顺序。 二、多肽链 现在公认蛋白质分子中AA连接的基本方式是肽键。 ———蛋白质肽链学说 有关肽键和肽链的名词概念(主链、侧链、氨端、羧端、氨基酸残基、肽单元等) 五肽: 命名为丙氨酰谷氨酰亮氨酰缬氨酰组氨酸,简写为Ala-Glu-Leu-Val-His 用以形成多肽链的肽键在结构上较为特殊,虽然人们习惯于将它写成单键形式,但由于存在着共振作用,肽键可以在单键和双键之间转化,这种共振使得肽键具有部分(约40%)双键性质。 肽键具有部分双键的性质,原子和原子团不能象单键那样通过绕轴旋转产生不同构象。图中所示的六个原子近乎是在同一个平面上的,这种刚性平面称为酰胺平面或肽平面,并且呈反式构型。 除了肽键,两个Cys之间形成的二硫键也是组成蛋白质一级结构的重要化学键。它的存在可以将 两条或多条多肽链连接到一起(链间二硫键),也可以将一条肽链的不同部位之间连接起来(链 内二硫键)。 三、一级结构与功能的关系 蛋白质的一级结构对于蛋白质分子的生物功能至关重要,是一级结构决定了高级结构,一级结 构决定了功能。根据在蛋白质的一级结构中的地位和作用,氨基酸分为可变氨基酸和保守氨基 酸。 例:镰刀状细胞贫血病是一种分子病: HbA N-末端 Val-His-Leu-Thr-Pro- Glu -Glu-Lys…… C-末端 HbS N-末端 Val-His-Leu-Thr-Pro- Val -Glu-Lys…… C-末端 β链 1 2 3 4 5 6 7 8 四、蛋白质一级结构测定 一级结构确定的原则: 1.测Pr中AA的组成 2.N-末端和C-末端的确定 3.应用两种以上水解方法将Pr水解,得大小不同肽段 4.分纯各肽段,测定它们的顺序 5.推断整个顺序 6.确定二硫键的位置 第四节 蛋白质分子的空间结构与功能 一.构型(configuration)与构象(conformation) 构型—指在立体异构体中取代原子或基团在空间的取向。 构象—指立体结构中的取代基团当单键旋转时,可能形成的不同的立体结构。 二、维系蛋白质空间结构的化学键 (1) 氢键 维持二级结构的主要作用力 本质上是一种静电引力 : x — H … y 其中x 、y都是电负性强的原子,如F、O、N、S等,“—”表示共价键,“…”表示氢键, x — H 在氢键形成中作为供氢体,而y作为受氢体。蛋白质肽链中有很多可以形成氢键的基团。 (2)疏水相互作用 也称为疏水键,是指非极性基团出于避开水的需要而聚集到一起的作用力。 20种常见氨基酸中 有八种属于疏水性氨基酸,即Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Met、Pro,往往分布在球状蛋白 质的内部,它们的侧链之间形成的疏水相互作用对于维系蛋白质三级和四级结构具有特别重要 的作用。 (3)范德华力 实质也是静电引力,有三种表现形式: A)极性基团之间的定向效应; B)极性基团与非极性基团之间的诱导效应; C)非极性基团之间的分散效应 。 范德华力虽然很弱,但由于分布极为广泛,数量巨大且具有加和性,所以成为维持蛋白质三级 和四级结构的一种不可忽视的作用力。 (4)离子键(盐键) 是由正负离子之间的静电引力所形成的化学键。在生理pH条件下,酸性氨基酸(Asp和Glu)侧链 带负电荷,而碱性氨基酸(Lys、Arg和His)侧链带正电荷,它们之间可形成离子键。盐键的强弱 受环境pH、溶剂种类、盐浓度等的影响较大。 (5)配位键(金属键) 是一种特殊的共价键,在成键时两个原子并非各自提供一个共用电子,而是由某个原子单方面 提供共用电子对所形成。有的结合蛋白质分子内含有金属离子,它们对稳定蛋白质空间构象或 生物活性是必需的,这些金属离子往往以配位键与蛋白质连接。 (6)二硫键 二硫键在两个Cys-SH之间形成,属于共价键,它的存在可以将不同的多肽链或者同一条多肽 链的不同部位连接到一起,对蛋白质的空间构象起稳定作用。 三、蛋白质的二级结构 1.二级结构(Secondary structure )的涵义:指蛋白质共价主链在空间的卷曲方式 2.酰胺平面和二面角 主链肽键C-N具40%双键性质,肽单位的六个原子都被酰胺键固定在同一平面——酰胺平面(肽平 面)。受到原子和原子团之间空间位阻的影响,二面角Φ和Ψ的取值只能在有限的范围内。 3、二级结构的基本构象 (1)α-螺旋结构 (见P65 图2-14) 特点∶ 主链绕中心轴按右手螺旋方向盘旋,每 3.6 个氨基酸残基前进一圈,每圈前进距离(螺距)0.54nm,每个氨基酸残基占0.15nm。 α-螺旋的稳定性由氢键维持。每个氨基酸残基的亚氨基与它前面第四个氨基酸残基的羰基氧原子形成氢键,氢键与螺旋轴近似平行。 氢键的形成将肽链局部封闭成环状,环内共包含13个碳原子。 α-螺旋的结构常用SN来表示,S表示每圈螺旋包含的氨基酸残基数目,N表示氢键封闭环包含原子数。上述典型的α-螺旋表示为3.613 。 (2)β-折叠结构 (见P66 图2-15) 又称β-折叠片、 β-构象 β-折叠结构是两条或两条以上充分伸展成锯齿状折叠构象的多肽链,侧向聚集,按肽键的长轴 方向平行并列,形成折扇状的结构。β-折叠构象靠相邻肽链主链亚氨基和羰基氧原子之间形成 有规则的氢键来维系。 (3)β-转角 (见p66图2-16) 又称U形回折、β-转弯或发夹结构。 蛋白质分子的主链在盘曲折叠运行中,往往发生180度的急转弯,这种回折部位的构象,即所谓 的β-转角。β-转角是由4个连续的氨基酸残基组成的,第一个氨基酸残基的羰基氧原子与第四 个氨基酸残基的亚氨基连接来稳定构象。Gly 、Asp、 Asn和Trp常常出现在β-转角中。 (4)无规卷曲 是多肽主链不规则、多向性地随机盘曲所形成的构象。无规卷曲是球蛋白分子中常见的一种主 链构象。 以上是蛋白质的二级结构的主要构象,它们在不同的蛋白质分子中的分布差别很大。球状蛋白 质往往同时有一种以上的二级结构。纤维状蛋白质的结构往往是单一的二级结构,通过层层组 合构成特定结构,见图。 4、蛋白质的超二级结构 二级结构的基本结构单位(α-螺旋、β-折叠等)相互聚集,形成有规则的二级结构的聚集体。 已知的超二级结构有3种基本组合形式∶ α-螺旋的聚集体(αα) α-螺旋与β-折叠的聚集体(βαβ) β-折叠的聚集体(βββ) 5、蛋白质的结构域 在较大的球状蛋白质的分子中,多肽链往往形成几个紧密的球状构象,彼此分开,以松散的肽链相连,此球状构象就是结构域。 结构域又称为辖区,是蛋白质某些区域相邻的氨基酸残基形成二级结构和超二级结构后进一步组合成的作为形成三级结构的实体。 超二级结构在组织层次上高于二级结构; 结构域的组织层次介于超二级和三级之间。 结构域这一结构层次的出现的意义: 1)从结构形成的角度 ,在动力学上更为合理 ; 2)从功能的角度,赋予整个蛋白质分子一定的柔性 ,有利于蛋白质行使生物活性。 四、球状蛋白质的三级结构 1、三级结构(Tertiary structure)涵义 指一条肽链中所有原子的构象,即主链基本结构单元间的配置 是球状蛋白质在一级结构和二级结构的基础上,再进行三维多向性盘曲形成近似球状的构象。 如 ⑴ 肌红蛋白 153个AA残基,空间尺寸43×35×23A,α-螺旋占77%,其余都是β-转角和无规卷曲 ⑵ 溶菌酶 129个AA残基,空间尺寸45×30×30A,α-螺旋占25%,有β-转角、反平行β-折叠及 无规卷曲 2、三级结构构象特点 肽链在二级结构基础上进一步卷曲折叠成特定球状构象。 ⑴.大部分亲水R在表面—组成亲水区; ⑵.大部分疏水R在内部—组成疏水区; ⑶.三级结构稳定性主要靠次级键维持,疏水相互作用起着主要作用; ⑷.分子表面往往有袋型空穴或裂隙,通常是活性部位。 五、球状蛋白质分子的四级结构 1、四级结构(Quaternary structure)的涵义 由几个或数十个以上亚基(subunit)相互缔合而形成的。 研究内容包括: 亚基的种类和数目,亚基之间的排布 亚基---指一个或几个肽链在一、二、三级结构基础上形成的蛋白质亚单位。 2. 寡聚蛋白质分子的亚基组成 均一 :由同一种亚基组成 非均一:由两种以上亚基组成 变构效应 与肌红蛋白相比,血红蛋白最突出的是它的变构效应。 变构效应又称别构效应,是指蛋白质与配基结合后构象发生改变,进而使生物活性发生改变的 现象。能发生变构效应的蛋白质称为变构蛋白,所有变构蛋白都是寡聚蛋白,四级结构是发生 变构效应的结构基础。 同位(种)效应 正协同效应 变构效应 负协同效应 异位(种)效应 正效应(激活) 负效应(抑制) 同位效应是指当某种配基与变构蛋白结合后,能改变该配基与蛋白质的亲合力,从而影响到该 蛋白其它亚基与这种配基的结合。异位效应是指当某种配基与变构蛋白结合后,能改变另一种 配基与蛋白质的亲合力,从而影响到该蛋白与另一种配基的结合。 血红蛋白是具有正协同效应的蛋白质,Hb与Mb的氧合曲线如下: 对氧的亲和力Mb大于Hb,而运输氧气的能力Hb大于Mb。 第五节 蛋白质的重要理化性质 一、蛋白质的胶体性质 蛋白质分子的相对分子量在1-100万范围内,其颗粒大小在1-100nm之间,属于胶体粒子的范围。 另外,蛋白质分子表面有许多极性基团,亲水性极强,易溶于水形成稳定的亲水胶体溶液。 1、稳定蛋白质胶体溶液的两个因素 蛋白质以稳定的胶体溶液存在需满足以下两个条件: (1) 带同种表面电荷(在非等电点时),形成双电层结构; (2) 形成水化膜。 蛋白质胶体溶液具有一般胶体溶液所共有的性质,包括∶ 丁道尔现象、布朗运动、半透膜不 透性、吸附性、胶凝性、粘性,等等。其中的一些性质被人们所利用,例如半透膜不透性被广 泛应用于蛋白质的分离纯化和浓缩。 2、蛋白质的膜分离技术(图) 利用蛋白质的半透膜不透性,将蛋白质中所含的、可以通过半透膜的低分子物质(如盐等小分子)分离的技术称为膜分离技术(或膜过滤技术)。适用于蛋白质的膜分离技术∶透析 超滤 二、蛋白质的两性解离与等电点 蛋白质分子中的氨基酸残基侧链有很多可 解离的基团: 酸性基团∶ Glu的γ-COOH Asp的β-COOH Tyr的酚羟基 Cys的-SH 碱性基团∶ Lys的ε-NH2 His的咪唑基 Arg的δ-胍基 蛋白质分子的总解离可用下式表示∶ 蛋白质的等电点∶蛋白质溶液在特定的pH下,其分子所带的正、负电荷相等,净电荷为零,这 一pH称为蛋白质的等电点(用 pI 表示)。多数蛋白质的等电点在中性或略偏酸性的范围内,少 数蛋白质等电点大于7。 蛋白质的等电点不是一个恒定值,它受溶液的离子种类和离子强度的影响。 蛋白质在纯水中的带电状态不受其它离子的干扰,完全由H+的解离和结合来决定,这种条件下 的等电点称为蛋白质的等离子点。(用 Ip 表示)蛋白质的等离子点是蛋白质的特征性常数。 蛋白质 pI 与其氨基酸组成有关 对于变性的蛋白质,可由其酸性氨基酸与碱性氨基酸的比例与数量来判断。 对于天然蛋白质,由于其R基团不能完全暴露在外, pI 与蛋白质分子表面的酸性氨基酸、碱性 氨基酸有关。 Pr分子在等电点时溶解度最小,利用这一性质可粗略测定Pr等电点。 根据蛋白质两性解离和等电点的性质发展起来的蛋白质纯化方法有: 等电点沉淀法 蛋白质电泳 离子交换法 等等 三、蛋白质的变性作用 1、概念 天然蛋白质在受到某些物理或化学因素的作用时,有序的空间结构被破坏,致使生物活性丧失, 并伴随发生一些理化性质的异常变化,但一级结构并未破坏,这种现象称为蛋白质的变性作用。 本质:次级键被破坏,肽键完整。 2、蛋白质变性的可逆性 可逆变性∶ 是指使蛋白质变性的条件解除后,能恢复其原有性质。 不可逆变性∶ 是指使蛋白质变性的条件解除后, 仍不能恢复其原有性质。 3、蛋白质的变性因素及其作用机理 物理因素∶热、UV、超声波、X-射线、高压、表面张力、搅拌、剧烈振荡、研磨。 化学因素∶酸、碱、有机溶剂、重金属盐、脲、胍、表面活性剂、生物碱 。 作用机理 (详见P76) 4、变性蛋白质的性质 变性蛋白质与天然蛋白质性质的差别: (1) 理化性质的变化。如旋光性改变、粘度增加、光吸收性质增加、失去结晶能力、溶解度下降、易发生凝聚和沉淀。 (2) 生化性质的变化。变性后的蛋白质易被酶水解。 (3) 生物活性丧失。这是蛋白质变性的重要标志。 四、蛋白质的沉淀作用 (一)概念 蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的、相对的,若改变环境条件,破坏其水化膜或表面电荷, 蛋白质亲水胶体便失去稳定性,发生絮凝沉淀的现象,就称为蛋白质的沉淀作用。 蛋白质的沉淀可分为 非变性沉淀:用于分离活性的天然蛋白质产品,如 酶、抗体等。 变性沉淀:用于生物制品中除去蛋白质。 *注意沉淀和变性的联系与区别。 (二)沉淀方法 1、等电点沉淀法 用酸或碱调节pH达某蛋白质等电点,使此蛋白质分子净电荷为零,分子间斥力消失,如果此蛋 白质水化膜薄,就能沉淀。 优点:不会导致Pr变性。 缺点:往往沉淀不完全。 2、盐析法 在蛋白质溶液中加入大量中性盐达一定浓度,蛋白质就会沉淀。原理 : ①大量盐加入后,能与蛋白质争夺水分子,去除水膜; 2 大量盐能中和蛋白质分子表面电荷, 使蛋白质沉淀。 盐析效果: 二价离子>一价离子;离子半径小>离子半径大 分级盐析(分段盐析) 因为使不同蛋白质沉淀所需盐析浓度不一样,可通过分段加不同浓度中性盐,把不同蛋白质分别沉淀析出,从而达分离提纯目的。 *蛋白质既有盐析现象也有盐溶现象,其溶解度和盐浓度的关系如下图 优点:不会导致Pr变性 缺点:会引入大量离子杂质 3、有机溶剂沉淀法 在蛋白质溶液中加入一定量有机溶剂,会使蛋白质发生沉淀。使不同蛋白质发生沉淀所需的有 机溶剂浓度也是不同的,由此可用有机溶剂分级沉淀来分离蛋白质。应注意有机溶剂是使蛋白 质变性的因素之一,故操作应注意低温、搅拌、快速分离。 原理 : ① 因有机溶剂本身介电常数很低(水79、乙醇26、丙酮21),加后可降低蛋白质溶液的介电常数,增强了蛋白质分子之间的静电引力; ② 有机溶剂亲水,争夺水分子,使蛋白质水膜破坏而易凝聚沉淀。 介电常数*—表示介质影响相反电荷间吸力的数值,高则影响大,低则影响小。 优点:有机溶剂易挥发,不会引入杂质 缺点:易引起Pr变性 4、重金属盐沉淀法 蛋白质在碱性溶液中带负电,可与重金属离子如Zn2+、Cu2+、Hg2+、Pb2+、Fe3+等作用,产生重金属 蛋白盐沉淀。 5、热凝固沉淀法(略) 这两种方法都导致Pr变性。 6、生物碱试剂沉淀法 生物碱试剂是能与生物碱发生沉淀反应的试剂,如单宁酸、钼酸、钨酸、三氯醋酸等,具有酸性,而蛋白质在酸性溶液中带正电荷,故能与带负电的酸根相结合,成为溶解度很小的盐类。 该法会导致Pr变性。 五、蛋白质的颜色反应 1、双缩脲反应 2、福林-酚(Folin-酚)反应 3、米伦反应 4、黄蛋白反应 等等 双缩脲反应 两分子双缩脲在碱性条件下与碱性CuSO4作用,生成粉红色的复合物,这种反应称为双缩脲反 应。而肽链的结构与双缩脲分子结构上都具有酰胺键,因此肽和蛋白质也具有双缩脲反应,与 碱性CuSO4作用,随肽链的伸长,显示颜色由粉红色到紫红色、蓝紫色。 *注意:二肽无此反应。 福林-酚(Folin-酚)反应 Tyr的酚羟基具有还原性,在碱性条件下,可使Folin-酚试剂(主要成分为磷钼酸和磷钨酸)还 原生成蓝色化合物(钼兰和钨兰)。蛋白质分子中含有酪氨酸,因此也具有Folin-酚反应,与 Folin-酚试剂同样显蓝色。 六、蛋白质的紫外吸收性质 一般蛋白质在280nm波长具有最大吸收,这是由于蛋白质分子中的Trp、Tyr和Phe存在共轭双键 的缘故。利用这一性质可以对蛋白质进行定性定量测定。 蛋白质含量测定的几种方法: (1)紫外吸收法 (2)Bradford法(考马斯亮蓝染色法) (3)Lowry检测法(Folin-酚试剂) (4)双缩脲法 (5)凯氏定氮法 其中前4种都要利用分光光度计测定吸光度A,利用其值与蛋白质含量之间的线性关系测定。 第六节 蛋白质相对分子质量的测定 一、超离心沉降速度法 Pr胶体粒子在静止溶液中: 因重力F = m g很小,沉降需要很长时间 超离心法原理:增加离心力强度(6万转以上),不同分子量的Pr颗粒就会以不同的速度沉降下来。用特殊的光学系统可观察到沉降界面,从而得Pr沉降速度。 有斯维德贝格公式(Svedberg ): M = RTS / D(1-νρ) 其中S = dx / (dt•ω2 x) 为沉降系数,单位: 秒。其物理意义是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度。一般Pr的“S”在1~200×10-13 秒 范围内,为方便将10-13 秒 作一个单位——漂浮单位“s” 对于生物大分子,人们常用沉降系数S来表示其分子大小。 二、凝胶过滤法 原理:将具网状结构的交联葡聚糖凝胶装柱,对分子量不同的蛋白质,由于进入孔径程度不同而走不同的历程,从而有不同的洗脱体积。 A.小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留;大分子被排阻在凝胶颗粒外,在颗粒之 间迅速通过。B.(1)蛋白质混合物上柱;(2)开始洗脱,小分子进入凝胶颗粒内,大分子 被排阻在颗粒外;(3)小分子被滞留而移动慢,大分子移动快,大小不同的分子开始分开;(4) 大小不同的分子完全分开;(5)大分子已被洗脱,而小分子仍在层析柱内。 蛋白质的洗脱体积Ve与分子量的对数(logM)之间存在线性关系: 三、 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS——十二烷基硫酸钠 CH3(CH2)11OSO3Na 聚丙烯酰胺Gel——具网状结构 原理 样品中加入• 含-SH的还原剂,打开Pr分子二硫键 • SDS破坏Pr分子的氢键和疏水键,并与之形成Pr-SDS复合物 结果导致: 复合物带大量负电,不同Pr电荷密度相同(荷质比相同)。球状Pr变成雪茄状, 长轴∝MW。 电泳迁移率仅与MW(长轴)有关 四、 化学测定法 通过分析稀少氨基酸%或稀少元素%来测定。先求出M min = 原子量/ 百分含量, 则: M min × n = MW n 为Pr中含此稀少元素个数 例如: 1)细胞色素c中铁元素含量为0.43%,已知铁的原子量是55.8,则细胞色素c的最小分子量为:Mmin=55.8 / 0.43%=13000,又因为细胞色素c分子内只有一个铁原子,所以其最小分子量即为真实分子量。 2)血红蛋白含铁量为0.335%,则最小分子量为:Mmin=55.8 / 0.335%=16700,而血红蛋白由四个亚基组成,每个亚基都含有一个铁原子,所以共有四个铁原子,其分子量为16700×4=66800。 第七节 蛋白质的分离纯化 一、目标和一般程序 1、分离纯化的目标 Pr纯度或比活性的增加 2、一般程序 前处理 → 粗分级 → 细分级 (1)前处理 除去固形物,使目标蛋白处于溶液状态。 (2)粗分级 使用适当的方法对前处理得到的溶液进行分离提取。特点:简便、处理量大,既能除去大 量杂质,又能浓缩Pr,但分辨率低,得不到高纯度的Pr。常用方法:膜过滤、沉淀法等。 (3)细分级 在粗分级基础上进一步纯化。特点:分辨率高,能得到高纯度Pr,但规模较小,处理量少, 扩大生产难度大或成本高。常用方法:层析法、电泳法、超离心法等。 二、蛋白质分离纯化的依据和常用技术 蛋白质分离纯化的依据是理化性质或生物学性质的不同,主要包括:分子大小的差异;溶解度 差异;电荷差异;吸附性质差异;生物学亲合力的差异。 (一)根据分子大小不同分离蛋白质的方法 1、透析和超滤 2、凝胶过滤层析(分子筛层析) 3、密度梯度离心 (二)根据溶解度不同分离蛋白质的方法 1、盐析和分级盐析 2、有机溶剂分级法 例如在提取酵母蔗糖酶时,先往粗酶液中添加乙醇直至乙醇浓度达到32%,此时一部分杂蛋白 发生沉淀而蔗糖酶仍处于溶解状态,离心除去沉淀,往上清液中继续添加乙醇至终浓度为47.5%, 蔗糖酶被沉淀下来,离心后弃去上清液,所得沉淀即为经过粗分级的目的蛋白。 (三)根据电荷不同分离蛋白质的方法 1、电泳法 在外电场的作用下,带电颗粒将向电性相反的电极移动,这种现象称为电泳,利用这种现象对 不同分子进行分离的技术称为电泳技术。蛋白质分子在非等电点条件下将带上电荷,在电场作 用下根据所带电荷的种类、数量及分子大小和形状不同有着不同的迁移方向和速率,由此可得 到分离。 (1)凝胶电泳 盘状电泳(A)和平板电泳(B) (2)等电聚焦 这是一种特殊的电泳方法,常以蔗糖溶液或聚丙烯酰胺凝胶作为介质,并利用一些两性电解质 建立起一个从阳极到阴极逐渐增加的pH梯度,在进行电泳时蛋白质分子将依据等电点不同而得 到分离。 pH 3 4 5 6 7 8 9 阳极 + → 0 ← - 阴极 等电聚焦原理图 2、离子交换层析 是利用在某一特定pH下,不同Pr分子带电荷的种类和数量不同,与离子交换剂的结合能力就不 同,在层析过程中被洗脱的顺序不同而分离。根据离子交换剂所带电荷,分为: 阴离子交换剂,如:DEAE-纤维素 阳离子交换剂,如:CM-纤维素 例:有四种蛋白质组成混合物:胃蛋白酶(pI=1.0),胰岛素(pI=5.3),卵清蛋白(pI=4.6),细胞色素 c(pI=10.7),需要用DEAE-纤维素进行分离。若溶液初始pH为6.0,则此时细胞色素c带正电荷 (pHpI)而被 吸附在层析柱上。但是这三种蛋白质带负电荷数量不同:胃蛋白酶 > 卵清蛋白 > 胰岛素 所以洗脱顺序: 细胞色素c→胰岛素→卵清蛋白→胃蛋白酶 (四)根据吸附性质不同分离蛋白质的方法 一些被称为吸附剂的物质,具有将其它分子吸附而保留在其表面的能力,利用吸附剂对不同的 分子吸附力强弱的差异可以分离不同的物质,该方法称为吸附层析。如:羟基磷灰石层析 羟基磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2],又称为结晶磷酸钙,其中的钙离子带有正电荷,能够吸附蛋白质 分子中带负电荷的基团。不同蛋白质带净电荷数或电荷在分子表面的分布不同,与吸附剂结合 能力不同,由此可以分离。 (五)根据生物学特异性不同分离Pr的方法 亲和层析:利用蛋白质的生物学特异性不同而分离。生物学特异性是指一些生物分子之间存在 着专一性结合的能力,如酶和辅酶、底物、调节因子,激素和受体蛋白,抗原和抗体之间。 特点:分辨率极高,往往通过一步操作就能实现蛋白质的纯化,并且有着非常高的纯化倍数和 回收率。 层析介质由三部分组成: (1)配基 (2)不溶性支持物 (3)间隔臂 三、蛋白质纯度的鉴定 凝胶电泳法(最常用) 比活力法 层析法 超离心沉降法 免疫化学法 等等 PAGE 14
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