哺乳动物性别控制研究进展

哺乳动物性别控制研究进展 哺乳动物性别控制研究进展 《黑龙江畜牧兽i~)2005年第2期专论与综述63 哺乳动物性别控制研究进展 张淑娟 (黑龙江畜牧兽医职业学院,黑龙江双城150111) 中图分类号:s8l4.7文献标识码:A文章编号:1004—7034(2005)02—0063—02 性别控制对畜牧业生产有着重要意义.畜牧生产中许多 重要的经济性状都与性别有关,如肉,蛋,乳,毛,茸等的生产都 需要特定的性别的动物进行生产.近年来.随着胚胎移植技术 的逐步应用,特别是胚胎冷冻技术的不断完善,国际间的种畜 交流逐渐被出售的胚胎所代替,已知性别的胚胎则更加受欢 迎,目前迫切需要建立能与胚胎产业化相配套的性别鉴定技 . 术 1分离x.Y精子进行性别控制 1.1沉降法 沉降法蹙根据X精子的DNA含量高于Y精子,导致x精 子的密度及重量大于Y精子.在离,耐X精子的沉降速度快 于Y精子.此方法的优点是分离时间比一般沉淀分离短得 多,并对精子的活力影响较小,但存在着X精子间沉淀速度的 差异并不比x与Y精子间的差异要小的问题.Mestrich研 究认为x,Y精子间只存在0.007g/cm的密度差异,因此,采 用这项技术进行分离x,Y精子时,其条件和操作要求是需要 极其精确的. 1.2密度梯度离心法 Percoll是一种新的密度梯度介质,由一种聚乙烯咄咯烷酮 (evP)sio2所组成.岩崎说雄心用50%,9o%Percoll作为介 质,密度分为8个梯度,以250g离心15win分离牛的精液,楔 田博司等用30%,90%的Percoll,密度分为7个梯度进行分 离,结果下层雌性率达67%.Blotther等采用l0层不连续的 Percoll梯度离C吩离牛精子也获得成功,x,Y*~rT-纯度都达到 75%,两类精子作为体外受精后用PCR对胚胎进行检测,雌性 胚胎为75%,雄性胚胎达92%. 1.3电泳法 依据x,Y精子面膜电荷的不同,通过电泳时x,Y精子 在电场中向不同电极移动而达到分离的目的.Blottner等用自 由流电泳法处理牛的精液,在正极仅有少量的Y精子,而在近 负极处有80%的Y精子.杨信志采用无离子载体电泳分离 牛的精子,其结果阳极段为l9.25%,阴极段为柏.5%,中间段 为柏.25%. 1.4流式细胞分离法 收稿日期:2004—10—09 作者简介:张淑娟(1967一),女,黑龙江双城人,高级讲师.本 科. 根据x,Y精子上DNA含量的微小差别,通过流式细胞分 类器进行分离.该仪器是医学上的一种细胞分类测定设备,对 该仪器加以改造后,用于测定x,Y精子DNA含量的微小差 异,并可同时加以分离.x,Y精子的DNA存在差异,如牛的相 差3.8%,猪的相差3.6%,采用流式细胞分离仪分离精子,分 离程序是将精液稀释并与荧光染料(Hoechst)33342共同培养, 这种染料能定量地与DNA结合.当精子通过检索仪时,被激 光束激发,由于X精子比Y精子含有较多的DNA,所以X精子 放射较强的荧光信号.信号放出后,通过仪器和计算机系统扩 增,分析并分辨精子.含有单个精子的液滴被充上电荷,借助 两块各自带正电或带负电的偏斜板,把x精子和Y精子分别 引到收集管.流式细胞分离仪分离精子目前对活的精子分离 时,由于核的朝向不一致,加之尾部的影响而不能充分地对所 有精子准确区别和分离,一般可达70%,9o%但这是当前 精子分离方法中最新的也是分离纯度较高的一种方法.几年 来,经过不断改进已取得一些进展.Johnson分离牛,羊和猪的 *~rT-均获得高于9O%的x,Y精子群,并且分离后的精子仍具 有发育能力.Johnson等将分离后的兔精子作手术输精后,分 别得到94%的雌性和8l%的雄性后代,其后又对猪的精子分 离后授精,分别得到83%的雌性和7790的雄性仔猪.流式细 胞分类器在分离精子方面开创了—个新局面,但目前尚存在分 离速度慢和时间较长的问题.每小时仅能分离30,35万个精 子.这种速度,分离1份牛的常规输精剂量约需57h.因此, 所分离的样品目前仅能用于体外受精.另外,分离后的精子活 率也受到一定影响,受胎率有所降低,加之该仪器价格昂贵,故 而使该项分离技术的应用受到很大限制. 2控制母体的受精环境 弗拉季尔斯卡在精液中加入雄性激素,使猪后代雄性达 64%,70%.当加入雌性激素,则后代有6o%的雌性个体. 王念功将精氨酸用生理盐水稀释成中浓度,输精前30min向 阴道内注入1mL,结果雌犊率为55.07%(最高为73.9r7%)差 异显着.中国农科院畜牧所黄美玉等用0.3%醋酸注入母兔 生殖道后授精,使雌性仔兔比例达57.1%.谢献胜H利用5% 精氨酸对发情奶牛子宫进行注射20,30min后输精,雌性比 例为73.77%.以上表明受精环境影响子代的性别,因此在输 精时控制母畜的生殖道环境也可在一定程度上达到性控的目 的. 3早期胚胎性别鉴定 专论与综述 HeilongjiangAnimalScience andVeterinaryMedicineNO.22005 3.1核型分析法 核型分析法是通过Y染色体的核型鉴定来达到鉴定胚胎 性别的方法.操作程序:先从胚胎中取出部分细胞,用秋水仙 素处理使其处于有丝分裂中期,制备染色体标本,用显微摄影 分析染色体组成,确定性别,其作为细胞遗传学的方法是可靠 的,准确率达100%.但用于胚胎性别的鉴定不够理想,因为Y 染色体的核型鉴定只有在细胞分裂中期才能观察到,而从桑椹 期和囊胚期的胚胎里取出较多的分裂球才能获得处于分裂中 期的细胞,这样,胚胎细胞约有30%一40%无法观察,并且鉴 定时对胚胎具有很大损伤,因此缺乏应用价值. 3.2免疫学方法 这种方法的理论基础是雄性胚胎存在雄性特异性组织相 溶性抗原(H—Y抗原).方法是先分离H—Y抗原,制备抗 体,然后可通过两种方法分离雄性胚胎.第一种在培养液中加 入抗体和补体,培养一段时间,继续发育的为雌性.第二种先 将胚胎与H—Y单克隆抗体处理后,再用荧光素标记的第二抗 体处理:在显微镜下观察,有荧光的胚胎为雄性,无荧光的胚胎 为雌性.这种方法具有操作简便,迅速,对胚胎损伤小等特点, 可以保持胚胎正常的妊娠率,因而激起许多研究者在这一领域 积极研究,曾有大量的研究,建立了多种鉴定方法,如细胞 毒性法,间接荧光免疫法和酶联免疫法等. 3.3测定卵裂球的x染色体连锁基因剂量鉴男I】胚胎 性别 从胚胎中取出一个卵裂球,采用双重微量测定法,测定其 与x连锁的次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)和与常染色 体连锁的腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)的活性.由于在 8一细胞阶段,雌性胚胎中的两条x染色体均有活性,因此可 根据HPRT活性在基因剂量上的两倍差异,得到HPRT与AP- RT比率的双态分布图,因而鉴别出雄性和雌性胚胎,该方法比 较繁琐,所需时间长. 3.4孤雌生殖 Hoppre和mmensee把小鼠卵子激活为二倍体,将其内细 胞团的细胞移入去雌雄原核的正常鼠受精卵中,产下4只雌 鼠,其中一只有繁殖力. 3.5雄性特异DNA探针检测法' 从Y染色体上分离出的特异性片段作为探针,用放射性 或非放射性同位素标记成DNA探针,使其与检测的胚胎进行 Southern杂交,并根据显示的斑点来判断是否有Y染色体存 在.结果如果是阳性则胚胎为雄性,否则为雌性.探针的标记 物目前主要有放射性同位素和生物素两种.前者需要相当大 量的胚胎细胞和较长的时间,(一般同位素低温曝光需要7— 8d);后者设备简单,技术难度低,所需时间较短(一般24h), 但可鉴定的胚胎较少.此方法用于检测胚胎是成功的.许罕 华以牛雄性和雌性基因组DNA为探针,其阳性信号符合率 为85%,阴性信号符合率为87.5%.由于该项技术鉴定准确 性高,澳大利亚,美国,法国等已用于商业生产.但该方法仍存 在一些不足之处,如鉴定时需要用较多量细胞而对胚胎损伤较 大,尽管有人采用少量细胞也获得成功,但需用较高和较强的 同位素和在一定时间内完成.另外其鉴定时间较长以及每种 动物必须采用该种动物的特异探针.因此,该方法在广泛应用 上仍受到一定限制. 3.6PCR扩增法 聚合酶链反应是一种快速DNA扩增技术.HerT等首先 成功建立了家畜胚胎洼别鉴定的PCR法.其原理是在SRY基 因核心序列的两侧设计并合成一对特异性引物,分别互补于扩 增序列的两条链,在TaqDNA聚合酶和胚胎细胞DNA存在的 条件下,经过高温变性,低温退火和链延伸三个步骤进行DNA 扩增,将靶序列扩增至上百万倍以上,经电泳检测扩增结果,能 扩增出特异SRY序列的为雄性,反之为雌性.该技术可选定 染色体上某一段基因,在体外较短的时间内达到数十万倍的扩 增,方法简便,成功率高.可使过去只能依靠生物细胞或细菌 才能完成的工作,在试管内即可完成,并仅需极少量的DNA便 可用于扩增,这就解决了DNA探针方法对胚胎作性别鉴定时 的不够灵敏和不特异的问题.因此,该技术建立后很快被用于 胚胎的性别鉴定. 总之,人们对x,Y精子之间的某些差异进行了大量研究, 试图利用这些差异来分离不同染色体的精子.但到目前为止, 除了x,Y精子的DNA含量具有差异可以肯定之外,其他方面 的差异表现甚微或者尚难以确切的量来加以肯定.这些差异 还常由于各种环境条件的不同而发生变化.因此,许多研究结 果常常不一致,甚至出现相反的结论,致使对两类精子的某些 差异研究存在着争议.尽管如此,自20世纪50年代之后,关 于精子分离的研究报告仍然很多.这方面的工作一直在继续 深入,不断有新的研究结果发表.从目前洼别控制研究的范围 和进展情况来看,通过附植前胚胎性别鉴定来达到性别控制的 目的更具现实意义.因此,多年来胚胎性别鉴定的研究极其广 泛.对胚胎性别鉴定方法的要求应是准确,迅速,经济,简便和 无损害的,并应适合任何发育阶段的胚胎.SRY的发现,PCR 技术与核酸探针技术的发展使胚胎的性别控制进入了一个新 的阶段,但只有将简易鉴定 的PCR试剂盒以及经切割取样性别鉴定后的胚胎冷冻保存这 三项技术有机结合,才能更广泛地应用到生产中. 参考文献: [1]MestrichML. ColoradoUnisev~ityAssoclalionPress,1982-143—168. [2]岩崎说雄.家畜生物技术[M].乌鲁木齐:新疆人民出版社, 1989.19—78. [3]杨信志.牛x,Y精子的电泳分离及F—body检出的研究[J].黑 龙江动物繁殖,1993,l(3):22—24. [41谢献胜.精氨酸对奶牛后代性别控制的试验[J].畜牧与兽医, 2003,35(12):19—20. [5]许罕华.牛雄性特异性DNA片段的分子克隆[J].中国兽医学 报,1994,l4(2):130—134.(o07)