人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子cDNA的克隆及鉴定

[基金项目] 广东省科技基金资助项目( 2003c31211) [作者简介] 李敏雄( 1965- ) ,男,副主任医师,主要从事耳鼻咽喉临床与科研教学工作。E-mail: lmx3@tom. com; lmx30000@ 21cn. com 文章编号: 1673- 3770( 2006) 02- 0105- 03 �论 � 著� 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 cDNA 的克隆及鉴定 李敏雄1 , 陈盛强2, 刘启才3 , 张建国1 (广州医学院 1. 第二附属医院耳鼻咽喉科; 2. 神经科学研究所; 3. 实验医学中心,广东 广州 510260) � � [摘要] � 目的: 克隆人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子全长 cDNA 以构建相应腺病毒达载体。方 法:根据人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因序列设计合成可扩增人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 cD- NA的特异性引物,用 RT-PCR法从骨髓细胞总 RNA 中扩增人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 cDNA, 并克 隆至 pGEM-T 载体中,经酶切鉴定后再行序列分析。结果:逆转录多聚酶链反应扩增产物长度与预期的 456 bp一致; 用M13正、反向引物行荧光测序,证实克隆出的序列与 GenBank的人粒细胞巨噬细胞集落刺 激因子 cDNA序列完全一致; 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子全长 cDNA 被成功地插入到质粒 pGEM-T 中。结论:克隆人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子全长 cDNA为构建相应腺病毒表达载体及应用 B7-1行肿 瘤免疫基因治疗提供了可能性。 [关键词] � 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子;基因; 克隆, 分子 [中图分类号] � Q785 � � [文献标识码] � A Cloning and identification of human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor cDNA LI Min-xiong 1 , CHEN Sheng-qiang 2 , LIU Q-i cai 3 , ZHANG Jian-guo 1 ( 1. Department of Otorhinolaryngology; 2. Institute of Neurosciences; 3. Experimental Medical Research Center, Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510260, Guangdong, China) [ABSTRACT] � Objective: To construct recombinant granulocyte-macrophage colony-st imulat ing factor ( GM- CSF) retrovirus expressing vector by cloning of GM-CSF genes from human blood and construct the recombinant plas- mids encoding for GM-CSF. Methods: Primers for GM-CSF were designed and synthesized according to the sequenc- es of human GM-CSF genes derived from GenBank. The full length cDNA of GM-CSF was cloned by RT-PCR tech- niques. The recombinant plasmids pGEM-T-GM-CSF were constructed by recombinant gene techniques. Results: The length of RT-PCR product coincided with that of authors� anticipation( 456bp) , and the recombinant plasmid was con- firmed by Xba� �Not � restriction enzyme digesting. The sequencing result of the cDNA was identical to the se- quence of GM-CSF cDNA in GenBank, and the full length cDNA of human GM-CSF was successfully inserted into the vector of pGEM-T. Conclusion: The successful cloning of human GM-CSF cDNA, as well as construction of its ret- rovirus expressing vector enables us to further investigate the role of GM-CSF in tumor immunogene therapy. [KEY WORDS] � Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; Genes; Cloning, molecular 第 20卷第 2期 2006年 4月 � � � � 山 东 大 学 耳 鼻 喉 眼 学 报 J OTOLARYNGOL OPHTHAL SHANDONG UNIV � � � � Vol. 20 No. 2 Apr. 2006 � � 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子( granulocyte- macrophage colony-st imulating factor, GM-CSF) 是一 个具有多项潜能的造血生长因子, 已成功地用于 治疗恶性肿瘤放、化疗后所致的白细胞减少症,肾 髓移植、再生障碍性贫血等。近年研究发现, GM- CSF 在肿瘤免疫治疗中能促进巨噬细胞、树突状细 胞等对肿瘤抗原的提呈作用。它可诱导抗原提呈 细胞共刺激分子 B7的表达,加强免疫细胞对肿瘤 抗原的识别,促进T 细胞的增殖及杀伤能力, 增强 机体的抗肿瘤免疫功能[ 1]。动物实验表明, GM- CSF 基因转移可使肿瘤细胞表达 MHC-1和 B7-1 明显增强, 瘤体内有大量的树突状细胞和 CD8+ T 细胞浸润, 具有显著的抗肿瘤作用。我们尝试将 B7-1及GM-CSF 基因用于免疫基因治疗,采用逆转 录多聚酶链反应技术从人类骨髓细胞中扩增出人 GM-CSF全长 cDNA, 并行序列分析, 以构建相应的 腺病毒表达载体, 为深入研究 GM-CS 免疫基因治 疗人类肿瘤提供了可能。 1 � 材料与方法 1. 1 � 材料 � 总 RNA提取试剂盒、RPMI-1640 细胞 培养基 ( GIBCO�BRL 公司) ; AMV 反转录酶、Taq DNA聚合酶、PCR DNA 回收试剂盒、pGEM-T 载体 和质粒提取试剂盒( Promega公司) ;各种 DNA限制 性内切酶, T4DNA 连接酶( Takara 公司) ;其他常规 化学试剂为进口或国产分析纯; E. coli DH5 为本 室保存菌种;引物由赛百盛美生物工程公司合成; PCR扩增仪为PE-9600。 1. 2 � 总RNA的提取 � 收集人1 � 105 骨髓细胞置入 1. 5ml Eppendorf (EP)管,用预冷灭菌的 PBS洗涤沉 淀,加入 1 ml TRIzol 试剂, 室温放置 5 min, 加入 200�l氯仿,强烈震荡混匀 15 s,室温放置 2~ 3 min 后, 12 000 g, 4 � 离心15min,小心吸取上层水样,转 入新EP管,加500 �l异丙醇混匀, 室温沉淀10min, 12 000 g, 4 � 离心10min,弃上清, RNA沉附于管壁� 管底,用75%乙醇洗沉淀一次,风干 5~ 10min,用适 量无核糖核酸酶(RNase)水溶解, - 70 � 保存。 1. 3 � RT- PCR � 以提取的总 RNA为模板,用 GM- CSF 的特异性引物反转录 PCR。cDNA第一链合成 反应体系为25 �l, 包括 5 � AMV reverse transcription react ion buffer 5 �l, 10mmol�L dNTP mixture 2. 5�l, oligo dT 1 �l, 总 RNA 2 ug, 混匀, 置 70 � 5 min, 并 立即冰浴 10 min, 再加入 AMV 反转录酶 30 U 和 RNase抑制剂 40U, 并用无 RNase 水补足至25�l, 混匀后 PCR 仪上 42 � 反应 60 min, 95 � 反应 10 min。PCR反应体系 5 0 �l, 包括 10 � buffer 5�l, 5�M P1+ P2 4�1, cDNA 第一链的合成产物 3 �l, 25 mmol�L MgCl2 4 �l, Taq DNA 聚合酶 1 �l, 2. 5mmol�L dNTP mixture 4 �l, 加水补足至 50 �l。 PCR反应程序:先 94 � 4 min, 然后 94 � 1 min � 50 � 2min� 72 � 2min, 共 30个循环,最后72 � 延伸 8min。 1. 4 � 构建测序载体 � PCR产物琼脂糖凝胶电泳, 用PCR产物纯化试剂盒回收PCR产物,即 GM-CSF cDNA,用 PCR产物纯化试剂盒去除酶切产物中的 寡核苷酸。pGEM-T 与 GM-CSF cDNA在 16 � 行连 接反应。连接产物转化感受态E. coli DH 5a,然后 涂抹于含氨苄青霉素、X-gal, IPTG 的 LB 琼脂平 板, 37 � 培养 16 h。挑取白色菌斑, 用单管法重组 质粒筛选系统快速提取质粒。用 Xba �和 Not�双 酶切提取的质粒, 1%琼脂糖凝胶电泳判断酶切产 物大小,鉴定出含 pGEM-T-GM-CSF 的阳性转化子。 1. 5 � 测序 � 用 377 ABI PRISM测序仪(美国 PE 公 司)行变性凝胶电泳, 分析 DNA 序列。序列正确 (与 GenBank比较)的克隆用于构建后续的载体。 2 � 结 � 果 2. 1 � 扩增 GM-CSF 的引物设计 � 证实人 GM-CSF- cDNA序列中没有Xba �和Not�识别酶切位点, 为 了便于克隆 GM-CSF 以及进一步与腺病毒基因构 建成重组 B7-腺病毒载体, 根据 GM-CSF 的全长基 因序列[ 4] 设计合成了引物。上游引物为 5�-GCC TCTAGA ATGTCGAATAACG CTT-3�, 下游引物为 5�-TCC GCGGCCGC TCAACGTTTCTAATCAT-3�。预 期所扩增的 465 bp片段为人 GM-CSF cDNA。该引 物有以下特点, ( 1) GM -CSF 上、下游引物分别引 入Xba 1和Not 1酶切位点, 使重组操作简单易行; ( 2)在上述酶切位点前分别设置 3个保护碱基以 保证酶切效率; ( 3)上、下游引物的 5�端各含有起 始密码子ATG 和终止密码子 TAA, 按阅读框架翻 译扩增的片段。 2. 2 � GM-CSF 重组质粒的构建和序列分析 � 106�� 山 东 大 学 耳 鼻 喉 眼 学 报 20卷 2期 2. 2. 1 � 提取总 RNA � 从骨髓细胞组织提取的总 RNA可看到明显的 28SrRNA、18SrRNA、5SrRNA 3 条带(图 1)。 图 1 � 总 RNA 的琼脂糖凝胶电泳 2. 2. 2 � RT-PCR � 以骨髓细胞组织总 RNA 为模 板, 行RT-PCR分析, PCR产物经琼脂糖凝胶电泳 可见有约 465 bp特异性条带,与理论值一致(图2)。 图 2� GM-CSF 的 RT-PCR电泳分析 M: DL2000 DNA Marker; 1、2: GM-CSF 2. 2. 3 � PGEM-T-GM-CSF 的酶切鉴定与测序分析 � PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、回收、纯化后克隆 至 pGEM-T 载体, 蓝白斑筛选阳性克隆, 分别用 Xba �和 Not � 酶切鉴定 pGEMT-GM-CSF , 并以 GM-CSF 平板上的蓝斑( pGEM-T 空载体)酶切作对 照,证实 465 bp的人 GM-CSF 片段存在(图 3)。 图 3� pGEMT- GM-CSF 重组质粒的酶切鉴定 M: DNAMarker( DL2000: 2000, 1000, 750, 500, 250, 100) ; 1: pGEMT- GM-CSF�Xba�; 2: pGEMT- GM-CSF�Xba�+ Not�; 3: pGEMT- GM-CSF�Not�; 4: pGEM-T空载体�Not� 2. 2. 4 � 序列分析结果 � 所扩增的 GM-CSF 与文献 完全一致(图 4)。 图 4 � 克隆的 GM-CSF 基因的测序 3 � 讨 � 论 细胞因子基因免疫是目前肿瘤基因治疗研究 的热点。将具有抗肿瘤作用的细胞因子基因导入 宿主体内,并使之稳定有效地表达, 使体内持续存 在一定水平的内源性细胞因子以发挥抗肿瘤作 用。GM-CSF 是一种重要的免疫调节分子,目前正 用于恶性肿瘤的临床实验研究。GM-CSF 在肿瘤 疫苗和细胞疫苗研究中已初显成效, 它不仅可诱 导在T 细胞免疫反应中起关键作用的 DC 细胞成 熟、分化,而且在免疫治疗过程中可增强主要和次 要的抗体反应,以促进 DC 等APC分化、成熟和活 化及上调 CD86表达水平, 增强中性粒细胞、单核 巨噬细胞、酸性粒细胞对肿瘤细胞的吞噬作用和 ADCC效应等活性,促进 Th、Tc、NK在肿瘤部位浸 润, 抑制肿瘤细胞生长 [ 2, 3]。 我们构建重组质粒 pGM-CSF, 旨在进一步研 究其抗肿瘤作用。本研究结果为临床应用 GM- CSF 基因治疗肿瘤提供了一定的实验依据。在 PCR扩增GM-CSF 基因全长 cDNA时, 根据 PCR引 物 5�端加上修饰碱基而不影响扩增产物特异性特 点在上游、下游引物 5�端加上限制性内切酶位点 并在酶切位点的 5�端加上数个保护碱基。从而通 过限制性内切酶的作用, PCR 产物两端产生了不 同的黏性末端,有利于后续的定向连接 [4] 。 用 PCR技术筛选阳性转化菌落时, 上游引物 为扩增GM-CSF 基因的上游引物,下游引物则互补 于载体紧靠多克隆位点处载体序列的反向互补序 列。这样, 只有目的基因与载体发生预定方向的 连接时, 才能通过 PCR技术扩增 (下转第 123页) 李敏雄,等.人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 cDNA的克隆及鉴定 107�� � 我们发现 CD34标记的鼻息肉血管内皮细胞 在流式细胞术的直方图上显示出一个不同于对照 的独立的阳性峰, 而在激素治疗组中只出现整体 漂移峰,并且息肉组 CD34+ 细胞百分率[ ( 18. 84 � 8. 26) %] 和平均荧光强度[ ( 1. 69 � 1. 44) D]均高 于激素治疗组, 差异有统计学意义。这也同免疫 组化 CD34表达的结果一致, 并呈相关性, 有统计 学意义,表明糖皮质激素对鼻息肉中 CD34的表达 有下调作用, 证实流式细胞术可作为一种定量研 究息肉内血管生成的方法, 准确、客观地量化鼻息 肉中血管生成情况, 这也为了解鼻息肉生物学特 性提供了较准确的信息和检测指标, 并有更好的 可比性,为预测其预后和可能的抗血管形成治疗 提供了可靠的依据。 [参考文献] [ 1] � Norlander, Westrin KM , Fukami M , et al. 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[ 12] � 吴维光,赵燕, 张积仁. 流式细胞术在实体肿瘤临床 中的应用[ J] . 国外医学肿瘤学分册, 2000, 27( 6) : 347-349. [收稿日期 2006-03-20� 修回日期 2006-03-30] (编辑:孙瑶) (上接第 107页) 出DNA产物。用此法直接对少许菌落行 PCR扩 增,可以在数小时内从众多菌斑中筛选出需要的 重组体,方法简单、可靠。成功克隆人 GM-CSF 全 长 cDNA及构建相应腺病毒表达载体,有利于今后 用GM-CSF基因行人类基因免疫治疗的研究。 [参考文献] [ 1] � Rucf G, Coleman DL. GM-SF pleiotropic cytosine with po- tential clinical usefulness[ J] . Rve Infect Dis, 1990, 12 ( 1) : 41-62. [ 2] � Yn JS, Burwick JA, Dranoff C, et al. Gene therapy for metastatic brain tumors bp vaccination with granulocyte- macrophage colony- stimulating factor transduced tumor cellcs[ J] . Hum gene Ther, 1997, 8( 9) : 1065-1072. [ 3] � 鞠佃文, 曹雪涛, 王宝梅, 等. CD 自体基因联合 GM- CSF基因治疗的抗肿瘤作用及免疫机理[ J] . 中华微 生物学和免疫学杂志, 1999, 19( 2) : 148-151. [ 4] � 林万明,杨瑞馥, 黄尚志,等. PCR技术操作和应用指 南[ M] . 北京:人民军医出版社, 1995. 106-113. (收稿日期 2005-12-12� 修回日期 2006-02-21) (编辑:孙瑶) 姚 � 利,等.鼻息肉组织中血管内皮细胞的定量研究 123�� �