地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆和及其启动子功能鉴定

!"卷 !期 #$$"年 %月 !日 微 生 物 学 报 !"#$ %&"’()&(*(+&"$ ,&-&"$ !"（!）：&’" ( &%$ !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! )*+*,- #$$" 基金项目：新世纪优秀人才支持计划（./012$!2$!3’）；国家“%"4计划”（#$$4))#!55"$） "通讯作者。167：%"2&5$2&%’3’%5；0289:7：;<=9>+? ,@-*A 6B*A C> 作者简介：牛丹丹（53%$ D），女，河南周口人，博士研究生，研究方向为工业微生物学和分子育种学。 收稿日期：#$$&25$2$%；接受日期：#$$&25#25#；修回日期：#$$"2$42$! 地衣芽孢杆菌!!淀粉酶基因的克隆和及其启动子功能鉴定 牛丹丹，徐 敏，马骏双，王正祥" （江南大学生物学院 工业生物技术教育部重点实验室 无锡 #5!$4"） 摘 要：根据已知!2淀粉酶编码基因保守区核苷酸序列，通过 E/F 和反向 E/F 技术克隆出 !"#$%%&’ %$#()*$+,-.$’ /G/GH I$#$!!2淀粉酶编码基因 "./0 全长序列及其上下游序列。! A %$#()*$+,-.$’ /G/GH I$#$! "./0 由 5&43JK组 成，其上游 5%$JK为启动子序列，下游 5"$JK为终止子序列；成熟肽由 &5#个氨基酸残基组成，氨基端的 #3个氨基酸 残基为!2淀粉酶的信号肽。通过基因及其氨基酸序列比对发现，"./0 及其编码产物与芽孢杆菌来源的!2淀粉酶 具有高度相似性。将 "./0的结构基因在 E1’介导下于大肠杆菌中诱导表达，获得具有!2淀粉酶活性的表达产物。 将 "./0 的启动子序列和信号肽序列与 ! A %$#()*$+,-.$’ /G/GH I#$$!的"2甘露聚糖酶结构基因进行读框内重组，在 大肠杆菌中获得了"2甘露聚糖酶的分泌表达，重组大肠杆菌表达 #3&LM8N的"2甘露聚糖酶酶活。 关键词：地衣芽孢杆菌；!2淀粉酶；"2甘露聚糖酶；基因克隆；启动子；信号肽 中图分类号：O’% 文献标识码：) 文章编号：$$$52"#$3（#$$"）$!2$&’"2$& !2淀粉酶（0/4P#P5P5），即!25，!2葡聚糖2!2葡聚 糖水解酶（!25，!2+7*C9>2!2+7*C9>QR@BSQ79,6），从分子 内部切开!25，!2糖苷键，使淀粉分子量迅速降低，降 解为水溶性的糊精、麦芽糖和葡萄糖。产物的末端 葡萄糖残基 /5 碳原子为!2构型。 目前，工业生产中都是以微生物发酵法大规模 生产!2淀粉酶。!2淀粉酶工业生产菌株包括：枯草 芽孢杆菌（ !"#$%%&’ ’&23$%$’）、地衣芽孢杆菌（ ! A %$#()*$+,-.$’）、嗜 热 脂 肪 芽 孢 杆 菌（ 4),2"#$%%&’ ’3)"-,3()-.,5($%&’）、凝聚芽孢杆菌（! A #,"6&%"*’）、淀 粉液化芽孢杆菌（! A "./%,%$7&)+"#$)*’）、嗜碱芽孢杆 菌（! A "%8"%,5($%$#）、米曲霉（9’5)-6$%%&’ ,-/:")）、黑曲 霉（ 9 A *$6)-）和拟内孢霉（ ;*<,./ #,5’$’+$2*%$6)-） 等［5 ( 4］。枯草芽孢杆菌!2淀粉酶（IT)）、地衣芽孢杆 菌!2淀粉酶（IN)）、嗜热脂肪芽孢杆菌!2淀粉酶 （IT-)）、解淀粉芽孢杆菌（I))）等均属于糖基水解 酶家族 54。通过氨基酸序列比对发现，!2淀粉酶至 少含有 !个保守区［!］，这些为通过定点突变等技术 改造!2淀粉酶提供了基础。533& 年前后，IN)、IT) 和 IT-)经过 U光衍射获得了晶体结构图，结果显 示，这些淀粉酶虽然与糖基水解酶家族 54的其他成 员在酶学性质上有很大差异，但结构基本相似［!］。 基于对我国 IN)生产菌种的耐高温!2淀粉酶 编码基因及其转录特征的了解，同时为分子改造 IN)以及为具有优良性质的异源!2淀粉酶基因高效 表达提供分子表达元件，本研究报道从我国 IN)生 产菌株 ! A %$#()*$+,-.$’ /G/GH I$#$!中克隆和功能 鉴定 IN)编码基因及其上下游 V.)序列。 " 和方法 "#" 材料 "#"#" 菌株和质粒：地衣芽孢杆菌（ !"#$%%&’ %$#()*$+,-.$’）/G/GH I$#$! 为我国 IN) 工业生产菌 株，由江南大学工业微生物资源和信息中心（R--K：MM C:C:82C*A ,@-* A 6B*A C>）提供。大肠杆菌（ ;’#()-$#($" #,%$）UN25、; A #,%$ WH5$3和表达宿主菌 ; A #,%$ IN#5 （V04）为本室保藏。载体 KX0H21 09,@购自 ESQ86+9 公司。载体 K01#%9购自 G>Y:-SQ+6>公司。重组质粒 K12"./0Z、K01#%92"./0.0[和 KIN2."* 及重组菌 UN2 5（K12"./0Z）、V04（K01#%92"./0.0[）和 V04（KIN2 ."*）为本研究中构建。 "#"#$ 酶和试剂：牛小肠碱性磷酸酶（/G)E）、1! V.)连接酶、各种限制性内切酶和蛋白质分子量标 准均为晶美生物工程有限公司产品；=+& V.)多聚 酶、1"7 V.)多聚酶、卡那霉素、氨苄青霉素购于上 海 T9>+Q>公司；E/F 产物纯化试剂盒、胶回收试剂 盒为上海华瞬生物技术有限公司产品；;> 1"7 V.) 多聚酶、U2+97 和 GE1X 为 19\9F9（大连）公司产品。 引物由上海 T9>+Q> 公司合成。其他试剂药品皆为 国产或进口的纯和生化试剂。 "#$ 培养基和培养条件 大肠杆菌的培养采用 NI培养基（每升含有 5$+ 胰蛋白胨、!" 酵母浸提物、!" #$%&），添加 ’(!)琼脂 即为 *+固体培养基。必要时补加终浓度为,!!"-.* 的卡那霉素（/$0）或终浓度为 12!"-.*的氨苄青霉 素（3.4）。培养在 567进行。 大肠杆菌转化用培养基包括：大肠杆菌生长培 养基为每升含有 ’2" 胰蛋白胨、!" 酵母浸提物、!" #$%&和 2(!.8&-*葡萄糖，大肠杆菌复苏培养基为每 升含有 ’2" 胰蛋白胨、!" 酵母浸提物、!" #$%& 和 2(’.8&-*蔗糖。蓝白鉴定时另加入 92!"-.* :;"$& 和 9?@。 !"# ! $ "#$%&’#()*+#, %&%&’ ()*)+染色体,-.的提取 地衣芽孢杆菌 ! A "#$%&’#()*+#, %=%=B +2,29 染 色体 C#3提取方法按文献［!］进行。 !"+ ,-.操作技术 C#3片段胶回收、>%D产物纯化用华舜试剂盒 进行。质粒 C#3提取、C#3的酶切、连接、转化等参 照文献［!］进行。C#3扩增在 2(,.* >%D薄壁管中 进行。>%D 反应条件为：E97 !.F0；E97 !2G，!17 12G，6,7 12G，5!个循环；6,7 ’2.F0。 !"/ ! $ "#$%&’#()*+#, %&%&’ ()*)+高温!0淀粉酶 编码基因的克隆 根据已报道的地衣芽孢杆菌 !<9";淀粉酶 （+*3）、枯草芽孢杆菌";淀粉酶（+H3）、嗜热脂肪芽 孢杆菌";淀粉酶（+HI3）和淀粉液化芽孢杆菌";淀粉 酶（+33）基因序列（@J0+$0K登录号分别为：:25,51、 B6E999、:!E961 和 L2’!9,），比对这些序列，分析表 明在结构基因内部存在着相当保守的序列。根据保 守序列，先设计了一对引物 $.M* >’ 和 $.M* >,，用 于 >%D扩增结构基因内部 ’(2KN片段 -+./O。再根 据片段 -+./O 的测序结果，设计引物 $.M>5 和 $.M>9，反向 >%D扩增 -+./O两端的序列。测序得到 上下游序列后，通过与片段 -+./O的序列拼接，得出 全长的淀粉酶基因序列。再根据全长基因序列，设 计了引物 +*;P>;5（Q4）和 +*$.M,，>%D扩增淀粉酶 结构基因。其中引物 +*;P>;5（Q4）与结构基因 !O端 序列互补，引物 +*$.M,与终止密码子下游 ’<2N4以 下的序列互补。两个引物的 !O端都增加了 0$)D=切 点。>%D扩增淀粉酶全长基因时，设计合成了引物 +*$.M’和 +*$.M1，上游引物 +*$.M’与启动子上游 序列互补，下游引物 +*$.M1与终止子下游 ’<,N4以 下序列互补。由此扩增出的淀粉酶全长基因 -+./ 包括了启动子和信号肽序列，两个引物的 !O端都增 加了 !-+R= 切点。各条引物序列如下：引物 $.M* >’：!O;@@3%@%?@3?@%3@?3????@33?@@;5O；引物 $.M* >,：!O;?@?@3@33?3333@%@?33@%33@%@;5O； 引物 $.M>5：!O;%%3??%3333?3%?@%3?%3@%@?%%; 5O； 引 物 $.M>9： !O;%@%??@%??3%@%????3?? %?%3%3;5O；引物 +*;P>;5（ Q4）：!O;%@@33??%%?? 33?@@@3%@%?@3?@%;5O； 引 物 +*$.M,： !O; ?3@@33??%%?3%3?%3@3?33%@??@%%;5O； 引 物 +*$.M’：!O;33?@33??%3??@@?33%?@?3?%?%3@%; 5O；引 物 +*$.M1：!O;?3@@@3?%%%?3%3?%3@3? 33%@??@%%;5O。 !"1 酶活测定 耐高温";淀粉酶酶活测定方法参照国家行业标 准 S+-?,521;E6 进行［1］。酶活单位定义为：在相应 条件下，’.F0液化可溶性淀粉 ’."成为糊精所需要 的酶量，即为 ’个酶活力单位，以 ’T表示。大肠杆 菌周质蛋白的制备，按文献［6］进行。#;甘露聚糖酶 酶活测定方法按文献［<］进行。蛋白质浓度测定：采 用 +U$VW8UV法［E］，以牛血清白蛋白 +H3作为。 !"2 3,304.56 采用 !)浓缩胶、’,)分离胶的不连续垂直板 电泳，,!.3电泳 9X。考马斯亮蓝 D;,!2染色［’2］。 !"7 发酵试验 大肠杆菌的发酵温度为 567，培养基为 *+，发 酵试验在 ,!2.* 三角瓶中进行，培养基装液量为 ,2.*。 * 结果 *"! ! $ "#$%&’#()*+#, %&%&’ ()*)+高温!0淀粉酶 编码基因的克隆 以 ! A "#$%&’#()*+#, %=%=B +2,29染色体 C#3为 模板，$.M* >’和 $.M* >,为引物，在 1-2 C#3 多聚 酶的作用下，>%D扩增出 ’(2KN大小的";淀粉酶结 构基因片段 -+./O。将此 >%D 产物直接连接到 4@PB;?;P$GM载体中，酶切验证得到了重组质粒 4?; -+./O。对重组质粒 4?;-+./O上的 -+./O片段进行 序列测定。通过测序和 C#3比对分析，我们确认了 此 >%D扩增片段为 ! A "#$%&’#()*+#, 高温";淀粉酶编 码基因片段（-+./O）。 提取 ! A "#$%&’#()*+#, %=%=B +2,29染色体 C#3， 用 3-453=进行部分酶切，得到 5 Y !KN片段。胶回 收纯化这些片段后，在 ?9 C#3 连接酶作用下让其 自身环化。以此自身环化片段为模板，$.M>5 和 $.M>9为引物，在 05 1-2 C#3 多聚酶作用下进行 >%D扩增，扩增得到了约 5(2KN的片段 -+.6。将此 片段克隆入 4@PB;?;P$GM载体上，得到了重组质粒 4?;-+.6。以 $.M>5和 $.M>9为测序引物，对重组质 粒 4?;-+.6 进行测序和序列拼接，得到了 ! A 66!牛丹丹等：地衣芽孢杆菌";淀粉酶基因的克隆和及其启动子功能鉴定 A -微生物学报（,221）91（9） !"#$%&"’()*"+ !"!"# $%&%’高温!(淀粉酶编码基因的 全序列及其上下游序列。再以 $)*+,-和 $)*+,.为 引物，以 , / !"#$%&"’()*"+ !"!"# $%&%’ 染色体 012 为模板，在 -’. 012聚合酶的作用下，3!4 扩增出 , / !"#$%&"’()*"+ !"!"# $%&%’ 高温!(淀粉酶全长编 码基因 /*01 及其上下游序列。所得 3!4产物送测 序公司进行序列测定。由此获得，, / !"#$%&"’()*"+ !"!"# $%&%’ 高温 !(淀粉酶的编码基因序列 （-56789）及其上游启动子序列长 -:%89和下游终止 子序列为 -.%89。与已报道的地衣芽孢杆菌 5:’!( 淀粉酶编码基因的上游序列比对发现，基因 /*01 的启动子(.’碱基发生改变（;!!）。所克隆的基因 在 ;<=$*=>的登录号为 0?’%@&..。 !"! ! # "#$%&’#()*+#, $%$%& ’(!()高温!*淀粉酶 与其它微生物!*淀粉酶之间的进化关系 , / !"#$%&"’()*"+ !"!"# $%&%’和 5:’淀粉酶的氨 基酸序列比较发现，有 77A’B的氨基酸是等同的， 其中有 6 个氨基酸残基不同，分别是 -.6 位的 2CD （5:’）变成了 )8 不 :@5 1"S 0*=(T*= %2 /! / U3#2/ 4"#)(5"(!(6"#/ 7"&"#/（&%%.）’.（’） 带信号肽序列的 ! ! "#$%&’#()*+#, "#"#$ %&’&( 耐高 温!)淀粉酶结构基因及其下游终止序列 -+./*+,。 然后用 0$)-# 单酶切质粒 .+/’01，用碱性磷酸酶 "#23对线性质粒去磷酸化。在 /( 4*2连接酶作用 下，与同样用 0$)-#单酶切过的 -+./*+,连接，最后 转化感受态 0 ! $)"# %5’6（4+7）。在含有卡那霉素 的 5%平板上筛选阳性转化子。用 1-"#酶切重组质 粒，选择出正向连接的重组质粒 .+/’01)-+./*+,，高 温!)淀粉酶结构基因 -+./*+,在 328控制下表达。 将含有重组质粒 .+/’01)-+./*+,的 0 ! $)"# %5’6（4+7）转化子［4+7（.+/’01)-+./*+,）］用 5%培 养基培养至 349&& : &;0左右，添加 6<<=>?5 #3/@，继 续培养 9A 后，离心收集菌体，以磷酸盐缓冲液（.B 9;&）洗涤悬浮，超声波细胞破碎仪破壁，再进行酶活 测定。结果表明，经 #3/@诱导的重组转化子的细胞 破碎液有高温!)淀粉酶活性，其活力为 67;CD?<5培 养液，而对照细胞的破碎液无高温!)淀粉酶活性。 我们同时也分别测定了培养液中的酶活，结果表明 培养上清液均没有酶活。 细胞用超声波破碎后，取 ’&"5细胞破碎液，加 入 C"5 C E样品缓冲液，于 6&&F煮沸 9M =O I4I)32@+ =O PAM NMQ=1TM! $! $=>MQW>1N XMGLAP <1NJMN；6; 0 ! $)"#（ A1NR=NGHL .+/’01)-+./5+,） GHUWQMU RV #3/@；’; 0 ! $)"# （A1NR=NGHL .+/’01)-+./5+,）XGPA=WP GHUWQPG=H；7; 0 ! $)"#（A1NR=NGHL .+/’01）1T 1 Q=HPN=> ! 2NN=X GHUGQ1PMU 1 NMQ=1TM XGPA <=>MQW>1N XMGLAP =O CCJ41! !)* 地衣芽孢杆菌!"淀粉酶基因的启动子和信号 肽序列在 ! + "#$% 中具有功能 ! 马骏双 ! 饲料用#)甘露聚糖酶和内切#)6，7)葡聚糖酶的研究 ! 无锡：江南大学硕士学位论文，’&&C; 将地衣芽孢杆菌 "#"#$ %’&&(#)甘露聚糖酶基 因 +-’!克隆到地衣芽孢杆菌!)淀粉酶基因的启动 子 3-+./和信号肽序列 I-+./的下游，在其控制下表达 6’A（图 7）。离心收集菌体，细胞破碎后测定酶活。 重组菌表达#)甘露聚糖酶的活性为 ’YCD?<5 发酵 液。相似地，分离重组大肠杆菌周质蛋白，同上测定 #)甘露聚糖酶酶活，重组菌周质中的#)甘露聚糖酶 的活性为 ’&CD?<5 发酵液，约占总表达量的 9Y;CZ。表明地衣芽孢杆菌!)淀粉酶的信号肽在大 肠杆菌中具有引导蛋白质分泌的能力。 图 , 在 %&’()和 #&’()控制下重组大肠杆菌表达""甘露聚 糖酶的 #$#"%&’(分析 KGL!7 /AM .N=OG>M =O I4I)32@+ =O PAM NMQ= =O 3-+./ 1HU I-+./ ! $! $=>MQW>1N XMGLAP <1NJMN；6; 0 ! $)"# 4+7 1T 1 Q=HPN=>；’; 0 ! $)"# 4+7（.%5)+-’）! 2NN=X GHUGQ1PMU 1 NMQ=MQW>1N XMGLAP =O (&J41! , 讨论 对于一个工业生产菌株而言，清楚地了解其产 物的相关分子生物学信息，对提高产物性能和实际 生产都有积极的现实意义。我们通过分子生物学手 段，克隆了高温!)淀粉酶生产菌株 ! ! "#$%&’#()*+#, "#"#$ %&’&(的高温!)淀粉酶基因 -+./，并在大肠 杆菌中实现了异源活性表达。通过与已克隆的多种 微生物的!)淀粉酶氨基酸序列进行比对，发现芽孢 杆菌属来源的!)淀粉酶在氨基酸序列组成上具有高 度相似性［66］。 以克隆和序列测定获得的 ! ! "#$%&’#()*+#, "#"#$ %&’&(高温!)淀粉酶基因上下游序列为基础， 通过对地衣芽孢杆菌 "#"#$ %’&&(的#)甘露聚糖酶 编码基因!以及其它基因，如嗜碱芽孢杆菌甘露聚 糖酶编码基因，巨大芽孢杆菌乳糖酶编码基因等（未 发表数据）在大肠杆菌中的表达，证实了 ! ! "#$%&’#()*+#, "#"#$ %&’&(高温!)淀粉酶基因的启动 子在大肠杆菌中具有引导异源基因表达的功能［6’］， 其信号肽在大肠杆菌中具有引导基因产物分泌到周 质空间的能力。 研究中还发现，本研究克隆到的!)淀粉酶基因 Y8C牛丹丹等：地衣芽孢杆菌!)淀粉酶基因的克隆和及其启动子功能鉴定 ! ?微生物学报（’&&9）(9（(） 与已报道的 ! ! "#$%&’#()*+#, "#$淀粉酶基因［%&］存在 一定的差异，反映在氨基酸残基水平上，出现 &个氨 基酸残基的改变。我们在实验中反复验证了此一突 变非经基因克隆过程中产生。&个氨基酸残基的改 变对 ! ! "#$%&’#()*+#, ’(’() *+,+$产高温!-淀粉酶 的水平及其酶学性质的影响是我们下一步研究的内 容之一。 参 考 文 献 ［ %］ ./01 )，2/34554 6，780089 :! ;<=38>?4@8 A8B<80=8 >C ?D8 /EF3/A8 1808 C9>E !-$#""., ,./0#"#, ! 1.$"&#$ 2$#3, 4&,，%G#&，!!：,&H I ,$GJ ［ ,］ K84?D *，7895L891 ’，M?8=N83 M， &0 -" ! OD8 =>EP38?8 180>E8 A8B<80=8 >C !-$#""., "#$%&’#()*+#, :M)%&，/0 >91/04AE Q4?D 198/? 40@?80?4/3 ! 5 6)" 6#$*)/#)" !#)0&$%’)"，,++$，"：,+$ I ,%%J ［ &］ *89?>3@> ’， 60?9/04N4/0 2! M?/9=D-DF@9>3F5401 805FE8A C9>E ?D89E>PD434= /9=D/8/ /0@ L/=?894/! 7.** 89#’#)’ 7%&+ !#)，,++,， #：%"% I %R+J ［ $］ ;483A80 ST， *>9=D89? OK! U9>?840 80140889401 >C L/=?894/3 !- /EF3/A8! !#)$%#+ !#)9%: 2$0-，,+++，!$%&：,"& I ,H$J ［ "］ M/EL9>>N S， V94?A=D T， )/04/?4A O! )>38=<3/9 ’3>0401： / W/L>9/?>9F )/09N： ’>3@ MP9401 7/9L>9 W/L>9/?>9F U98AA，%G#GJ ［ R］ 姜锡瑞编著 ! 酶制剂应用手册 ! 北京：中国轻工业出版社， %GGG，&& I &$J ［ H］ S/=>L4 6，70 >C /33 =D/918@ 98A4@<8A 40 ?D8 Y4=404?F >C ?D8 /=?4Y8-A4?8 D834Z >C ?D8 @4A<3C4@8 >Z4@>98@<=?/A8 :AL6! 5 !#)" 7%&+，%GGH，’"’：,%RG, I ,%RGGJ ［ #］ O/3L>? 2， MF10 /0@ =D/9/=?8945/?4>0 >C ?D89E>A?/L38 "-E/00/0/A8 /0@ !-1/3/=?>A4@/A8 C9>E !-$#""., ,0&-*)0%&*+)9%#"., ! 299" ;’<#*)’ 6#$*)/#)"，%GG+，$#：&"+" I &"%+J ［ G］ *9/@C>9@ ))! 6 9/P4@ /0@ A80A4?4Y8 E8?D>@ C>9 ?D8 B0 >C E4=9>19/E BC P9>?840A C P9>?840-@F8 L40@401! 2’-" !#)$%&+，%GHR，"’：,$# I ,"$J ［%+］ 诸葛健，王正祥编著 ! 工业微生物实验技术手册 ! 北京：中 国轻工业出版社，%GG$J ［%%］ S/08=8N M，MY80AA>0 *，)/=2981>9 T6! 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