分子生物学实验-实验操作

null重组人白介素-18(rhIL-18)基因工程菌的构建重组人白介素-18(rhIL-18)基因工程菌的构建分子生物学实验-实验操作基因、载体、受体菌株基因、载体、受体菌株基因载体菌株质粒酶切连接转化质粒提取PCR实验技术要求实验技术要求应掌握的实验技术 酶切,连接 凝胶回收 制备感受态细胞 质粒提取 PCR 琼脂糖凝胶电泳考察指标 电泳 电泳 感受态细胞转化率 电泳 电泳 电泳 实验流程: 第一天实验流程: 第一天rhIL-18基因的PCR产物质粒pUC18BglⅡ和PstⅠ双酶切BamHⅠ和PstⅠ双酶切浓度1%琼脂糖凝胶电泳凝胶回收配制 LB 液体与固体平板培养基灭菌实验流程: 第二天实验流程: 第二天凝胶回收与溶液回收电泳检验T4连接酶连接过夜E .coli DH5α菌株 37℃过夜培养实验流程: 第三天实验流程: 第三天提取质粒DNA浓度1%琼脂糖凝胶电泳实验流程: 第四天实验流程: 第四天PCR浓度1%琼脂糖凝胶电泳双酶切反应（20μL体系）双酶切反应（20μL体系）rhIL-18的PCR产物 PCR产物 10μL Buffer O 2μL 无菌水 7μL BglⅡ 0.5μL PstⅠ 0.5μL 质粒pUC18 质粒 10μL BamHⅠ Buffer 2μL 无菌水 6.7μL BamHⅠ 0.3μL PstⅠ 1μL37℃酶切反应3小时。Hybrid siteHybrid site培养基配制培养基配制LB液体培养基 每1L配量： 蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 氯化钠 5g 调节pH到7.0 LB固体培养基: 每100ml液体培养基添加1.5g琼脂 每组准备： 1个30ml 液体培养基灭菌灭菌1个30ml LB 液体培养基 微量移液器枪头（200uL）琼脂糖电泳琼脂糖电泳琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA 片段的。 DNA 的分子大小 琼脂糖浓度 DNA 分子的构象 电源电压 嵌入染料的存在 离子强度影响琼脂糖凝胶回收琼脂糖凝胶回收琼脂糖凝胶电泳检验，回收酶切产物：使用UNIQ-10柱式凝胶回收试剂盒 分别对： 目的基因片段（0.5Kb片段）溶液回收 载体片段（2.7Kb片段）进行凝胶回收 琼脂糖凝胶回收琼脂糖凝胶回收1.通过琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其他片段尽可能分开，然后用干净的手术刀切下含需回收DNA的琼脂块，放入Ep管。 2.按300μL/100mg（3:1）的比例加入 Binding BufferⅡ，置于50-60℃水浴中10min，使凝胶彻底融化。期间，每2 min混匀一次。 3.将融化的溶胶液转移到套在 2-ml 收集管的UNIQ-10柱中，室温放置 2 min。12000 rpm 室温离心 1 min。 4.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加入500μL Wash Solution，12000 rpm 室温离心 1 min。 5.重复步骤4一次。null6.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将 UNIQ-10 柱放入同一个收集管中，12000 rpm 室温离心 2 min。 7.将 UNIQ-10 柱放入一根新的 Ep 管中，在柱子膜中央加30μL Elution Buffer，60℃放置 5min。 8.12000 rpm 室温离心 1 min ，离心管中的液体即为回收的DNA片段。 从溶液中回收DNA： 根据溶液的体积，加入 3 倍体积的 Binding BufferⅡ混匀。 以下操作参照琼脂糖凝胶中回收DNA步骤3-8. 计算基因与载体片段比例计算基因与载体片段比例紫外下观察基因与载体片段的亮度 基因的摩尔数≈基因片段亮度/碱基数（495bp） 载体的摩尔数≈载体片段亮度/碱基数（2700bp） 基因摩尔数/载体摩尔数 最佳比例是3：1连接反应连接反应⑴ 在灭菌的0.2mL离心管（PCR管）中进行 ⑵ 20μL体积反应体系中： 10×快速连接缓冲液 2μL rhIL-18双酶切产物 X μL 质粒pUC18双酶切产物 Y μL T4-DNA连接酶 1μL 20℃1h，4 ℃过夜感受态菌的制备感受态菌的制备（1）E.coli DH5α菌株37℃过夜培养以复苏菌种，取过夜培养的菌液0.3mL加入到30 mL LB培养基中，37℃，230 r/min振荡培养3 h，至OD600约为0.4左右。 （2）无菌条件下，将50mL菌液转移至离心管中，冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。 （3）在预冷4℃的离心机上以4000r/min离心10min，弃去上清，加入30mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬沉淀，冰浴上放置10 min。 （4）以4000r/min在4℃离心10min，弃去上清，每30mL初始培养物用1.0mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液重悬细胞沉淀，200μL/管分装。pUC18-hIL-18重组质粒的转化pUC18-hIL-18重组质粒的转化（1）向分装有200μLE.coli DH5α菌株感受态细胞的EP管中加入10μL的上步中得到的连接混合物，轻轻旋转以混合内容物，冰浴上放置30 min。 （2）将该EP管放入预加温至42℃的水浴中，放置90s，快速转移到冰浴中，使细胞冷却1~2 min。 （3）向EP管加入800 μL LB培养基，转移至37℃摇床上，150r/min，温育45 min以复苏菌株。 null （4）将200μL上述培养物加到含100μg/mL氨卞青霉素的LB平板上，以玻璃涂布棒轻轻地将转化细胞平铺于琼脂平板表面。 （5）将平板置于室温下至液体被完全吸收，倒置平皿，37℃过夜培养，筛选鉴定。 UNIQ-10柱式质粒小量抽提UNIQ-10柱式质粒小量抽提1． 将过夜培养的1～2ml细菌12,000rpm离心1 min，彻底去除上清。 2． 加入250l Solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。 3．  加入250 l Solution II，立即温和混匀（倾斜45度角，顺一个方向，慢慢旋转离心管），使细菌裂解，室温放置2分钟。 4． 加入350l Solution III，立即上下颠倒5～10次，使之充分中和，室温放置5分钟。 5． 12,000rpm，离心10分钟。 6． 将步骤5中上清转移到套放于2.0ml收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2 min后，8,000rpm室温离心1 min。 7． 弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一支收集管中，吸取500l Wash Solution到UNIQ-10柱，10,000rpm室温离心1 min。 8． 重复步骤7。 9． 弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一支收集管中，12,000rpm室温离心2 min以彻底去除Wash Solution。 10． 将UNIQ-10柱放入新的洁净1.5ml离心管中，加30l Elution Buffer，60℃放置10 min后，10,000rpm室温离心1分钟。离心管中的溶液即为所抽提的质粒DNA。PCR鉴定阳性克隆原理PCR鉴定阳性克隆原理PCR鉴定PCR鉴定1、调整模板（ 待鉴定质粒）浓度至 5 ng/ μL 2、按下列体系配制反应混合液，混匀， Template DNA                  1.0 μL 10 × PCR buffer                   2.0 μL MgCl2（25mmol/L）         1.5 μL M13 Primer M4 (10μmol/L)             0.5 μL M13 Primer RV(10μmol/L)             0.5 μL dNTPs （2mmol/L）     2.0 μL Taq酶 （5U/μL）        0.5μL 加ddH2O至               20μL外源基因的特异引物： 引物M13 Primer M4:（5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’） 引物M13 Primer RV: （ 5’-CAGGAAACAGCTAAC-3’）null3．PCR 反应循环条件设置 94℃变性反应30s； 45℃退火反应30s； 72℃延伸反应30s。 进行20个循环后，最后一个循环72℃延长至10min。 4、检测 加 0.6μL 6 × Loading Buffer和3μL 反应产物，混匀，点样电泳。 5、成像 在 1% 的琼脂糖凝胶上点样电泳0.5~1h，电泳结束凝胶成像分析结果。