不同骨转移潜能人前列腺癌细胞亚株的筛选

型的前 列腺癌细胞才能够形成骨转移，并认为前列腺癌细 胞的自身特性在这一过程中可能起到关键作用［#’0］。 因此，通过研究不同骨转移潜能的前列腺癌细胞的 表型特征，将有助于揭示前列腺癌骨转移的机制。 我们通过反复建立人前列腺癌细胞系 %&’# 裸鼠骨 转移模型和体外培养的方法，筛选不同骨转移潜能 -#* 《中国癌症杂志》*$$4年第 -4 卷第 # 期 &RZ[7 \[&\]\^_! *$$4! ‘:J2 -4! [:2 # 万方数据 的细胞亚株，为探究前列腺癌骨转移的机制奠定基 础。 !" 材料和方法 !# !" 实验动物" $%&$ ’ ()*+ ’ *+ 雄性裸鼠（购于上 海斯莱克实验动物中心）,- 只，鼠龄 . / , 周，体重 !0 / 1- 2。在 345（ 678(9:9( 7;<=>28* :?88）条件下我 院裸鼠室内饲养。 !# #" 主要试剂" @;A’6 ’ 5!1 液体培养基（@B(C>*8 公司），胎牛血清（5$3）（D9E(> 公司），青霉素 D、链 霉素、!型胶原酶、透明质酸酶和牛血清白蛋白 （$3%）（392A; 公司），F;6(98*(8），小 鼠抗人单克隆细胞角蛋白 0 ’ !0（ (B<>I8?;<9* 0 ’ !0， JK0 ’ !0）抗体（3;*<; J?+L 公司），小鼠抗人前列腺 特异性抗原（43%）抗体（M>N> 68?><8(），34试剂盒和 3%$J（荧光 5OPJ）试剂盒（北京中衫公司）。 !# $" 肿瘤细胞株" 人前列腺癌细胞株 4J)Q 及鼠成 纤维细胞系 MO@QPQ（购于中国典型培养物保藏中 心，JJPJJ）。用 @;A’6 ’ 5!1 完全培养基（含 !-R 胎牛血清，青霉素 D !-- + ’ AC，链霉素 !- "2 ’ AC）在 QS T、URJV1条件下培养，每 Q 天更换培养液一次。 用 -# -!RWHP% ’ -# !1UR胰蛋白酶消化对数生长期 的 4J)Q 细胞；室温下 !--- ? ’ A 离心 U A9*（离心机 型 392A; QK!0），用 H)@;*I’6 缓冲液漂洗两遍；H) @;*I’6 缓冲液重悬 4J)Q 细胞，调整细胞密度为 1 X !-S ’ AC。 !# % " 裸鼠骨转移模型的建立 " 采用戊巴比妥钠 （按 ,- A2 ’ I2的剂量）腹腔注射法麻醉裸鼠 !U 只。 用 1YD针头 ! AC注射器自左第二肋间隙进针，轻轻 回抽见鲜血进入针头球泡内，并可见持续搏动时，随 即在 Q- / .- 6内将 -# ! AC 4J)Q 细胞悬液缓慢注入 左心室。术后第二周起，每周行 Z 线拍片检查（K>) [;I数字式 #线摄影机，H\ S!-- 型，条件为 .- I]， 1U- A%，-# !1U A3），发现骨组织出现溶骨性损害者 为阳性，处死动物模型后行病理组织学检查，了解肿 瘤转移情况并计算骨转移率。 !# &" 不同骨转移潜能细胞亚株的筛选" 乙醚麻醉 骨转移灶阳性的裸鼠后，拉颈处死动物，无菌切取骨 转移灶和转移的淋巴结，用 -# !R!型胶原酶和透 明质酸酶 QS T水浴消化 ! =，收集细胞，用 @;A’6 ’ 5!1 完全培养基培养。通过反复差速贴壁法纯化细 胞，并按 34 和 3%$J)5OPJ 试剂盒说明书步骤行人 前列腺上皮物 JK0 ’ !0 和 43% 免疫染色鉴定。 获得的骨转移灶细胞亚株 PQ 经体外培养 . 周后，取 !- 只裸鼠按上述方法重复造模和筛选，同法获得细 胞亚株 PQ$。另从转移的淋巴结转移灶中获得细胞 亚株 41.。分别将 PQ$和 41. 细胞按上述方法重复 造模 !- 只裸鼠。 !’ (" 人前列腺癌细胞亚株 )$*、+#% 及母系 +,-$ 的细胞生物学特性比较 !# ,# !" 细胞增殖率" 分别以 U X !-Q接种 PQ$、41. 和母系细胞 4J)Q 于 Y, 孔细胞培养板中，于接种后 第 ! 天起连续 , 天，采用 FPP 法检测细胞增殖情 况，并绘制细胞生长曲线。 !# ,# 1" 细胞软琼脂克隆形成率" 参照司徒镇强［,］ 的方法，行软琼脂克隆形成率实验，按 U- 个细胞 ’孔 密度接种于 !1 孔细胞培养板，每组设 . 个孔。QS T、URJV1条件下培养 Q 周，计数大于 U- 个细胞的 克隆团，并计算克隆形成率。 !# ,# Q " 细胞黏附实验 " 以 ! X !-. ’孔密度接种细 胞于底部预先铺有 !- 2 ’ & $3% 或 ! A2 ’ AC F;B[8* 小室（J>6<;?）分 别检测 PQ$、41. 和 4J)Q 的体外侵袭能力。小室底 部为 0 "A 孔径的 4]4)聚碳酸膜，预先用 ! A2 ’ AC 的 F; &./ 1; ?@A=; 67:9B=B8 C=7C1;:A= C8DD9 D1;8 &)*$ =;> 1B9 9@E6:6@D=B1:;9 34456789:;7<8=49<>? :;>9696@ 7A !"#（ >），$%&（B）>6C $,2"（ <）D9;8 ;8= >6;92854>6 ,-’ . /’ >6;9B7CE >F= :;>96=C 96 BF7D69:8（ G %HH）I（C） 344567A?57F=:<=6<= :87D: ;8>; !"# <=??: =JKF=:: 854>6 $01（L3!, G %HH）I ’3 ’" #$%、&’( 及母系 &)*$ 裸鼠体内骨转移率比 较M $,2"、!"#及 $%& 分别经左心室注射入裸鼠体 内后，骨转移灶经影像学检查和病理切片鼠抗人 $01免疫组织化学鉴定（见图 %），其骨转移率分别 为 &HN、’HN和 /HN。经 !%检验，!"# 骨转移率显 著高于 $%&（! O HI H/）和母系细胞 $,2"（! O HI H*）， 而且除检出少数淋巴结转移外，未见骨以外部位转 移灶的形成（见表 /）。 图 ’" 裸鼠骨转移灶 F线表现及病理组织染色鉴定 0123 ’" G=>1:27=6?1C，?19B:D:21C=D =;> 1AA@;:?19B:D:21C=D 1>8;B1<1C=B1:; :< A8B=9B=919 1; ;@>8 A1C8 >：P>C97@F>K8 :87D: 7:;=7?E:9: 96 ;8= KF7J94>? ;9B9> 7A 65C= 475:=I B：QR :;>9696@ 7A :=<;976 AF74 ;8= 4=;>:;>:9:（ G /HH）；<：34456789:;7<8=49<>? :;>9696@ 7A :=<;976 AF74 ;8= 4=;>:;>:9:（ G %HH）I ,=??: 944567F=><;9S= D9;8 ;8= >6;92854>6 $01 >6;9B7CE >F= :;>96=C 96 BF7D69:8I #：B76= ;F>B=<5?>；!：;547F <=??:I 表 !" 左心室注射人前列腺癌 &)*$ 及其亚株后 裸鼠体内转移情况 #=E3 !" H8B=9B=989 :EB=1;8> 1; ;@>8 A1C8 I1B? &)*$ ?@A=; 67:9B=B8 C=7C1;:A= C8DD9 =;> 1B9 9@E6:6@D=B1:;9 EJ D8:;>:9: #76= VE4K8 67C= V56@ 1CF=6>?@?>6C） 0K96>? <7FC 0W96 $,2" /* +（&H） &（%+I X） "（%H） %（/"I "） /（+I X） /（+I X） !" /H *（*H） %（%H） H H H H !"# /H ’（’H） %（%H） H H H H $%& /H /（/H） "（"H） %（%H） H H H ’3 $" #$%、&’( 及母系 &)*$ 的细胞生物学特性比 较 %I "I /M 细胞增殖率结果M U!!结果显示，!"#细胞 的体外增殖速度最低，其次为 $%&，母系细胞 $,2" 最高（见图 "、表 %），但是三者之间的差异无显著性 （! Y HI H*）。 图 $" #$%、&’( 与 &)*$ 细胞生长曲线 0123 $" #?8 27:IB? C@7K89 :< #$%，&’( =;> &)*$ C8DD9 表 ’" #$%、&’( 与 &)*$ 细胞H##检测结果 #=E3 ’" #?8 27:IB? 7=B89 :< #$%，&’( =;> &)*$ C8DD9 EJ H## =99=J Z/ Z% Z" Z& Z* Z+ !"# HI%/& [HIH%H HI%&% [HIH// HI%)* [HIH"/ HI&*/ [HIH%H HIXH+ [HIH/* HI’/" [HIH/% K%& HI%/’ [HIH/’ HI%+" [HIH%H HI"/ [HIH%& HI&X% [HIH/X HIX&X [HIH/& HI’X* [HIH/+ $,2" HI%/& [HIH/* HI%++ [HIH%% HI"/) [HIH%" HI&)+ [HIH/& HIX*/ [HIH// HI)HH [HIH/) %I "I %M 软琼脂克隆形成率结果M 培养 " 周后，相差 显微镜下计数 Y *H 个细胞的克隆团，!"#、$%& 及 $,2" 的软琼脂克隆形成率分别为（%/ [ "）N、（%" [ "）N 和（ /X [ "）N，三者比较差异无显著性 （! Y HI H*）。 %I "I "M 细胞黏附实验结果 M U!! 检测结果（见图 &）示，在 )+ 孔细胞培养板底部包被 /H @ . V #01时， ""%《中国癌症杂志》%HHX 年第 /X 卷第 " 期 万方数据 !"#、$%& 和 $’(" 细胞黏附状况无差异，而底部包被 ) *+ , *- ./012+3- 时，!"# 的光吸收 ! 值显著高于 $%& 和 $’(" 的 !值（" 4 56 5)）；!"# 的细胞黏附率 （))% 7 8）9与 $%&（856 " 7 %6 :）9 和 $’("（:: 7 &）9比较差异有显著性（" 4 56 5)）。而 $%& 与 $’( " 之间差异无显著性（" ; 56 5<）。 图 !" #$%、&’! 与 &()$ 细胞在不同基质下的黏附能力 *+,- !" ./012+31 4564157+12 68 #$%，&’! 9:/ &()$ ;1<<2 211/1/ 6: /+88151:7 2=>2759712 %6 "6 &= 细胞侵袭实验结果 = 在 >?@"!" 细胞培养 上清的诱导下，!"#、$%& 及 $’(" 迁移到膜背侧的细 胞数分别为（<" 7 A）个 ,视野、（") 7 "）个 ,视野和 （%& 7 <）个 ,视野。!"#体外侵袭能力显著高于 $%& 和 $’("（" 4 56 5)），而 $%& 与 $’(" 之间差异无显著 性（见图 <）。 图 ?" #$%、&’! 与 &()$ 细胞体外侵袭能力比较 *+,- ?" @:392+31 4671:7+9< 68 #$%，&’! 9:/ &()$ ;1<<2 A192=51/ >B %6B/1: ;09A>15 A1706/ %6 "6 <= 皮下成瘤实验结果= !"#、$%& 和 $’(" 均能 在裸鼠皮下接种后第 " 天形成瘤结节，成瘤率均为 )559（< , <）；瘤体增长速度及体积（见图 A），三者 间差异无显著性（" ; 56 5<）。 图 C" #$%、&’! 与 &()$ 裸鼠皮下种植瘤体积 D时间变化曲线 *+,- C" #01 ;=531 68 7=A65 36<=A1 ;09:,12 68 :=/1 A+;1 98715 2=>;=79:16=2 +:E1;7+6: 68 #$%，&’! 9:/ &()$ ;1<<2 51241;7+31］1 (?.. @=54 A.9B，%CC*，**（D）：&’")&’’1 ［%］+ (,37;-.6 EF，G.997 E(，/32H943BI J(1 H566-7543<594 34I 8.9K<, 9L 2342-. 2-BB6 54 7-<36<3<52 65<-6［ >］1 M3< N-: (342-.， %CC%，%（’）：DO")DP%1 ［"］+ M-7-<, >E，Q9?65L N，R-.S98 /，-< 3B1 /3<.5T 7-<3BB9=.9<-5436- 32<5:5］1 > M3］1 #59B (,-7，%CC%，"’" （*）：%%V)%"&1 ［D］+ X9-4-734 XY，Q-?48 F，(,?48 0Z1 @6<-9757-<52 =.9=-.<5-6 9L =.96<3<- 2342-. 2-BB6：3 ,U=9<,-656 6?==9.<548 <,- =.-I5B-2<594 9L =.96<3<- 2342-. 7-<36<3656 34I 8.9K<, 54 <,- ;94- -4:5.947-4<［>］1 $.96<3<-，*VVV，"V（&）：%&O)%O*1 ［O］+ 司徒镇强，吴军正主编1 细胞培养［/］1 西安：世界图书出版 社，%CC&：%&V)%DC1 ［P］+ 054-,34 Z/，0948 >$，Y<--8 $Y，-< 3B1 /-<36<3<52 79I-B6 34I 79B-2?B3. 8-4-<526 9L =.96<3<- 2342-.［ >］1 > M3E，R3.; >F，#3..969 A >.，-< 3B1 Y-:-.- 297;54-I 57) 7?49I-L525-4<),? 79I-B 9L ,?734 =.96<3<- 2342-. 7-<36<3656 <9 ,?) 734 ;94-［>］1 (342-. N-6，*VVV，DV（P）：*V’P)*VV"1 （收稿日期：%CCO)C’)%’ + 修回日期：%CCO)*%)%C） D"%《中国癌症杂志》%CCP 年第 *P 卷第 " 期 万方数据 不同骨转移潜能人前列腺癌细胞亚株的筛选 作者： 廖晖， 陈安民， 郭风劲， 李锋， 罗政强， 宋登新， 陈超， LIAO Hui， CHEN An-min ， GUO Feng-jin， LI Feng， LUO Zheng-qiang， SONG Deng-xin， CHEN Chao 作者单位： 华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科,湖北,武汉,430030 刊名： 中国癌症杂志 英文刊名： CHINA ONCOLOGY 年，卷(期)： 2007,17(3) 被引用次数： 4次 参考文献(8条) 1.Nemeth JA;Harb JF;Barroso U Jr Severe combined immunodeficient-hu model of human prostate cancer metastasis to human bone[外文期刊] 1999(07) 2.Linehan WM;Long JP;Steeg PS Metastatic models and molecular genetics of prostate cancer[外文期刊] 1992(12) 3.司徒镇强;吴军正 细胞培养 2004 4.Koeneman KS;Yeung F;Chung LW Osteomimetic properties of prostate cancer cells:a hypothesis supporting the predilection of prostate cancer metastasis and growth in the bone environment 1999(04) 5.Angelucci A;Festuccia C;D'Andrea G Osteopontin modulates prostate carcinoma invasive capacity through RGD-dependent upregulation of plasminogen activators[外文期刊] 2002(01) 6.Nemeth JA;Yousif R;Herzog M Matrix metalloproteinase activity,bone matrix turnover,and tumor cell proliferation in prostate cancer bone metastasis 2002(01) 7.Chambers AF;Groom AC;MacDonald IC Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites[外 文期刊] 2002(08) 8.Cher ML Mechanisms governing bone metastasis in prostate cancer[外文期刊] 2001(05) 本文读者也读过(10条) 1. 谭忠华.沈维东.樊冀伟.朱冠全 前列腺癌骨转移患者89SrCl2治疗后血清E-选择素浓度的变化[期刊论文]-中国 肿瘤临床2005,32(20) 2. 邹永平.杨堃.刘玲.蔡金来 前列腺癌骨转移与PSA、BCL-2和P53的关系[期刊论文]-临床泌尿外科杂志 2003,18(2) 3. 吴波.WU Bo 89Sr治疗晚期前列腺癌伴骨转移的临床疗效观察[期刊论文]-海南医学2010,21(10) 4. 杨晨.姚阳.YANG Chen.YAO Yang CXCL12/CXCR4生物学轴诱导前列腺癌骨转移的作用机制研究进展[期刊论文]- 现代肿瘤医学2009,17(8) 5. 汤召兵.陈在贤.刘朝东.刘航.王德林 153Sm-EDTMP治疗前列腺癌内分泌治疗后骨转移骨痛的效果评价[期刊论文 ]-重庆医科大学学报2006,31(3) 6. 杜俊华.姜昊文.关明.童仕俊.丁强.于德新.DU Jun-hua.JIANG Hao-wen.GUAN Ming.TONG Shi-jun.DING Qiang. 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