第14章 急性毒性试验

nullnull** 第十四章 急性毒性试验 Acute toxicity test 第一节 概念和意义**第一节 概念和意义一、基本概念 急性毒性：指24小时内单次或多次大剂量给予某药物所出现的有害作用，亦即指机体（人或实验动物）一次性大剂量接受某种药物后所产生的快速而剧烈的中毒反应， 包括一般行为和外观改变、大体改变以及死亡效应。 急性毒性试验：以观察急性毒性为目的而的一种毒理学试验，急性毒性试验以阐明药物的剂量-毒效关系为出发点，为全面毒性试验打下基础。第一节 概念和意义**第一节 概念和意义急性毒性试验的内容 定性—毒性反应的类型、出现和消失时间、可能的靶器官和死亡原因等； 定量—致死量、最大给药量、半数致死量等。 急性毒性试验的目的和意义 测定药物的LD50及相关参数，初步估计该药物的毒性大小； 观察药物的急性中毒症状，推测药物毒性靶器官 为长期毒性试验和特殊毒性试验提供剂量设计参考一、基本概念第一节 概念和意义** 急性毒性试验是临床前新药安全性评价的第 一步，与其它毒性试验相比具有简单、经济、易 行等特点。因此新药研究开发时往往通过该项试 验，尽可能多的了解一些新药的毒理学特点，为 早期判断侯选新药是否具有研究开发价值提供毒 性强度。第一节 概念和意义第一节 概念和意义**第一节 概念和意义急性毒性试验试验结果体现了药理学与毒理学最基本的要素 — 剂量的增加常伴随着反应程度（或死亡率）的增加，如以药物剂量对死亡率作图，则可以得到剂量-反应（死亡率）关系曲线。 常见的剂量-反应关系曲线有三种形式： S形曲线 抛物线 直线二、 LD50 测定的意义及统计学原理**二、 LD50 测定的意义及统计学原理LD50的概念 能引起一群实验动物50%死亡所需的剂量, 或者说是某药物于一次性给予一群动物后预期引起50%死亡的、经统计学演算得出的一个剂量，是一个有置信限估计的中介值, 是反映药物毒效应的上限指标。第一节 概念和意义二、 LD50 测定的意义及统计学原理**二、 LD50 测定的意义及统计学原理LD50 值的作用及意义 LD50 是药物的重要特征性参数之一，是药物及一切与人类接触物质的安全标尺，用来判断药物对机体的毒性程度。 有助于计算其它与LD50相关的毒性参数。 急性毒性作用带（Zac）；治疗指数（LD50/ED50）；安全指数（LD5/ED5）；可靠安全系数（LD1/ED1）；第一节 概念和意义null 1.急性毒作用带：以药物的半数致死量与急性毒性 最小有作用剂量(阈剂量)的比值来表示（是药物毒性上 限指标与下限指标的比值）。(1) 急性毒作用带 急性毒作用带的大小反应了急性阈剂量与 LD50 距离的宽窄，其比值越大，说明从急性阈剂量到死亡剂量的距离越宽，药物引起死亡的危险性就越小；比值越小，则引起死亡的危险性就越大 。null 治疗指数（Therapeutic index,TI）是指半数致死 量与半数有效量之比值。（2）治疗指数 TI 值越大 , 表示该药物在发挥其治疗作用时 所承担的风险（危险性）越小 , 一般认为 TI 大于3 的药物才可能具有实用意义。目前用于临床的药物 , 其 TI 值大多大于10。null 安全指数（Safety index，SI）是指基本无害量与基本有效量之比值。（2）安全指数 SI 值可以说明药物的临床安全性，但该值往往难以精确计算出来，测定误差很大。null** 可靠安全系数（Certain safety factor，CSF）是指肯定无害量与肯定有效量之比值。（2）可靠安全系数 CSF 值可以说明药物的临床安全性，CSF越大，越安全。二、 LD50 测定的意义及统计学原理**二、 LD50 测定的意义及统计学原理LD50 值的作用及意义 LD50 是药物的重要特征性参数之一，是药物及一切与人类接触物质的安全标尺，用来判断药物对机体的毒性程度。 有助于计算其它与LD50相关的毒性参数 药物急性毒性分级依据第一节 概念和意义null二、 LD50 测定的意义及统计学原理**二、 LD50 测定的意义及统计学原理LD50 值的作用及意义 LD50 是药物的重要特征性参数之一，是药物及一切与人类接触物质的安全标尺，用来判断药物对机体的毒性程度。 有助于计算其它与LD50相关的毒性参数 药物急性毒性分级依据 为毒效应的靶器官确定和机制分析提供线索第一节 概念和意义二、 LD50 测定的意义及统计学原理**二、 LD50 测定的意义及统计学原理LD50 值的作用及意义 LD50 是药物的重要特征性参数，是药物及一切与人类接触物质的安全标尺，用来判断药物对机体的毒性程度 有助于计算其它与LD50相关的毒性参数 药物急性毒性分级依据 为毒效应的靶器官确定和机制分析提供线索 作为药物生产过程中的质量监控检测措施第一节 概念和意义二、 LD50 测定的意义及统计学原理**二、 LD50 测定的意义及统计学原理对 LD50 及相关参数的评价 LD50 绝非判断药物急性毒性作用的惟一指标，仅是一个为描述某一药物在某个特殊的群体中以致死反应为指标而设计的一个统计学术语，是许多反映药物急性毒性的参数之一。 急性毒性作用具有比 LD50更为深刻的内涵，剂量-效应（死亡）曲线的斜率在评价药物的急性毒性中比 LD50 更有价值甚至更为关键。第一节 概念和意义null**反应是指药物与机体接触后引起的生物学改变。 量反应属于计量资料，有强度和性质的差别，可以某种测量数值表示，如药物引起血中谷丙转氨酶的升高，这类效应称为量反应。 质反应属于计数资料，没有强度的差别，不能以具体的数值表示，而只能以“阴性或阳性”、“有或无”来表示，如死亡或存活、患病或未患病等。质反应与量反应？null**致死性反应是一个质反应过程 累积反应的几率与剂量呈双曲线函数（S形曲线）关系。对数剂量-反应曲线的斜率揭示了剂量变化与致死反应之间的关系，这种关系在安全性评价中有时比LD50 更为重要，因为它可提供更为深入的内在毒性特征，有时还能引出毒性作用机制的线索。累积反应的几率与剂量的对数及群体差呈线性关系。null 例如 , 一个很陡的斜率（斜率大，线A）表明毒性反应性 质较严重 , 毒性作用出现得迅速或吸收速率较大 ; 反之较平坦 的量—效曲线（斜率小，线B）则反应了安全范围较大。图14-1 不同药物毒效应量-效关系比较null**图14-1 不同药物毒效应量-效关系比较 依据斜率，常可将反应外推至低剂量范围，求算 出 LD1、 LD10，甚至推测出不能观察到的效应水平。null**图14-1 不同药物毒效应量-效关系比较斜率的大小在比较同系列化合物时显得更为重要， 两个药物可能有一个完全相同或相近的 LD50值，但斜率却可以不同，因此，在相同的剂量范围内，表现出不同的毒理学特征 具平行量-效曲线的两药尽管LD50不同，但却可能表现出相近的毒性作用机制、药动学特征和相似的预后 无论是LD50还是斜率都不能绝对地揭示出某一特殊的毒性作用机制 二、 LD50 测定的意义及统计学原理**二、 LD50 测定的意义及统计学原理对 LD50 及相关参数的评价 TI值仅适用于比较治疗效应和致死效应的量-效曲线相互平行的药物，对于二种效应的量-效曲线斜率不同的药物，还应适当参考ED95与LD5及ED99与LD1之间的距离。 安全指数（SI） 可靠安全系数（CSF）第一节 概念和意义null** CSF与TI并不平行，在评价A、B两药时，从治疗指数来看A药（4）优于B药（2.6）。但从可靠安全系数来看B药 CSF （1.33）大于A药（0.7）。图14-2 致死量、有效量与药物安全性评价的关系二、 LD50 测定的意义及统计学原理**二、 LD50 测定的意义及统计学原理对 LD50 及相关参数的评价 —— LD50 的测定存在明显的不足 动物消耗量大,获得的信息有限 影响LD50值的因素较多，比如试验动物的种类、品系、年龄、性别、健康状况等,因而不同实验室之间所得的数值也很难相似 从安全性评价角度来讲，需要的不是精确的LD50值，而是更多的毒性信息第一节 概念和意义（三）LD50值计算的统计学原理**（三）LD50值计算的统计学原理致死性反应是一种质反应过程，其量-效关系应符合以下规律1. 剂量对数值与死亡率之间呈常态分布曲线关系 在一个群体中特别敏感的动物总是比较少的，特别不敏感的动物也较少，而多数动物处于中等敏感状态，即符合“两头少,中间多”的规律。如以剂量为横坐标，死亡率为纵坐标，则可绘出一个偏态曲线。小剂量下毒效应差别较明显，在大剂量一端，毒效应差别随剂量的增加而减小，形成拖尾现象。 剂量-死亡率的偏态分布曲线第一节 概念和意义（三）LD50值计算的统计学原理**（三）LD50值计算的统计学原理致死性反应是一种质反应过程，其量-效关系应符合以下规律1. 剂量对数值与死亡率之间呈常态分布曲线关系 将横坐标改为对数剂量，亦即将横坐标改为等比数列，则就由偏态曲线转化为对称的常态曲线。第一节 概念和意义（三）LD50值计算的统计学原理**（三）LD50值计算的统计学原理 致死性反应是一种质反应过程 , 其量一效关系 应符合以下规律 :1. 剂量对数值与死亡率之间呈常态分布曲线关系 2. 剂量对数值与累积死亡率之间呈 S 形曲线关系 null▲ 由常态分布曲线累积而来,当剂量被转换为对数值(X)后，反应几率(P)与X遵循常态分布。▲ 该S形曲线是向心对称的，对称中心的纵坐标为50% 死亡率，横坐标为1ogLD50。▲ 曲线两端平坦，中间较斜。当剂量有变化时LD50附近的死亡率变化很大，两端（LD5或 LD95附近）则变化很小。null以 LD50来表示致死性毒效应比LD5、LD95更为灵敏精确； LD50的误差远小于LD5或LD95； 曲线中段死亡率在50%附近的点比5%或95%附近的点更为重要，更能代表大多数动物的反应水平，提示我们在设计剂量分组时必须格外重视引起 50% 死亡效应的剂量组及其邻近的剂量组。 null▲ 由常态分布曲线累积而来,当剂量被转换为对数值(X)后，反应几率(P)与X遵循常态分布。▲ 该S形曲线是向心对称的，对称中心的纵坐标为50% 死亡率，横坐标为1ogLD50。▲ 曲线两端平坦，中间较斜。当剂量有变化时LD50附近的死亡率变化很大，两端（LD5或 LD95附近）则变化很小。▲ Bliss根据常态累积曲线的特点列出了死亡率各点的“权重系数”作为权衡各点重要性的定量数值。null▲ 由常态分布曲线累积而来,当剂量被转换为对数值(X)后，反应几率(P)与X遵循常态分布。▲ 该S形曲线是向心对称的，对称中心的纵坐标为50% 死亡率，横坐标为1ogLD50。▲ 曲线两端平坦，中间较斜。当剂量有变化时LD50附近的死亡率变化很大，两端（LD5或 LD95附近）则变化很小。▲ Bliss根据常态累积曲线的特点列出了死亡率各点的“权重系数”作为权衡各点重要性的定量数值。▲ 从S形曲线来看，两端只能趋近而不能达到0%或100%，实际工作中因组内动物数(n)有限，当遇到0/10或10/10的死亡率时一般均采用以下近似计算方法 :null▲ 由常态分布曲线累积而来,当剂量被转换为对数值(X)后，反应几率(P)与X遵循常态分布。▲ 该S形曲线是向心对称的，对称中心的纵坐标为50% 死亡率，横坐标为1ogLD50。▲ 曲线两端平坦，中间较斜。当剂量有变化时LD50附近的死亡率变化很大，两端（LD5或 LD95附近）则变化很小。▲ Bliss根据常态累积曲线的特点列出了死亡率各点的“权重系数”作为权衡各点重要性的定量数值。▲ 从S形曲线来看，两端只能趋近而不能达到0%或100%，实际工作中因组内动物数(n)有限，当遇到0/10或10/10的死亡率时一般均采用以下近似计算方法 :A. 将 n/n 计算为 (n-0.25)/n B. 0/n 的计算为 0.25/n（三）LD50值计算的统计学原理**（三）LD50值计算的统计学原理 致死性反应是一种质反应过程 , 其量一效关系 应符合以下规律 :1. 剂量对数值与死亡率之间呈常态分布曲线关系 2. 剂量对数值与累积死亡率之间呈 S 形曲线关系3. 剂量对数值与几率单位之间呈直线关系 为通过数学的方法更加准确地计算LD50等重要的毒理学参数并得出曲线的斜率，有必要将S形曲线转换为直线。null 当把纵坐标的标识单位反应率改为反应频率时，对称S形曲线转换为正态分布曲线。在该分布曲线下，如把使一半受试个体出现反应的剂量作为中位数剂量，并以此为标准划分若干个标准差，则在其两侧1个、2个或3个标准差范围内分别包括了受试总体的68.3%、95.5%和99.7%。将各标准差的数值均加上5即为概率单位。概率单位与反应率之间的对应关系 反应率（%） 概率单位 0.1 2 2.3 3 15.9 4 50.0 5 84.1 6 97.7 7 99.9 8null**非对称S形曲线转换为直线，需要分两步进行： 1.把横坐标的剂量单位换算为相应的对数； 2.把纵坐标的反应率改为概率单位（几率单位），即可得到一条直线。三、非致死性毒性反应及其转归 **三、非致死性毒性反应及其转归 非致死性（毒性）反应 有些实验动物虽可幸免于致死性毒效应，但由于药物可对机体的生理、生化、免疫、神经或其它系统产生损害，使正常生理功能发生严重紊乱，因而出现上述系统不可逆的损伤。 非致死性有害反应与致死性反应仅仅是程度上的差异，都是用药过程中不希望出现的。null非致死性反应的转归问题主要涉及到反应是否可逆。可逆反应是指当药物在体内消除后，反应也亦随之消失，不残留任何效应。反应是否可逆主要取决于: ● 毒性作用涉及的器官与系统 ● 药物的内在毒性 ● 用药时间的长短 ● 在确定的时间范围内，药物在体内的量 ● 实验动物的年龄（月龄）和健康状况null 再生能力强的组织和器官(如肝脏)的损伤通常较再生能力弱的组织和器官(如神经组织)的损伤易于逆转，肝肾功能不全或尚未发育完善(如幼年动物)的个体易形成不可逆性损伤。 在药物安全性评价中，了解毒性作用是否可逆是非常重要的，如在实验动物中观察到不可逆反应，则应注意这一不可逆反应外推至人时是否存在。第二节**第二节试 验 设 计 原 则 及 方 法一、一般程序和基本要求 **一、一般程序和基本要求 一般程序 将药物通过经口途径（灌胃）或其他预期临床用药途径给予数组实验动物，必要时可增加一个溶媒对照组，在特定时间间隔内观察实验动物的行为表现、中毒症状及死亡情况。 实验条件及方法必须化 试验设计原则及方法一、一般程序和基本要求 **一、一般程序和基本要求 基本要求 两种实验动物 小动物 — LD50、最大耐受量试验 大动物 — 单次给药的近似致死量和最大耐受量 两种给药途径 — 其中一种必须与临床用药途径相同 试验周期 — 7-14天 LD50计算方法 — bliss法 试验设计原则及方法null表14-3 各国对急性毒性试验的基本要求 试验设计原则及方法二、实验动物 **二、实验动物 动物选择的主要原则： ● 尽量选择急性毒性反应与人近似的动物； ● 易于饲养管理、试验操作方便的动物； ● 繁殖生育力较强，数量较大能够保障供应； ● 价格较低，易于获得的动物 试验设计原则及方法二、实验动物 **二、实验动物 在基础性研究工作中按科研课题的具体要求选择，在法规性毒理学评价工作中，必须按照其规范要求进行。 无论使用何种动物都必须注明动物的来源、品系、年龄、体重、性别、饲养条件以及动物生产合格证书。如系无特殊病原体动物也应在报告中注明。 试验设计原则及方法二、实验动物 **二、实验动物 种类 小鼠、大鼠、犬、猴、家兔（经口给药不用） 下列情况考虑选用非啮齿类动物 大、小鼠LD50差别明显 药物的生物转化形式和速率在啮齿类与非啮齿类之间存在明显差异 为了得到明确的毒效表现，初步了解药物的特性后，在条件许可的情况下可考虑选用其他敏感动物 试验设计原则及方法二、实验动物 **二、实验动物 种类 健康状况 体重与年龄 试验设计原则及方法同一批实验中，动物的年龄、体重应尽可能一致 急性毒性试验原则上选用年轻成年动物，啮齿类动物的年龄一般为7 ~ 9 周龄，非啮齿类动物起始为 6 ~ 8 月龄。 同一批试验中，动物的初始体重变异要求不超过平均体重的±20%。null表14-4 常用实验动物的生活年限及体重选择二、实验动物 **二、实验动物 种类 健康状况 体重与年龄 性别 试验设计原则及方法急性毒性试验中应考虑雌雄动物数目相等 但在试验中如发现某性别动物的死亡率明显高于另一性别时，则最好对该性别的 LD50 另外计算，或考虑选用敏感性别的动物重新进行急性毒性试验。二、实验动物 **二、实验动物 种类 健康状况 体重与年龄 性别 动物分组方法 试验设计原则及方法动物应随机分配至各剂量组。随机分组可使动物形成一个均匀的整体，并可减少因个体差异而造成的误差。体重或健康状况不符合要求的动物应在随机分组前剔除。二、实验动物 **二、实验动物 种类 健康状况 体重与年龄 性别 动物分组方法 动物给药前禁食处理 试验设计原则及方法经口途径染毒，在试验前应作禁食处理。 大鼠主要在夜间进食，要求染毒前应隔夜禁食。小鼠由于其消化吸收和代谢速度较快，可隔夜禁食也可禁食4小时以上。大动物常前一天正常给食，染毒前不喂食即可。 禁食期间均正常给水。 染毒2小时后提供饲料。 经口多次染毒，可不禁食。三、剂量水平的选择**三、剂量水平的选择剂量水平的选择以测定LD50及剂量-反应曲线的斜率为目的（10% - 50% - 90%）； 4上以上剂量，至少有3个落在10% - 90%之间； 做预试验来摸索剂量 通过文献检索，为已知化学类别的药物确定预期毒性中值 对全新结构的药物或中草药复方，可先通过小批量动物摸索，找出Dmin和Dmaxnull**▲ 为已知化学类别的药物确定预期毒性中值 剂量水平的选择 对于己了解化学结构的药物，在确定其所属化学类别及其所含的特殊基团的基础上，查阅有关文献，找出与药物结构近似或有共性基团的药物的毒性资料；其次最好能了解药物的理化性质，最后综合考虑这两方面的资料，选择与药物的化学结构和理化性质最为接近的己知药物的 LD50 作为药物的预期毒性中值。null**▲ 为已知化学类别的药物确定预期毒性中值 剂量水平的选择 确定预期毒性中值（LD50）后，以此值为中间剂量，再以该中间剂量值为基准，按一定的组间距上下各推二个剂量，作为预试验的剂量分组。预试时，组间距可稍大些，i 值可取 0.6，相邻剂量比为 1:4。如果估计药物的致死剂量范围较窄，组间距可适当缩小，i 值取 0.2，相邻剂量比为 1:1.6。组间距i 值，剂量的对数值等差分布，剂量等比分布null通过预试找出药物使 10%-90% 实验动物死亡剂量的大致范围, 再据此确定正式试验的具体分组 , 此时可按下式求算组间距（i 值 ）。 或 剂量水平的选择null**▲ 对全新结构的药物或中草药复方 剂量水平的选择 先通过小批量动物的摸索，找出 0 % 及100%估计致死量 (即Dmin 和 Dmax)，再求出 i 值。 (1) 用 10 倍稀释的药物浓度系列，用少量动物（每组 2-3 只），找出大致死亡范围。null 剂量水平的选择 剂量 死亡数/动物数 5mg/kg 0/2 50mg/kg 1/2 500mg/kg 2/2 5000mg/kg 2/2 上述结果提示 , 大致死亡范围为 50mg/kg-500mg/kg。(1) 先用 10 倍稀释的药物浓度系列，用少量动物（每组 2-3 只），找出大致死亡范围。null 剂量水平的选择(1) 先用 10 倍稀释的药物浓度系列，用少量动物（每组 2-3 只），找出大致死亡范围。(2) 再用 1、2、4、8………等 2 倍稀释的药物浓度每组 4 只动物实验，找出Dmin和Dmax。 剂量 死亡数/动物数 50mg/kg 0/4 100mg/kg 2/4 200mg/kg 2/4 400mg/kg 4/4 800mg/kg 4/4null 剂量水平的选择(2) 再用 1、2、4、8………等 2 倍稀释的药物浓度每组 4 只动物实验，找出Dmin和Dmax。 当出现4/4死亡时如其前一组为3/4死亡，则取4/4组的剂量为Dmax，如前一组为2/4或1/4死亡(如本例为2/4)，考虑到4/4组的剂量在正式实验中可能的死亡率低于70%，为慎重起见，可将4/4组的剂量乘以2作为Dmax； 当出现0/4 死亡时，如其后一组的死亡率为1/4，则取0/4组的剂量为 Dmin，如后一组死亡率大于1/4，考虑到0/4组的剂量在正式实验中可能的死亡率高于70%，则将0/4组的剂量除以2，作为Dmin。null 剂量水平的选择 剂量 死亡数/动物数 50mg/kg 0/4 * 100mg/kg 2/4 200mg/kg 2/4 400mg/kg 4/4 * 800mg/kg 4/4Dmax：出现4/4死亡时，前一组为2/4，考虑到4/4组的剂量在正式实验中可能的死亡率低于 70%，可将4/4组的剂量乘以2。 Dmax = 400×70%×2 = 560（mg/kg） Dmin：出现0/4死亡时，后一组死亡率大于 1/4，则考虑到0/4组的剂量在正式实验中可能的死亡率高于 70%，将 0/4 组的剂量除以2。 Dmin =50÷70%÷2≈35（mg/kg）null 剂量水平的选择 剂量 死亡数/动物数 50mg/kg 0/4 * 100mg/kg 2/4 200mg/kg 2/4 400mg/kg 4/4 * 800mg/kg 4/4陈奇：《中药药理研究方法学》第2版 Dmax：当出现 4/4 死亡时,如前一组死亡率为2/4时 Dmax=4/4死亡剂量×1.4( )=400×1.4=560（mg/kg） Dmin：当出现 0/4 死亡时，如后一组死亡率大于1/4 Dmin =0/4死亡剂量÷1.4( )=50÷1.4≈35（mg/kg）null本法用较少的动物和药物，寻找出正式实验时最高死亡率不低于70%，最低死亡率不高于30%的剂量范围。在确定了 Dmax和Dmin以后，可求得组间距（i 值 ): 以 Dmin 的对数为起点，向上推出 n 组动物的各组剂量的对数值，求出反对数即可求得各组的剂量。 剂量水平的选择(1) 先用 10 倍稀释的药物浓度系列，用少量动物（每组 2-3 只），找出大致死亡范围。(2) 再用 1、2、4、8………等 2 倍稀释的药物浓度每组 4 只动物实验，找出Dmin和Dmax。四、剂量组数及动物数**四、剂量组数及动物数 LD50 测定中剂量组数的设计，除符合统计学要求外，还应根据预试验所提供的药物的毒性情况而定。 一般而言，在实际工作中设 4~5 个剂量组，剂距以 0.65~0.85 为宜。 小鼠每组 10 只 ( 雌雄各半 )，大鼠不应少于 6~8 只。五、剂型与给药**五、剂型与给药应写明受试药物的名称、批号、来源、纯度、保存条件及配制方法。 供试药品应能溶于或混悬于适当的溶媒，如果溶媒的毒性情况是未知的，则应设立一个溶媒对照组，溶媒对照组的给药容量应与最高剂量组相等。对所用的溶媒及助溶剂的种类、规格、批号及来源等都必须有详细的记录，以备分析和审核。五、剂型与给药**五、剂型与给药给药途径要用两种，其中应包括推荐临床研究的给药途径。溶于水的药物应当测定静脉给药途径的急性毒性，口服药物应灌胃给药。 药物可以等体积（各剂量组的药物浓度不同，而给药体积相同）或等浓度（药物浓度相同，而各剂量组的给药体积不同）给药，但必须注意上述两种方式给药所观察到的毒性效应可能是不尽相同的。五、剂型与给药**五、剂型与给药给药的体积，啮齿类动物口服给药的最大的体积，对非水溶液而言以不超过10ml/kg为宜，水溶液或混悬液一般不超过20ml/kg。如果剂量较大而不便于一次给药，可以分成相等的容量，每隔6~8小时给药，但必须在第一次给药后的24小时内完成。 口服给药应禁食；静注给药应注意药液的pH值、温度、渗透压、注射速度等可能影响毒效应的各种因素。null表14-6 急性毒性试验常用动物单次给药的常用容量和最大容量六、试验时限与量限 **六、试验时限与量限 急性毒性试验的观察时间取决于症状出现的时间、毒性强弱、致死速度、恢复速率以及药物本身的代谢特征等。 我国新药审批办法规定：急性毒性试验必须观察7~14天，但一般不必超过2周（14 天）。在表示药物的LD50 时最好同时注明观察时间，这样在毒性比较时，才会有共同的基础。 null 从量上考虑试验的限度，在特定的试验条件下，如给予足够大的量，所有的药物都有可能产生毒性。这一限度对于口服急性毒性是 5g/kg，注射是2g/kg，在此剂量下如无死亡出现，通常可不必做更高的剂量。 在实际工作中，对于毒性低的药物可用最大给药浓度和最大给药容量单次或24小时内分次给药，一般使用20只啮齿类动物，连续观察7~14天，如无死亡出现，则该剂量即为药物的最大耐受剂量。七、观察指标**七、观察指标　　 通过深入细致地观察试验动物的中毒症状及其发生、发展的过程与规律、死亡前症状特点、死亡所需时间的差异等，找出毒性作用的特征，初步获得药物毒效应的靶器官和受试动物的死亡原因。七、观察指标**七、观察指标 笼边观察 特别要注意给药后６小时内动物中毒症状及死亡情况。观察的时间间隔及频度必须根据症状出现、恢复、变化及死亡时间而定，一般给药后持续观察 30分钟，第1~ 4小时再观察1次，以后每天观察1次。null**表14-7 急性毒性试验中的一般毒性症状观察 七、观察指标**七、观察指标 笼边观察 特别要注意给药后６小时内动物中毒症状及死亡情况。观察的时间间隔及频度必须根据症状出现、恢复、变化及死亡时间而定，一般给药后持续观察 30分钟，第1~ 4小时再观察1次，以后每天观察1次。 根据不同症状的阳性结果，可进一步扩大观察项目，以深入探讨药物的毒性作用特征。应单独进行实验或制造中毒模型。制造中毒模型所用药物剂量最好低于LD50。七、观察指标**七、观察指标 笼边观察 死亡过程与死亡时间 药物的毒效应是不同的，毒性作用（反应）出现的先后次序以及是否出现都可体现毒效应的差异。 致死所需的时间和所需的剂量都是衡量药物毒性强弱的依据。毒性作用的性质也决定了致死性反应出现所需的时间。因此，死亡时间也可间接地反映药物毒作用性质的信息。七、观察指标**七、观察指标 笼边观察 死亡过程与死亡时间 体重 给药前、给药期间（每天或根据需要确定间隔）、动物死亡时及实验终止时必须对每个动物进行称重，观察药物对动物体重的影响。 引起体重减轻或增长率减慢的原因较为复杂因此，体重的变化要在全面观察的基础上仔细地加以分析。七、观察指标**七、观察指标 笼边观察 死亡过程与死亡时间 体重 尸体解剖及病理组织学检查七、观察指标**七、观察指标 尸体解剖及病理组织学检查 对于濒死的或己死亡的动物以及实验终止时尚存活的动物必须进行系统的尸体解剖检查。 病理组织学检查并非必要的检查项目。但是对于迟发死亡动物，尤其是发生“双峰”死亡现象时，应进行病理组织学检查，以便为死因的确认提供依据。 观察记录应尽量准确、具体、完整。不单记录死亡时间，还应记录具体的中毒表现，并应能表明出现的时间及持续的时间。八、非啮齿类动物的ALD及MTD测定 **八、非啮齿类动物的ALD及MTD测定 最小致死量（MLD） 指药物在最低剂量组的一群实验动物中仅引起个别动物死亡的剂量，在急性毒性试验中可表示为 LD10 或 LD5。 最大非致死量（MNLD） 指药物不引起实验动物死亡的最大剂量，可以表示为 LD0，实际上是急性毒性试验中以死亡为毒效应时的一种最大耐受量（MTD）。 近似致死量（ALD） 是介于最小致死量（MLD）与最大非致死量（MNLD）之间的剂量。null在实际工作中，MLD、MNLD、ALD及MTD均可从啮齿类动物急性毒剂量-反应（死亡）曲线上推算得到。 我国药政管理部门认可的方法是以非啮齿类动物 — 狗的急性毒性试验来获得。nullBeagle犬6~8只，6~8月龄八、非啮齿类动物的ALD及MTD测定null3.由剂量序列表中找出可能的致死剂量范围1.估计对狗可能的急性毒性剂量范围2.按50%递增法设计出含10~20个剂量的序列表根据啮齿类动物急性毒性的各参数、或可照药物的化学结构及其它相关资料，对此加以适当调整，估计可能引起毒性和死亡的剂量范围。4. 找到近似致死量和最大耐受量在此范围内，每间隔一个剂量给一只动物，给药途径同临床用药途径，用等容量不等浓度给药法。在上述试验中得到最低致死剂量和最高非致死剂量，然后用两者之间的剂量给一只动物，此剂量即为所要求的近似致死量。未发现中毒表现的最高剂量即为MTD。八、非啮齿类动物的ALD及MTD测定第三节 LD50计算方法**第三节 LD50计算方法一、孙氏改进寇氏法（点斜法）二、 Bliss 法null**1. 基本要求 反应情况应符合或接近对数正态分布； 相邻两剂量的比值应相等； 各组动物数相等或相近，一般为10只； 不要求死亡率一定包括0%与100%，但二者之和最好在 80%~120% 范围内。一、孙氏改进寇氏法（点斜法）null**2. 计算公式　 (1)当最小剂量组的死亡率为 0 %, 最大剂量组的死亡率为 100% 时，按下列公式计算： LD50 = lg-1 [ Xm – i ( ∑P - 0.5 ) ] …(1) 式中 Xm 为最大剂量的对数； 　 p 为各组动物的死亡率 ( 以小数表示 )； 　 ∑P 为各组动物死亡率的总和 (P1 十P２ +P3 … … ) i 为组间距 ( 相邻两组对数剂量的差值 ) 。一、孙氏改进寇氏法（点斜法）null**2. 计算公式　 （2）当最小剂量组的死亡率大于0%而又小于30%，或最大剂量组的死亡率小于100%而又大于70%时： 式中 Pm 为最大剂量组的死亡率 ; Pn 为最小剂量组的死亡率。一、孙氏改进寇氏法（点斜法）null**2. 计算公式　 （3）LD50 的标准误差按下式计算: 式中 Sx50 为 lgLD50的标准误差； X50即lgLD50 ； n为每组动物数。一、孙氏改进寇氏法（点斜法）null**2. 计算公式　 （4）LD50的95%可信限按下式计算 一、孙氏改进寇氏法（点斜法） 95%可信限 = lg-1 ( X50±1.96 Sx50 ) … (4)例题**例题 取体重18-22g小鼠50只，雌雄各半，随机分成5组，每组10只，按表14-8中剂量腹腔注射PAM溶液，组间剂量比为1:0.8，死亡率见表14-8，用改良寇氏法计算其半数致死量、标准误差和 95% 可信区间。 例题**例题按式（1）计算 LD50 **按式（1）计算 LD50 现 Xm=2.48，i =0.10， ∑P=2.6 LD50 = lg-1 [ Xm – i (∑P - 0.5 ) ] = lg-1 [ 2.48 – 0.1 ( 2.6 - 0.5 ) ] = lg-1 2.27 = 186.21mg/kg按式 (3) 计算 LD50 的标准误差 **按式 (3) 计算 LD50 的标准误差 现 n = 10， ∑P2 = 1.98 按式 (4) 计算 LD50 的 95% 可信限**按式 (4) 计算 LD50 的 95% 可信限95% 可信限 = lg-1 ( X50 士 1.96 Sx50 ) = lg-1 ( lg186.21 士 1.96 ×0.0069 ) = lg-1 ( 2.27 士 0.0135 ) = lg-1 ( 2.2565 ~ 2.2835 ) = 180.51 ~ 192.09 mg/kg 答：PAM 对小鼠腹腔注射的 LD50 为 186.21 mg/ kg ，标准误差为 0.0069， 95% 可信限为 180.51 ~ 192.09 mg/kg 。null** 利用对数剂量与反应百分率的转换数（几率 单位）呈直线关系而设计。又称之为加权几率单 位法或几率单位正规法。 二、Bliss法null**Bliss法计算步骤 1．将实验所得的反应率由百分率与概率单位转换表查出概率单位称经验概率单位(yem)。 2．在坐标纸上，根据对数剂量与yem构成点，用目测法绘制一条直线，绘制时应适当照顾靠近概率单位等于 5的点，并由直线找出各对数剂量(包括产生P=0或P=1的对数剂量)相当的概率单位称期望概率单位(Y) 。二、Bliss法null**Bliss法计算步骤 3．通过公式计算出作业概率单位(y)，便对Y进行校正，计算公式为：y=(Y-P/Z)+P/Z； y=(Y+Q/z)-q/z ; Y极小值(Y-P/Z)为所有动物都生存 时的概率单位； Y极大值(Y+Q/z)为所有动 物都死亡时的概率单位； 全距(1/Z)为极大 值与极小值间的距离； P为实验所得的死亡率；q＝l-p为存活率； 公式计算结果相同，可任意选用。 Y-P/z、1/z、Y+q/Z、W均由作业概率单位的极大值、极小值、全距与权重系数表查出。二、Bliss法null**Bliss法计算步骤 4．将各点加权(nw)，用x。作直线性测验，如各点不显著偏离直线，即可计算回归直线方程。如果由直线方程得到的期望概率单位(Y )与前次的不够接近，则对 Y，再次校正 。 由公式计算x与Y的离均差平方和、离均差积和； 直线性测验； 由公式计算 X、Y的加权平均数； 计算斜率 由公式求回归直线方程二、Bliss法null**Bliss法计算步骤 5．将各x值代入直线方程Y2= +b(x- )，如得到的期望概率单位Y 2与 相差在 0.2以下，则满足要求，不必继续进行样校正 。 6．反应率= 0.5时，Y2=5代入方程：Y= Y2= +b(x- ) ，得到的值即LD50的对数值(m)。 二、Bliss法null**Bliss法计算步骤 4．将各点加权(nw)，用x。作直线性测验，如各点不显著偏离直线，即可计算回归直线方程。如果由直线方程得到的期型概率单位(Y )与前次的不够接近，则对 Y，再次校正 。 二、Bliss法null （1）可求 LD5~LD95； （2）对实验设计要求不严，剂量任意。各剂量 组间可以是等比级数，也可为等差或不等距的数 值，只须有死亡率在 50% 以上及以下组出现； （3）数理严谨，结果精确。优点：缺点： （1）计算繁琐 ； （2）须用权重表。null**思考题 急性毒性、急性毒性试验的概念及意义 LD50的概念及意义 急性毒作用带、治疗指数、安全指数、可靠安全系数的概念与意义。 急性毒性试验的一般程序和基本要求 急性毒性试验的剂量水平选择的要求及一般方法 非啮齿类动物的急性近似致死量及最大耐受量的确定方法 LD50的计算方法