脂肪酶催化乙酯甘油酯酯交换制备富含EPA和DHA的甘油三酯

2011年 第 36卷 第 l期 中 国 油 脂 13 精 {{：：学 脂肪酶催化 乙酯甘油酯酯交换制备 富含 EPA和 DHA的甘油三酯 李金章，王玉明，薛长湖，孙兆敏，楼乔明 (中国海洋大学 食品科学与工程学院，山东 青岛 266003) 摘要 ：采用脂肪酶催化 乙酯型鱼油和甘油酯型鱼油进行酯交换制备富含 EPA和 DHA的甘油三酯。 对脂肪酶进行 了筛选 ，并确定 了两种脂肪酶 TLIM 和 K酶用于后续研 究。应用填充床反应器作为 反应装置 ，采用正交试验对影响酯交换反应 的几个主要 因素条件进行 了优化，得到 了反应的最佳条 件为：以K酶为催化剂，反应温度4O℃，加酶量6％，反应时间18 h，底物摩尔比2．0：1．0。同时，也 得到了以TLIM酶为催化剂，获得最高含量 EPA和 DHA反应的最佳条件。 关键词 ：脂肪酶；酯交换 ；鱼油；EPA；DHA 中图分类号 ：TQ645：TQ032 文献标志码：A 文章编号：1003—7969(2011)0l一0013—04 Preparation of triglycerides rich in EPA and DHA by lipase—catalyzed transesterificati0n between triglycerides and ethyl ester LI Jinzhang，WANG Yuming，XUE Changhu，SUN Zhaomin，LOU Qiaoming (Food Science and Engineering College，Ocean University of China， Qingdao 266003，Shandong，China) Abstract：Triglycerides rich in EPA and DHA were produced by lipase—catalyzed transesterification be— tween triglycerides and ethyl ester．A variety of commercial lipases were screened，and two lipases of TLIM and K lipase were selected for subsequent study．Several important parameters of transesterification were optimized by orthogonal test in a packed bed reactor．After comparison of the results of the two enzymes， the optimum conditions were determined as follows：K lipase as a catalyst，reaction temperature 40℃ ，en— zyme dosage 6％ ，reaction time 1 8 h，molar ratio of substrates 2．0：1．0．Simultaneously，the optimum con— ditions of TLIM catalyzed transesterification for highest EPA and DHA were obtained． Key words：lipase；transesterification；fish oil；EPA；DHA n一3型长链脂肪酸对于人体的作用已经引起 了人们的共识，其对人体的营养、发育和健康等方面 起着重要作用 。市场上主要存在两种 EPA、 DHA制品，脂肪酸乙酯型 EPA、DHA含量高，但存 在吸收利用率不佳的问，天然的甘油酯型 EPA、 DHA含量较低，作为保健品和药物开发利用，纯度 不能满足人们的要求 。如何提高甘油酯中 EPA 收稿 日期 ：2010—05—26 作者简介 ：李金章(1985)，男 ，在读硕士，研究方向为食品化 学与营养支持(E—mail)lijinzhang@foxmail．con。 通信作者 ：王玉明，副教授(E—mail)wangyuming@OUC．edu． 和 DHA的含量，是人们关注的课题。 采用化学或者物理方法使 DHA或 EPA处于高 温、高压或不适当的 pH环境中，致使 DHA或 EPA 分子的部分双键氧化、全顺式构型异构化、双键移位 或双键聚合等副反应的发生，不适合现代工业生产； 或是由于能耗大、操作成本较高(制备型高效液相 色谱)，而难以满足工业化要求，因此反应条件温 和、能耗低、操作成本低的脂肪酶富集 DHA和 EPA 工艺引起了人们的重视。迄今为止，已有许多利用 酶催化法从海产鱼油或植物油中富集长链多不饱和 脂肪酸的报道，例如，酶催化水解法_- ，酶催化酸 解法 “ ，酶 催 化 醇 解 法 ，酶 催 化 酯 合 成 14 CHINA 0ILJS AND FATS 2011 Vol_36 No．1 法 ”]。本研究采用酶促乙酯型和甘油酯型酯交 换的方法，将乙酯型中的 EPA、DHA富集到甘油酯 型当中，得到高含量 EPA和 DHA的甘油三酯。 1 材料与方法 I．I 原料、试剂 爱顿酶(爱顿生物工程有限公司)，leveking黑 曲霉(绿微康生物工程有限公司)，三杰脂肪酶(三 杰生物技术有限公司)，K酶(来 自Candida cylindra． cea)，诺奥酶 (诺奥科技发展有限公 司)，TLIM、 TL100 RMIM、Novozyme 435、lipolase ultra lecitase ultra、脂肪酶2000L(诺维信公司)，lipase AY“Area— no”30G(Amano公司)。 乙酯型鱼油(含 EPA 50．23％，DHA 22．75％)、 甘油酯型鱼油(含EPA 21．57％，DHA 6．54％)均由 浙江万联药业提供。 正己烷、石油醚、乙醚等试剂均为纯。 1。2 主要仪 器 HP6890气相色谱仪，水浴恒温振荡器，IKA MS3微量振荡器，超级恒温水浴锅。 1．3 酶的筛选 取 10％的酶(以甘油酯质量为基准)加入 50 mL具塞锥形瓶中，然后按底物摩尔比为 2．0：1．0加 入定量的乙酯型鱼油和甘油酯型鱼油，充 N，，将瓶 口密封。放入已经预先平衡好温度(60cIC)的水浴 恒温振荡器中，开始计时，24 h后过滤除去酶停止 反应。反应制得的混合液经薄层层析(TLC)取甘油 酯部分甲酯化，然后气相色谱测定 EPA、DHA成分 含量。重复3次试验取平均值。取 EPA、DHA总含 量较高的酶作为后续研究用酶。 1．4 酯交换反应 由于筛选得到的酶是固定化酶，为了便于酶的 回收，采用填充床反应器进行反应。操作方法是：预 先调节好超级恒温水浴锅水浴温度，然后将定量的 酶装入反应柱(由直形冷凝管改装而成)，连接好装 置，按配比将底物混合，开启蠕动泵进行反应。当反 应液充满整个装置时，给三角瓶充 N，以驱除装置内 空气。开始计时，实时取样，取样后充 N，，密闭装 置。反应装置如图 1所示。 1．5 产物 TLC分 离 采用硅胶 G薄板，在 105 oC烘箱中活化2 h后， 置于干燥器内冷却。取约 20 mg产物点样，同时点 样标准甘油三酯作为对照。在展开缸中以石油醚～ 乙醚一乙酸(体积比82：18：1)为展开剂，上行展样。 展开后，以碘为显色剂显色，对照标准甘油三酯将产 物甘油三酯部分刮下进行甲酯化。 角瓶 图1 填充床反应装置 1．6 甲 酯 化 将刮下的甘油三酯部分与 2 mL 1％H SO 一甲 醇溶液混匀，60℃恒温水浴反应 1 h。加入 1 mL正 己烷混匀，静置，取正己烷层进行气相色谱检测。 1．7 气相色谱检测条件 HP—INNOWax 19091N一113毛细管柱(30 m× 0．32 mm×0．25 Ixm)。柱温采用程序升温方法，初始 温度 170℃，以3~C／min的速度升温至 210℃，保持 27 rain。进样口温度240℃，分流比25：l，载气为高纯 N。，流速为 28．8 mL／min，采用恒压模式，压力 60．6 kPa。检测器为火焰离子化检测器(FID)，检测器温 度250 oC，H2流速40 mL／min，空气流速450 mL／min， N2流速45 mL／min。进样量 1 txL。 2 结果与分析 2．1 不同酶对酯交换反应的影响 采用不同的酶按 1．3进行操作，考察酶对酯交 换反应的影响，结果见图2。 ＼ 噩H 加 口 + 酶种类 A．爱顿酶；B．1eveking~曲霉 ；c．三杰脂肪酶 ；D．TLIM；E．TLIO0； F．RMIM；G．Novozyme 435；H．1ipolase ultra；I．1ecitase ultra； J．诺奥酶；K．脂肪酶2000L；L．1ipase AY“Amano”30G；M．K酶。 图2 不同酶对酯交换反应的影响 由图2可见，产物中EPA、DHA总含量最高的 是K酶，为48．01％，其次为 TLIM酶，为 46．81％， 这比通常使用的Novozyme 435酶(45．35％)还高一 些，但成本却大大降低。故选定这两种酶作为后续 反应用酶。 m山 如 ∞ 如 2011年 第 36卷 第 1期 中 国 油 脂 15 2．2 正 更试验 以筛选出的酶为反应用酶，以反应时问、反应温 度、加酶量、底物摩尔比为主要影响因素，各选出 3 个水平，了四因素三水平的 L。(3 )的正交试 验，因素与水平见表 1，正交试验结果见表 2，方差分 析见表 3。 表 1 因素与水平 K酶 kl 2 R 42．75 40．87 42．26 40．37 43．O6 42．45 41．17 42．97 41．73 39．93 42．67 43．28 1．88 2．69 1．8O 3．35 注：Fo o5：19．00。 由表 2可知，K酶催化时各因素对产物 EPA、 DHA总含量的影响程度为：D>B>A>C，即底物摩 尔比对产物 EPA、DHA总含量的影响最大，其次是 加酶量，再次是反应温度，最后是反应时间。由表 3 可知，K酶催化时各因素对产物 EPA、DHA总含量 的影响不存在显著性差异。因此，生产中要想实现 产物 EPA、DHA总含量的最大化，需要严格控制 4 个因素。最佳的工艺条件为 A B：C：D。，即反应温度 40℃，加酶量 6％，反应时间 18 h，底 物摩尔 比 2．0：1．0。 由表 2可知，TLIM酶催化时各因素对产物 EPA、DHA总含量的影响程度为：B>D>C>A，即 加酶量对产物 EPA、DHA总含量的影响最大，其次 是底物摩尔比，再次是反应时间，最后是反应温度。 由表3可知，因素 B、c、D对TLIM酶催化产物EPA、 DHA总含量的影响显著，因此生产中要想实现产物 EPA、DHA总含量的最大化，需要严格控制这 3个 因素。最佳的工艺条件为 A，B c D。，即反应温度 60 cc，加 酶量 6％，反应时间 18 h，底物摩尔 比 2．0：1．0。 另外，由表2对比可知，在同样的条件下，K酶 催化的产物中 EPA、DHA总含量总是比 TLIM酶催 化所得的产物 EPA、DHA总含量高。因此，K酶催 化效果要比 TLIM酶好，K酶催化反应的最佳条件 即为本试验的最佳条件。 3 结 论 通过筛选一系列脂肪酶，确定了两种用于酯交 换法制备富含 EPA和 DHA的甘油三酯的酶，经过 正交试验和两种脂肪酶的详细比较，确定了制备富 含 EPA和 DHA的甘油三酯的最佳条件：以 K酶为 催化剂，反应温度40℃，加酶量6％，反应时间18 h， 底物摩尔比2．0：1．0；以 TLIM酶为催化剂，反应温 度 60℃，加酶量 6％，反应时间 18 h，底物摩尔比 2．0：1．0。 参考文献 ： [1]DYERBERG J，BANG H 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