亮氨酸氨肽酶的种类及临床应用

亮氨酸氨肽酶的种类及临床应用 亮氨酸氨肽酶的种类及临床应用 国际检验医学杂志2010年12月第3l卷第l2期ImJLabMed,December201o.31,N — o. — 12 亮氨酸氨肽酶的种类及I临床应用 高应东综述,王书奎审校 (南京医科大学附属南京第一医院医学检验科,南京医科大学第三临床医学院 临床检验诊断学教研室,江苏南京210006) ? 综述? 【摘要】亮氨酸氨肽酶是一大类能水解以亮氨酸残基为氨基末端的蛋白质或多肽的酶类,在肝胆疾病及正常妊娠时,其血 清浓度升高;当肾小管刷状缘受损时尿液中排泄增加;另外它还可能参与血压调节,主要组织相容性复合物(MHC)抗原递呈等, 对亮氨酸氨肽酶及其抑制剂的深入研究对临床有实际应用价值. 【关键词】亮氨酰氨肽酶;胎盘;肝疾病;.肾病 D0I:10.3969/j.issn.1673—4130.2010.12.032 中图分类号:Q556.9;R575文献标识码:A文章编号:16734130(2010)12-140803 近年来,国内一些大中型医院相继开展了亮氨酸氨肽酶 (1eucineaminopeptidase,LAP)的测定,但是对于其生理生化特 性及I临床意义却不甚明了.在此特作一综述. 氨肽酶(aminopeptidase,AP)是一类蛋白水解酶,它可以 使氨基酸从多肽链的氨基末端(N端)由外向内按顺序逐个地 游离出来,故又称肽链外切酶(expeptidase),这些肽酶在细胞 的保护,生长发育和疾病防御中扮演着重要的角色r1].亮氨酸 氨肽酶(LAPs)是氨肽酶M1或者M17家族的成员,它不仅水 解以亮氨酸为N末端残基的多肽链,同样也可作用于N末端 的其他氨基酸,因其水解亮氨酸残基效率最高而得名,这些酶 具有不同的活性温度,最适pH条件以及必需的二价阳离子. M17肽酶家族中的亮氨酸氨肽酶 M17肽酶家族中的亮氨酸氨肽酶(EC3.4.11.1)主要包 括牛眼晶状体亮氨酸氨肽酶(bovinelensleucineaminopeptid— ase,blLAP),大肠杆菌肽酶A(E.colipeptidaseA,PepA),番 茄中性亮氨酸氨肽酶(tomatoneutralleucineaminopeptidase, LAp-N),番茄酸性亮氨酸氨肽酶(tomatoacidicleucineamin— opeptidase,LAP—A)等,其中以动物,植物及微生物中六聚体 LAP的研究最为深入.M17LAP单体(相对分子质量为53× 10.,55X10.)聚合形成同源六聚体酶,这些酶具有较高的活 性温度(60,7O?)和偏碱性的最适pH条件(pH8.5,9.5). 在哺乳动物中,M17LAPs和M1IAPs通过对多肽的降解促成 主要组织相容性复合物(majorhistocompabilitycomplex, 加压素, MHC)I型抗原递呈,促进处理生物活性肽(催产素,脑啡肽)以及囊泡转运到细胞膜.在微生物中,M17LAPs可以 水解蛋白质并且能够结合DNA,这一特性使得它成为控制嘧 啶,藻酸盐与霍乱毒素生物合成的转录抑制剂,并且介导质粒 和噬菌体特异性位点重组]. 动物M17LAPs在疾病防御中可能起重要作用.有作者 提出LAP在细胞氧化,还原中发挥作用].这个假说是基于 锰离子激活大鼠肝脏和牛LAPs水解甘氨酸半胱氨酸连接处 的事实.值得注意的是,苷肽可以被大肠杆菌和猪LAPs水 解,但不能被植物LAP水解.LAPs在控制苷肽的水平和细 胞氧化,还原上的作用还存在争议.另外,LAPs在白内障中 的作用已经被提出CaJ.LAP活性的逐渐下降与随后白内障的 发展有关,这是由于部分降解蛋白质的积累造成不透明蛋白的 聚集而导致.还有,哺乳动物LAPs在MHCI型抗原递呈中 发挥一定的作用l4].虽然LAP处理抗原肽的作用是显而易见 的,但是通过对LAP基因敲除小鼠的分析显示,在活生物体内 IAP活性对于抗原递呈并不足必需的. M1肽酶家族中的亮氨酸氨肽酶 M1肽酶包含一个肽酶M1区域(PfamO1433)和一个共享 的高度保守的锌结合基序HEXXHX18一E和外肽酶基序GA— MEN.哺乳动物M1肽酶家族中LAP主要包含4大类:膜结 合的丙氨酰氨肽酶(membrane-boundalanylaminopeptidase, mAAPs),人胎盘亮氨酸氨肽酶(placentalleucineam~nopeptid— ase,PIAP),嘌呤霉素敏感的氨肽酶(puromycin—sensitive aminopeptidase,PS-AP),嘌呤霉素不敏感的亮氨酰特异性氨 肽酶(puromycininsensitiveleucyl—specificaminopeptidase, PILAP),这些酶分别有一系列不同的名称反映了它们的生 物学功能,定位以及最初分离的差异. 1.膜结合的丙氨酰氨肽酶(mAAPs):AAP(EC3.4.11.2) 水解中性氨基酸,因水解N端丙氨酰基效能最高而得名. AAP最初从猪肾提纯出来,因其能水解亮氨酸残基,与肾微粒 体膜结构关系密切,故又称为微粒体亮氨酸氨肽酶.相对分子 质量为110×10.的mAAP糖基化后形成同型二聚体,mAAP是 一 种锌离子依赖性酶,在器官中广泛分布,最适pH为底物浓度 依赖性的.在pH7.0,7.5时mAAP的米氏常数(Michaelis constant,Kin)值最低.在大脑中,mAAP被认为可以水解脑啡 肽中的酪氨酸(Tyr)1-甘氨酸(Gly)2连接.mAAP可以切断半 胱氨酸一甘氨酸(Cys—Gly)连接并且可能参与了细胞外Cys—Gly 的分解代谢.虽然丙氨酸残基是mAAP首选水解底物,但是 它也能有效地水解亮氨酸及其他众多的氨基酸残基.由于交 叉的底物特异性及广泛的组织分布,mAAP容易与六聚体 M17家族的LAPs(EC3.4.11.1)相混淆. 2.人胎盘亮氨酸氨肽酶(P—IAP)P—LAP(EC3.4. 11.3)是相对分子质量为165×10.,糖基化的氨肽酶,其最适 pH值为7.5.P—LAP能切断催产素和加压素的半胱氨酸残 基,故又称催产素酶,但它能更有效地水解含亮氨酸,精氨酸和 赖氨酸残基的底物.在胎盘中,P—LAP与膜结合并局限于运 输囊泡内.血管内皮细胞通过将含P-LAP囊泡转运到细胞膜 来对催产素作出反应.膜结合的PIAP可以被解整合素样金 属蛋白酶(adisintegrinandmetalloprotease,ADAM)水解,释 放出可溶性的,血清形式的P—IAP.通过分解催产素和加压 素,P—LAP调节妊娠时血清中催产素和加压素的浓度以防止 过早子宫收缩和早产. 国际检验医学杂志2010年12月第31卷第12期 IntJLabMed,December2010,Vo1.31,No.12 P—LAP同源于胰岛素调节的氨肽酶(insulin-responsive aminopeptidase,IRAP)并最先在大鼠中确定[1].在脂肪细胞 中,为了响应胰岛素的刺激,P—LAP(IRAP)从囊泡易位到细胞 膜.PLAP(IRAP)的胞浆N端区域结合P?5(一种介导运输 囊泡融合的蛋白质),与胰岛素刺激产生的葡萄糖转运异构体 4(glucosetransporterisoform4,GLUT4)共同易位到细胞膜. GIUT4在胰岛素刺激的葡萄糖摄取中起了极其重要的作用. 3.嘌呤霉素敏感的氨肽酶(Ps_AP)PS—AP(EC3.4. 11.14)拥有很多名称,它是一种不寻常的酶,因为它的激活需 要钙离子和硫醇化合物.PS—AP的生理学作用现在还不甚明 了.PS-AP被认为在处理大脑脑啡肽Tyrl—Gly2的连接起了 一 定的作用.但是其广泛的组织分布和广泛的底物特异性(其 水解丙氨酸,亮氨酸,精氨酸,苯丙氨酸,酪氨酸及蛋氨酸残基 的效率几乎相同),PAP可能参与细胞维持所需的正常的蛋 白质水解活动.PAP在MHCI型抗原递呈处理上也发挥 了一定的作用…. 4.嘌呤霉素不敏感的亮氨酰特异性氨肽酶(PILS-AP) PILS-AP(EC3.4.11.x),也称脂肪细胞衍生型亮氨酸氨肽 酶(adipocytederivedleucineaminopeptidase,A—LAP).它是 一 种多功能酶,在抗原调节,炎症反应调节以及MHCI类分 子的抗原递呈中发挥重要作用.这个锌离子依赖性的肽酶最 适pH条件为7.5,8.0,这一条件依赖于不同底物.不同于 P—LAP(IRAP)的广泛底物特异性,PILS-AP首先切断N端含 有亮氨酸残基的底物,其次是蛋氨酸,胱氨酸和苯丙氨酸.在 生物体内,PILS-AP切断大量的生物活性肽,包括血管紧张 素,赖氨酰舒缓激肽(胰激肽),强啡肽A,神经激肽A和神经 介素B等.由于其多功能性而具有不同的名称,也被称为1型 肿瘤坏死因子受体脱落氨肽酶调控因子(aminopeptidaseregu latorofTNFR1shedding,ARTS-1),内质网相关的抗原递呈 (endoplasmicreticulum—associatedwithantigenpresentation, ERAAP),内质网氨肽酶一1(ER—aminopeptidase一1,ERAP1) 等. 亮氨酸氨肽酶的临床应用 1.LAP在肝病中的应用LAP广泛分布在人体内,以 肾,小肠,肝,胰及子宫肌层内含量最多,胆汁中也有分布. LAP分布于肝细胞微粒体,有膜结合特性,在肝细胞损害严重 时释放出来.又因其在胆管,胆小管活性最强,故对肝组织的 严重损伤及胆汁的淤积程度反映更为准确,可靠.LAP在各 型肝炎患者均有不同程度的升高,依次为重症肝炎,急性肝炎, 酒精性肝炎,慢性活动性肝炎,肝硬化,慢性迁延性肝炎.酒精 性肝炎患者血清LAP与谷氨酰转移酶(7一glutamyltransferase ,GGT)呈显着正相关,二者对酒精性肝炎的诊断具有重要参 考价值].大多数肝胆疾病时LAP与碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)呈平行改变,两者的阳性率和敏感度相似. 转移性肝癌时LAP稍敏感[7],胰腺癌肝转移引起胆汁淤积时 升高最显着.IAP总活性对肝癌的诊断及鉴别诊断无实际临 床价值,LAP最初曾作为胰头癌的血清诊断指标,也有作者认 为是系统性红斑狼疮活动性指标,它与血管内皮细胞生长因子 密切相关,可作为肿瘤及血管生长的标志物. 2.LAP在肾病中的应用肾脏疾病早期常缺乏明显, 特异的症状和体征,因此实验室检查在肾脏病的诊断,鉴别诊 断,疗效观察及预后评估中显得尤为重要..肾小管上皮细胞刷 状缘在损害过程中常常最先受累,监测刷状缘酶活性的变化对 .肾损害的早期发现,诊断及疗效观察有重要的参考价值.肾脏 组织中的LAP主要存在于近端小管上皮细胞刷状缘,肾小球 含量较少.因LAP相对分子质量较大,其他组织中释放入血 液的IAP不能从正常肾小球滤过膜通过,因此尿LAP主要来 源于肾近端小管.任何原因引起的急性肾小管损害,如药物或 重金属中毒等.肾毒性物质引起的肾小管损伤,出血和休克等造 成的.肾小管缺血性损害,急性.肾盂肾炎,急性肾小管问质肾炎, 急性肾移植后排异反应等,尿LAP都会明显升高.各种肾小 球疾病,特别是存在大量蛋白尿时,由于血液中的LAP可从受 损的肾小球滤膜通过而进人尿液,尿IAP亦可有不同程度的 升高. 宗成国等通过测定尿亮氨酸与目前临床常用的早期肾 小管损伤指标N一乙酰氨基葡萄糖苷酶(N—acetyl—D-glu— cosaminidase,NAG)进行比较认为,尿NAG,LAP均能灵敏, 特异地反映糖尿病肾病的损伤情况,是临床监测糖尿病肾病的 可靠指标,对糖尿病肾病的早期诊断和治疗具有重要参考价 值.因尿LAP敏感性低于尿NAG,GGT,仅略高于ALP,而 且测定时对尿液标本要求(如pH值)较高,故目前临床并未广 泛开展对尿IAP的测定,杨胜茹等采用速率法测定尿中 IAP,对检测条件及干扰因素进行了实验摸索. 3.p-LAP的临床应用1)P—LAP与妊娠及自发性早 产:人P—IAP又称催产素酶,在妊娠期的前3个月,血清浓度 仍然保持很低,在第6,9个月逐渐升高,分娩后迅速下降.P— LAP是唯一能灭活催产素与加压素的酶,暗示P—LAP通过降 解这些激素,对维持正常妊娠起了重要作用.有报道,自发性 早产患者血清P—IAP浓度是下降的,对有自发性早产先兆的 孕妇进行P—LAP及II一6联合检测,能准确预测早产,P—LAP 水平下降可能是自发性早产的关键因素.2)P—LAP与血压 调节:先兆子痫伴有高血压,蛋白尿及水肿,先兆子痫患者P' LAP活性比正常人高,它随患者病情恶化而进行性下降,加压 素升高可引起P—LAP上升,可抵消加压素升高血压的活性. 当该酶活性下降时,先兆子痫患者血压上升ll.最近研究也 揭示了P—LAP在先兆子痫中的病理机制ll.也有作者报道, PIAP是血管紧张素IV(angiotoninIV,AngIV)受体,该酶可 能与血压的调节有关,使其未来可能成为对抗不同病症(如阿 尔茨海默病,癫痫病,缺血等)药物开发的目标"].3)P-LAP 与妇科肿瘤:P—LAP不仅存在于子宫内膜腺癌组织和细胞内, 而且它对癌细胞的生长起了调节作用.在子宫内膜癌预后不 良的晚期患者P—LAP有着很高的表达.使用紫杉醇与卡 铂治疗晚期或复发的子宫内膜癌有效,但是当患者肿瘤组织极 度表达P—IAP时,这种有效性明显降低.因为PLAP被认为 能降低药物的化学敏感性,它不仅是抗癌化疗的一个预示因子 或敏感性指数,而且控制其表达可以作为子宫内膜癌的一个治 疗目标.P—LAP抑制剂可促使抗癌药物的抗性降低,抑制其 表达可以提高抗癌药物的敏感性.PIAP也是卵巢上皮恶 性肿瘤的诊断标志物及分子治疗靶点,同时通过催产素和/或 加压素的误调节,它也可促进乳癌进展l】. 展望 LAP在肝脏,.肾脏疾病及妊娠时的诊断价值基本明确,血 清LAP目前已经作为肝功能的指标之一而应用于临床.但是 LAP在其他方面的作用(如血压调节,MHC抗原递呈等)还有 待于进一步的研究.PIAP不仅能成为一个新的诊断或预期 生化标志物,而且是一个潜在的妇科肿瘤治疗新的分子靶点, 国际检验医学杂志2010年l2月第31卷第l2期lntJLabMed,December2010,VI.31,No.12 对LAP抑制剂的研究,为l临床某些肿瘤的治疗提供了新的思 路.总之,LAP是一类对l临床有实际应用价值而又有待于进 一 步深入研究探讨的酶类. 参考文献 [1]MatsuiM,FowlerJH,WallingII.1.eucineaminopeptid一 [2] [3] [4] Es] [6] [7] E8] [9] ase$:diversityinstructureandfunction[J].BidChem, 2006,387(12):1535—15,I4. CappielloM,AherioV,AnlodeoP.eta1.Metalionsubsti tutioninthecatalyticsitegreatlyaffectsthebindingof sulfhydryl—containingcompoundstoleucylaminopeptidase [J].Biochemistry,2006,45(10):3226-3234. ChaerkadyR,SharmaKK.Characterizati0nofabradyki— nin—hydrolyzingproteasefromthebovinelensEJ].Invest OphthalmolVisSc,2004,45(4):12141223. KloetzelPM,OssendorpF.Proteasomeandpeptidase functioninMHC—class—Imediatedantigenpresentation [J].CurrOpinImmunol,2004,16(1):76-81. TsujimoM,GotoY,MaruyamaM,eta1.Biochemicaland enzymaticpropertiesoftheM1familyofaminopeptidases involvedintheregulationofbloodpressure[J].HeartFail Rev,2008,13(3):285—291. 朱一堂,孙艳,李福坤,等.血清亮氨酸氨基肽酶和符氨酰 转肽酶在酒精性肝病诊断中的应『{j[J7.国际柃验医学杂 志,2006,27(12):1146—1147. 陈旭东,张婷,王东林.肝肿瘤鉴别诊断中免疫纽化应用 的研究进展EJ].国际肿瘤学杂志,2007,34(11):848850. 宗成国,栾旭华,张卫军.等.NAG和IAP对糖尿病早 期肾损害的诊断价值[J].中团实验诊断学,2008,12(6): 739—740. 杨胜茹,王娟,樊宁,等.尿亮氨酸氯基肽酶测定及临床应 用[J].国际检验医学杂志,2009,30(6):610—6?. [1o]熊瑛,杨祖菁.母体血浆胎盘亮氨酸氨肽酶和白介素6与 自发性早产的关系[J].上海交通大学(医学版), 2oo9,29(8):955—957. rII1IandauR,IaverriereA,BischofP,eta1.AIterationofcir— culatingPlacentalI.eueineAminopeptidase(P—LAP)ae— tivityinpreeclampsia[J].NeuroEndocrinolLett,2010,31 (1):63—66., [12]JohnsonMP,FitzpatrickE,DyerTD,eta1.Identification oftwonovelquantitativetraitlociforpre——eclampsiaSUS—— ceptibilityonchromosomes5qand13qusingavariance components—basedlinkageapproach[J].MolHumRe— prod,2007,l3(1):6l67. [13]StragierB,I)eBundelD,SarreS,eta1.Involvementofin— sulin—regulatedaminopeptidaseintheeffectsoftherenin- angiotensinfragmentangiotensinIV:areview[J].Heart FailRev,2008,13(3):321337. [14]ShibataK,KikkawaF,SuzukiY,eta1.Expressionofpla— centalleucineaminopeptidase(P—IAP)isassociatedwith pooroutcomeinendometrialendometrioidadenocarcino— maEJ].Oncology,2004,66(4):288295. r15]KondoC,ShibataK,TernuchiM,eta1.Anovelrolefor placentalleucineaminopeptidase(PIAP)asadetermi— nantofchemoresistanceinendometrialcarcinomacells [J].IntJCancer,2006,l】8(6):l390—1394. [16]HuanH,TanakaH,HammockBD,eta1.Noveland highlysensitivefluorescentassayforleucineaminopepti— —16. dasesEJ].AnalBiochem,2009.391(1):】1 (本文责任编辑杨庆华收稿日期:2olO03—10) 蛋清过敏原及其纯化方法研究进展 陈寅综述,李会强审校 (天津医科大学检验学院,天津300203) ? 综述? 【摘要】食物过敏是当今晕大生学问题,鸡蛋同人们的日常生活密切相关,但它又是重要的食物过敏原,对婴幼儿的影响 尤其突出.鸡蛋中过敏原成分的分析和NP,t~,对于建立特异性免疫球蛋白E检测方法及脱敏治疗非常重要.现对鸡蛋主要过敏 原的研究进展及其纯化方法作,综述. 【关键词】食物过敏;鸡蛋;过敏原;纯化 DOI:10.3969/j.issn.1673—4130.2010.12.033 中图分类号:R539.1;R446.1文献标识码:A文章编号:1673—4l30(2O10)12一 l410-04 过敏性疾病被认为是当今世界件的重大生学问题,其发 病率近年来不断上升_】l.鸡蛋含有丰富的营养物质,是日常饮 食中优良的蛋白质来源,也是婴儿出生后较早接触的食物之 一 ,同时又是粮食农业组织/界生纰织(FoodandAgricul— tureOrganization/WorldHealthOrganization,FA()/W}{0)认 定的导致人类食物过敏的8大类食物之?,美国以及欧盟规定 必须将其作为过敏原成分标示出来.据估计鸡蛋过敏的发 生率大约在1.6,3.2,甚至超过了牛奶过敏,成为美国和 欧洲国家儿童中最常见的速发型食物过敏反应. 食物过敏和过敏原 食物中并非所有成分都会引起过敏,真正引起变态反应的 成分被称为过敏原J.过敏原通常是食物中的水溶性或盐溶 性糖蛋白,相对分了质量多在(1O,70)xlO的范围内,倾向 于耐热,耐酸,耐酶解,等电点多为酸性,无生物化学和免疫化 学的共性,也无统一的氨基酸序列.90以上的食物过敏是 山牛奶,鸡蛋,鱼,贝壳海产品,花生,大豆,坚果类和小麦这8 种食物引起的.对过敏原制备,纯化方法及免疫学特性的研究