线粒体DNA突变与皮肤老化

国外医学皮肤性病学分册2003年第29卷第 3期 线粒体 DNA突变与皮肤老化 刘仲荣 刘玉峰 高天文 摘要 线粒体 DNA是哺乳动物细胞内唯一的核外遗传物质，具有独特的生物学特性，由于其 裸露无组蛋白保护且缺乏有效的修复系统，易受外源性因素影响发生突变并且在细胞内累积。线 粒体DNA突变在人类衰老及许多退行性变疾病中的作用已被广泛证实，研究线粒体 DNA在皮肤 老化中的作用及形成机制，对于皮肤老化的临床诊断、预防和治疗都具有重要意义。 关键词 DNA，线粒体 突变 皮肤衰老 一 、线粒体 DNA一般生物学特征 谢的调节。 人类线粒体 DNA(mitochondrial DNA，mtDNA) 是由 16 569个碱基对构成的双股环状闭合 DNA，分 子量约为 1．1×10 ，存在于线粒体基质中，是人类 独立于核基因组 DNA外的唯一基因组 DNA。mtD— NA的重链和轻链均有编码功能，包含有 37个基因， 分别编码 12S和 16SrRNA、20种 tRNA(tRNA 和 tRNA 均有双份基因)及 13个与线粒体氧化磷酸 化(OXpHOS)有关的蛋 白质。mtDNA上无内含子 ， 但有一个长 1～2 kb的非编码区，称为控制区，也叫 取代环(D—loop)，含有转录及复制的调控信号 j¨。 人体不同细胞类型含线粒体数 目不同，有的含数百 个甚至上千个，也有不含线粒体的细胞如成熟的红 细胞，每个线粒体中有 2～10拷贝的 mtDNA分子。 mtDNA的内共生来源、胞体定位及多拷贝等特 点决定了其不同于核 DNA(nDNA)的特征_2 J：①母 系遗传：mtDNA位于细胞质中，子代的mtDNA来自 于母体卵细胞或有丝分裂的细胞质。②异质性 ：突 变型的 mtDNA和野生型的 mtDNA可存在于同一细 胞中。③阈值效应：由于 mtDNA的异质性 ，只有当 突变型和野生型的mtDNA比值达到一定的阈值时， 细胞和组织器官才现 出功能的改变。④高利用 率：mtDNA具有极其经济的基因排列，无 内含子又 有部分基因可重复使用，任何突变都是有可能造成 重要生理缺陷的病理性突变。⑤高突变性：mtDNA 裸露无组蛋白保护且缺乏有效的修复系统，其突变 率约为核 DNA的 10～100倍。⑥协同作用 ：mtDNA 基因的表达受核 DNA的制约，二者协同参与机体代 作者单位：710032西安，第四军医大学西京医院皮肤科 173 · 综 述 · 二、线粒体 DNA突变 体内外多种因素可造成 mtDNA突变。在可能 导致 mtDNA突变的环境有害因子中，活性氧 自由基 最为重要。线粒体在呼吸链代谢中产生的超氧离子 和电子转运中产生的羟 自由基 ，使 DNA链上的脱氧 鸟苷(dG)转化成 8一羟基脱氧鸟苷(8一OH—dG)， 随后在 DNA复制中可诱发点突变。点突变的产生， 提高了 mtDNA双链的分离机会，促使 mtDNA发生 进一步突变，如缺失和重排。重排是发生在缺失之 后的事件。缺失的 mtDNA片段 ，既可能形成细胞内 的小环(minicircle)，也可能在 mtDNA或 nDNA上造 成重排。因而，体内外各种引起 自由基产生增多的 因素均可引起 mtDNA突变。另外，环境及食物中的 化学因素可使核苷酸烷基化 ，高强度的紫外线 、离子 辐射可引起 DNA链断裂，x线与化学性致癌剂可致 DNA交联；内部因素有 DNA聚合酶错误掺人、mtD— NA内在热不稳定性而引起 自发的化学突变、缺乏 组蛋白保护及相应的修复系统等等也是引起 mtD— NA突变的重要因素 。 mtDNA突变按突变细胞系不同可分为生殖细 胞系突变和体细胞系突变。mtDNA主要为母系遗 传 ，精子的mtDNA在受精过程中仅有极少量进人到 受精卵中，基本不起作用，其生殖细胞系突变主要指 女性生殖细胞系突变。任何可能发生的 mtDNA突 变均可涉及人类女性生殖细胞 ，其中以碱基置换的 点突变最为常见。生殖细胞内 mtDNA发生突变或 突变的数量增加时，可造成细胞内突变型及野生型 mtDNA同时存在，形成异质体；随后 ，突变型和野生 型 mtDNA通过减数分裂和有丝分裂随机分配到子 l； l 疆_l百厂- 维普资讯 http://www.cqvip.com l74 代细胞中，细胞中的突变型和野生型 mtDNA的比例 也随机增减，称为遗传漂变；同时，分裂后细胞有朝 同质体(全部为突变型或野生型 mtDNA)方向分化 的趋势，这一过程称为复制分离。随着复制分离和 遗传漂变的发生，一些 mtDNA的“中性突变”可以 建立同质体以一定频度保 留于人群中，形成 mtDNA 某个区段的多态性；而重度有害突变因复制分离而 形成的同质体个体发病早，极易随自然选择而消除， 多数重度有害突变无法建立同质体，其发病者多为 新出现的异质体型。介于上述二者间的轻度有害突 变，对繁殖后代影响不很严重，可在人群中建立低频 度多态性，但这些个体具有氧化磷酸化能力的缺陷 并过早发生退行性疾病。体细胞 mtDNA突变可能 是点突变，也可能是重排突变，重排突变又以大片段 缺失最为多见，缺失片段的长度及占总 mtDNA的量 决定了其产生影响的大小。近年来发现的 mtDNA 缺失类型已经有几十种，不同的缺失具有不同的组 织特异性，其中骨骼肌、脑、心，肌等是发生缺失较多 的组织。有资料表明，mtDNA缺失引起的疾病往往 是散发的、无家族史，发病率随年龄增长而增加 ，这 从反面 mtDNA的缺失突变多为体细胞突变_4j。 mtDNA的体细胞系突变与人类衰老及许多老 年退行性疾病有密切关系，与衰老相关的 mtDNA突 变有 5种：①大片段缺失 ；②点突变；③插入；④D— loop区小的串联重复；⑤DNA重排。目前已在人体 多种组织中检测到了这些突变，有些突变仅存于特 定的组织中，有的可以存在于多种组织中，同一组织 中也可有多种突变。其中大片段缺失突变和点突变 最为重要，也研究较多。 三、mtDNA突变的生物学效应 mtDNA主要编码与细胞呼吸链有关 的多肽成 分及多种 rRNA、tRNA，其缺陷必然干扰氧化磷酸化 的过程，影响细胞维持线粒体膜电位及调节钙离子 内流的能力。线粒体在细胞中的多种功能使 mtD— NA突变生物学效应更为复杂。mtDNA突变后所产 生的生物学效应有两种模式 ：细胞生物能阈值模式 和细胞程序性死亡模式 j。在细胞能量代谢方面， 由于 mtDNA的异质体特性，相关功能的障碍是否出 现与缺失或突变的 mtDNA所 占比例及突变的位点 有关，这个比例一般是 50％ ～90％，比例多高，即阈 值效应的出现与突变的类型及组织的耐受性有关。 在线粒体肌病中，活检标本中4 977bp缺失的比例 国外医学皮肤性病学分册 20o3年第 29卷第 3期 必需达到20％ ～80％，机体才表现出相关的临床症 状。而来 自线粒体肌病的肌肉活检标本中，复合体 I受到的影响最大，复合体Ⅳ、复合体 V所受的影响 则较少则说明缺失产生的生物学效应与其编码的基 因相关。 发生在 mtDNA结构基因上的突变 ，大多与细胞 呼吸功能有关，这些突变可通过选择性扩增和累积， 产生呼吸链局部障碍，导致生物能的缺陷，从而损害 多种生理过程。而发生于非编码区的突变 ，则可能 由于突变使该细胞 mtDNA聚合酶出现差错或出现 类似细菌的失事信号(save our ship，SOS)反应 ，激 活细胞中的相关基因，使细胞突变的 mtDNA得到优 先扩增而使细胞具有生长优势，这在人类直肠癌中 对同源或近源 的 mtDNA突变研究 中得到部分证 实 。 活性氧种(reactive oxygen species，ROS)是呼吸 链的毒性负产物，呼吸链的障碍同时也使 ROS内源 性产生增加 ，使生物能的缺陷进一步加重。生殖细 胞种系突变特别是患有线粒体病能加速这一病理过 程 ，导致早衰。而在正常个体 中，mtDNA氧化损伤 和体细胞突变累积到一定程度，表达后则产生衰老、 退行性变 、肿瘤等"j。线粒体也是诱 发凋亡的开 关 ，生物能缺陷、自由基产生增多均可诱导细胞发生 凋亡从而使组织中细胞大量丢失，引起组织功能的 减退和障碍。 尽管已经有相当多的疾病被证实是 mtDNA突 变引起的，但在 mtDNA突变中，更多是对机体无害 的也无益的所谓“中性突变”，加上野生型线粒体的 补偿作用也对发生了 mtDNA突变的细胞起到保护 作用；这就使 mtDNA突变时，并不立即产生严重后 果。体外实验表明，带有突变的mtDNA的细胞并非 只能向恶性方向发展，细胞复制分离过程中，有相当 部分具有形成野生型同质体的倾向_8 J。但 mtDNA 突变型的复制速度往往超过野生型，这是突变累积 的另一重要原因。总之，补偿和累积是对立的，不同 的组织或细胞可能有较大的差异。 四、mtDNA突变与皮肤老化 皮肤老化是机体衰老的一部分，机体的衰老在 皮肤上表现得最清楚。mtDNA突变在人体衰老中 的作用 已被广泛证实_9j，目前，mtDNA突变及累积 也被认为是人类皮肤老化尤其是皮肤光老化的重要 因素。环境因素对 mtDNA突变在皮肤组织 中的出 ———厂_1『i 耵 } I —了～一 维普资讯 http://www.cqvip.com 国外医学皮肤性病学分册 2003年第 29卷第3期 现和累积有重要意义，皮肤组织中 mtDNA突变主要 有以下特点： (一)多重 mtDNA突变的存在：人体 内存在着 多种的 mtDNA突变，目前认为研究最多的 4977bp 缺失只是 mtDNA突变“冰山模型”中的最先露出的 部分，其底部位存在大量尚未检测的突变，这一整体 共同作用的积累导致了细胞能量代谢方面的障碍， 从而加速了衰老的进程。皮肤中 mtDNA突变包括 缺失突变、点突变及小串联重复。研究者以PCR方 法在皮肤中检测到了4 977 bp、7 436 bp缺失及小串 联重复；缺失以4 977 bp缺失最为常见，但同时存在 其它多种缺失。同一作者在对 1例 86岁男性个体 不同部位的皮肤检测中，发现皮肤组织除了有较高 水平的4 977 bp缺失外，还存在7 031 bp、7 150 bp、 7 288 bp、7 485 bp多种不同片段长度的缺失_1 。 多种来源于线粒体突变相关疾病的培养皮肤成纤维 细胞已证实皮肤组织中同样具有原发于其它组织 (大脑、肌 肉等)线粒体疾病的多种特征性的点突 变，研究也发现在正常老年人皮肤真皮培养成纤维 细胞中有大量的点突变在复制控制区累积。 (--)mtDNA突变随年龄增高累积：衰老过程中 不同缺失在特定组织中出现是否有一个年龄梯度， 是人们关心的问题。研究者通过 PCR检测发现，在 心肌组织中，4 977 bp缺失出现的年龄为 >21岁， 7 436 bp缺失为 >40岁，而 3 610 bp缺失仅在60岁 以上的老年人中能检测到。在皮肤组织中，Yang等 采用 PCR技术检测了 mtDNA 4 977 bp缺失，在 60 岁以下个体中未发现该缺失，而在 61～70岁 、71～ 80岁、81～90岁组中4 977 bp缺失的检出率分别是 20％ 、46．7％、83．4％，而另一报道 中，同一作者在 30岁以后的个体就检测到了多种 mtDNA突变。而 Kao等 ¨在检测不同年龄组中国人毛囊组织中的 4 977 bp缺失则发现在 21～31岁组 即可检测到 4 977 bp缺失。但研究也发现，即使是最为常见的 4 977 bp缺失，在皮肤中的缺失量也是非常低的。 采用定量的等位基因特异 PCR(AS—PCR)方法分析 A3243G的突变，50％的标本可以检测到这种突变， 其丰度为 0．01％ ～0．12％，4 977 bp缺失的总体发 生 率 也 大 约 为 50％，其 丰 度 为 0．0002％ ～ 0．1％ [1：] 。 (三)mtDNA突变在皮肤组织中不均衡分布：皮 肤中，细胞类型不同，mtDNA突变的类型和量也不 一 样。除了在真皮成纤维细胞的 mtDNA突变有较 l75 多报道外，毛囊组织由于便于取材并且其 mtDNA的 多态性可能应用于遗传学中的同源性分析，也有较 多报道。检测来源于 433例 21～99岁中国人头皮 两侧毛囊老化相关的人类 mtDNA突变，研究者发现 毛囊组织中存在0．05％ ～1．89％ 4 977 bp、7 436 bp 缺失突变；对分离的真皮 、表皮进行4 977 bp缺失进 行检测，发现真皮中的缺失发生率的缺失量均远高 于表皮，并且认为表皮中出现的阳性也是由于真皮 成分污染的结果 。而另几个研究者报道了在表 皮肿瘤中未检测到 mtDNA的缺失。实际上，皮肤中 其它细胞成分，包括神经细胞、脂肪细胞、黑素细胞 、 汗腺组织中 mtDNA突变的情况由于细胞较少或取 材分离较难而少有报道，这有赖于 mtDNA突变原位 检测技术的发展和灵敏度的提高。 (四)皮肤组织中 mtDNA突变累积与外界因素 相关：皮肤老化受多种外界因素的影响，其中最重要 的是阳光中紫外线长期 、反复的照射。暴露部位皮 肤的mtDNA突变发生率和丰度高于非暴露部位已 被广泛证实。有人_1 采用定量 PCR方法比较 1例 老年人皮肤不同部位的4977bp缺失的量，发现 日光 暴露部位(头 、面部)的缺失的 mtDNA占总 mtDNA 12．5％，非暴露部位(躯干、臀部)为 0．4％；Kawasa— ki等 ¨对 mtDNA中 CC一1Tr的点突变进行了检 测，体内不暴露于阳光中的组织(胃、小肠、血细胞) 50例 中均未发现突变，而 111例皮肤标本中有 17 例出现阳性，暴露部位的阳性率为 25．5％(13／51)， 远高于非暴露部位的3．8％(1／26)，在阳性标本中 突变的频率大概为 10～～10 (10。拷贝的野生型 mtDNA中有 10～100拷 贝发生突变)。另外，吸烟 可能也是引起 mtDNA突变的重要因素，uu等 刮¨发 现毛囊组织中4977bp缺失的发生率与吸烟指数密 切相关 五、小结与展望 如何区分皮肤的固有性老化和光老化及肿瘤的 发生与光老化之间有何联系的问题一直是皮肤老化 相关研究中关注的热点 ，uV反复照射是皮肤光老 化和肿瘤多发的共同诱因，mtDNA对 uV的损伤比 核 DNA更敏感特异，mtDNA突变在人类退行性疾 病及肿瘤发生发展中的作用已被广泛证实，通过对 皮肤老化中线粒体 DNA突变的研究可能为解决以 上问题提供新的思路。但线粒体 DNA突变对皮肤 老化过程中出现的生物学功能的改变是如何关联的 一——— —1 甄 ：疆：’ T■_ ⋯一 维普资讯 http://www.cqvip.com 176 仍是目前研究的重点。要解决这方面的问题，一方 面需要可以对全部 mtDNA突变进行定量和在人类 组织进行原位检测的分析技术，同时选择合适的器 官建立相关的 mtDNA突变人体模型可能也有重要 的意义。 总之，了解 mtDNA突变的机制及其与皮肤老化 的关系对于皮肤老化的临床诊断、预防和治疗可能 都具有重要意义，但这些关系是极其复杂的，许多推 论还有待于大量的研究来证实。 参 考 文 献 l Jansen RP．Ofi~n and persistence of the mitochondrial genome．Hum Reprod．2000，15(Suppl 2)：l—lO． 2 JoMe LB．Watkins WS，Bamshad MJ，et a1．The distribution of hu— man genetic diversity：a comparison of mitochondrial，autosomal，and Y—ehromoflome data．Am J Hum Genet，2000，66(3)：979—988． 3 Biekham JW，Sandhu S，Hebert PD，et a1．Effects of chemical con— taminants on genetic diversity in natural populations：implications for biomonitofing and ecotoxicology．Mutat Res，2000，463(1)：33— 51． 4 Vijg J．Somatic mutations and aging：a re—evaluation．Mutat Res， 2000．447(1)：ll7一l35． 5 Sastre J，BorrasC，Garcia—SalaD，eta1．Mitochondrial damageinag— ing and 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