猪脑心肌炎病毒分离株BJC3全长感染性克隆的构建与拯救病毒鉴定

畜牧兽医学报� 2009, 40( 9) : 1350-1357 Acta Veterinaria et Zootechnica S inica 猪脑心肌炎病毒分离株 BJC3全长感染性克隆的 构建与拯救病毒鉴定 张国庆,朱�书,盖新娜, 郭�鑫,陈艳红,查振林,杨汉春* (中国农业大学动物医学院 农业部人畜共患病重点开放实验室, 北京 100193) 摘� 要: 本研究旨在建立猪脑心肌炎病毒( EM CV)的感染性克隆技术。利用 RT-PCR 分 3段扩增出脑心肌炎病毒 BJC3 株的全基因组 cDNA , 依次克隆至低拷贝质粒 pWSK29,构建出全长质粒 pWSKBJC3/ w, 经体外转录和转染 BHK-21 细胞拯救病毒。结果表明,构建的全长 cDNA 克隆具有感染性, 在 BHK-21细胞上可拯救出病毒。拯救病 毒(命名为 rVBJC3W)在 BHK-21 细胞上的生长特性与其亲本病毒 BJC3 一致, 并保持了对小鼠的致病性。本研究 成功构建了中国第 1 株猪脑心肌炎病毒的感染性克隆,为深入研究其分子致病机制提供了必要的工具。 关键词: 脑心肌炎病毒; 感染性克隆;病毒拯救; 生长特性;致病性 中图分类号: S852. 659. 6� � � � 文献标识码: A � � � � 文章编号: 0366-6964( 2009) 09-1350-08 收稿日期: 2009-02-24 基金项目:国家自然科学基金重点项目( 30530550) 作者简介:张国庆( 1976- ) ,男,黑龙江密山人,博士,主要从事动物分子病毒学与免疫学研究 * 通讯作者:杨汉春, E-mail: yangh anchun1@ cau. edu. cn Construction of Ful-l length Infectious Clone for Encephalomyocarditis Virus BJC3 and Identification of Rescued Virus ZHANG Guo-qing , ZHU Shu, GE Xin-na, GU O Xin, CHEN Yan-hong, ZHA Zhen-lin, YANG Han-chun * ( K ey L aborator y of Zoonosi s of M inist ry of A gr icul tur e, Col lege of Veterinary Medicine, China A gr icul tur al Univ ersi ty , Bei j ing 100193, China) Abstract: The object ive of this study w as to const ruct infect ious clone of encephalomyocardit is v-i r us ( EMCV) . T he genomic cDNA of EMCV BJC3 w as amplif ied by thr ee overlapped segments using RT- PCR, and cloned into low-copy plasmid pWSK29 to const ruct ful-l length cDNA clone pWSKBJC3/ w . The pWSKBJC3/ w w as in vi tr o tr anscribed and transfected into BHK-21 cells to rescue the virus. T he results show ed that the ful-l leng th cDNA clone w as infectious and the v irus could be rescued on BHK-21 cells. T he r escued virus designated rVBJC3W was ident ified by RT- PCR and indirect immunof luorescence assay ( IFA) . T he rescued v ir us had similar g row th char ac- terist ics w ith it s par ental virus BJC3 and r emained the pathogenicity for mice. Our r esults indica- ted that the f ir st infect ious cDNA clone of EMCV in China w as successfully established and pro- v ided an essent ial tool for invest igat ing the mo lecular basis o f pathogenicity of EMCV. Key words: encephalomyocardit is virus ( EMCV ) ; infect ious cDNA clone; virus rescue; grow th character ist ics; pathogenicity � � 脑心肌炎病毒 ( Encephalomyocardit is virus, EMCV)是微 RNA 病毒科( Picornav ir idae)心病毒 属( Cardiovirus) 的成员之一。EMCV 的宿主谱很 广,主要感染啮齿类、猪、灵长类等动物,鼠类是其天 然贮藏宿主[ 1] 。自 1958年在巴拿马首次从患心肌 炎的病猪中分离到 EMCV 以来[ 2] , 由 EMCV 感染 � 9期 张国庆等:猪脑心肌炎病毒分离株 BJC3 全长感染性克隆的构建与拯救病毒鉴定 引起养猪业的经济损失在许多国家均有报道 [ 3]。 EMCV 感染可致仔猪的急性致死性心肌炎、断奶仔 猪的突然死亡以及母猪的繁殖障碍 [ 4-8]。 中国规模化猪场 EMCV 的感染已从病原学与 血清学角度得到证实[ 9-11] , 对养猪生产的潜在危害 值得重视。已有的研究揭示了 EMCV 分离毒株在 致病性上存在差异[ 7] 。因此,揭示 EMCV 分离毒株 致病性差异的分子机制具有重要的理论和实践意 义。本研究拟以我国 EMCV分离毒株为材料,建立 该病毒的感染性克隆技术, 以期为深入其分子 致病机制提供必要的技术平台。 1�材料与方法 1. 1�材料 BHK-21细胞由作者实验室保存, 用 DMEM 培 养基培养。EMCV BJC3 由作者实验室分离并保 存[ 9]。克隆载体 pBluescript � II SK+ , 购自 Strata- gene公司;大肠杆菌 DH5�购自北京全式金技术有 限公司。低拷贝载体 pWSK29由军事医学科学院 范宝昌博士惠赠。EMCV V P1单克隆抗体 C11 由 作者实验室制备。 1. 2�载体的改造 根据 pSWK29 全序列和 QuikChange� multi site-directed mutagenesis kit ( Str atagene, Aarhus, Denmark)使用说明书, 2 对回文引物突变掉 3 536位的 S p e �位点及5 124位的B ssH �位点(表 1)。改造后的载体去掉了原有的多克隆位点,只含 有感染性克隆全长构建所需要的 Cla �、EcoR �和 S ph �位点,将其命名为 pWSK29m/ �。 1. 3�BJC3 全长 cDNA 及感染性克隆全长质粒的 构建 � �利用 QIA amp� Viral RNA M ini Kit ( Qiagen) 提取 BJC3的 RNA, 具体步骤参照试剂盒说明书。 获得的 RNA 以 20 �L RNase- free w ater ( Ambion Inc. , T exas, USA)溶解,置于- 70 �冻存。根据 EMCV BJC3 全 基 因 组 序 列 ( GenBank No: DQ464062) ,设计覆盖病毒全基因组的 3对重叠引 物,引物由上海英骏生物技术有限公司合成,用无核 酸酶的水配至使用浓度。在全长扩增的上游引物 T 7- SegA-F 中加入 T7 RNA 聚合酶启动子核心序 列。在引物 SegB-F 和 SegB-R中引入点突变,扩增 后将基因组第 6 262位的 T 突变为 A, 突变后密码 子 CGA与突变前密码子 CGT 均编码同一氨基酸 ( R) ,为同义突变; 获得的序列 GAA TT C 为限制性 内切酶 E coR �的识别序列,作为感染性克隆的遗传 标记。引物序列见表 1。 1351 畜� 牧� 兽� 医� 学� 报 40 卷� � �以病毒总 RNA 为模板, 应用反转录酶 Super- scriptTM � ( Invitrogen life technologies, CA, USA)得 到高丰度的 cDNA。参照产品说明书构建 20 �L 反应 体系,在其中分别加入用以扩增 3个片段的下游引物 SegA-R、SegB-R和 SegC-R( 50 �mol �L-1 ) 1 �L。将 反应体系置于 65 �水浴5 min, 迅速冰浴 2 min。瞬 时离心混匀后于 30 �水浴 10 min, SegA-R、SegB-R 为特异性引物, 反转录温度为 55 � ; 而 SegC-R 为 Oligo( dT) 18 ,反转录温度为 50 �。反转录 2 h后置 于70 �水浴中 10 min终止反应,获得A、B、C 3个片 段的 cDNA。 以 cDNA 为模板,分别以 SegA-F、SegA-R, SegB- F、SegB-R, SegC-F、SegC-R 为引物, 使用高保真酶 Pf uUl tra TM II Fusion HS DNA Polymerase ( Strata- gene, Aarhus, Denmark)对 3个片段进行 PCR扩增。 按照产品说明书构建 50 �L 反应体系, 3个片段的扩 增条件分别为片段 A: 95 � 20 s, 61 � 20 s, 72 � 90 s;片段 B: 95 � 20 s, 58 � 20 s, 72 � 2 min; 片段 C: 95 � 20 s, 50 � 20 s, 72 � 45 s。PCR扩增 产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳检查后进行回收、纯化。 将pBluescript � II SK+ 克隆载体分别用 Cla�/ Sp e �、 Cla �/ EcoR �进行双酶切,并将回收纯化后的 SegA、 SegB以相应的酶消化后分别克隆至载体, 获得的质 粒命名为 pBLSegA 和 pBLSegB。将 SegC 以 EcoR � 和S ph�双酶切后克隆至载体 pWSK29m/ �,将中间 质粒命名为 pWSKBJC3SegC。以 Cla �/ EcoR �双酶 切质粒 pBLSegB, 将酶切回收后的 B片段与 Cla �/ EcoR�双酶切后的pWSKBJC3SegC载体相连接,构建 中间质粒 pWSKBJC3SegBC;最后以相同的方法把片 段A 连接到 pWSKBJC3SegBC 上, 完成 BJC3 cDNA 全长质粒 pWSKBJC3/ w 的构建。所有中间质粒和全 长质粒的提取均使用 Wizard� Plus Midipreps DNA Purifation System( Promega) ,获得的重组质粒经 PCR 和酶切鉴定后用紫外分光光度计测定浓度,置于- 20 �保存。全长质粒 pWSKBJC3/ w 的测序由上海英骏 生物技术有限公司完成。pWSKBJC3/ w 全长质粒的 构建策略如图1所示。 1. 4�全长 cDNA克隆的体外转录与转染 将 10 �g pWSKBJC3/ w 全长质粒用 BamH �线 性化, 并采用 T7 MEGAscript � Kit ( Ambion Inc. , Texas , USA)进行体外转录。根据产品说明书构建 20 �L反应体系,其中包括 10 �Reaction buffer 2 �L, ATP、CTP、GTP、UTP solut ion 各2 �L, 线性化质粒 1 �g, Enzyme mix 2 �L, 用 RNase- free w ater 补至 20 �L。37 �水浴 3 h, 加入 1 �L TURBO DNase�, 37 �孵育 15 min 消化模板质粒 DNA。将获得的 mRNA 用紫外分光光度计测定浓度后立即用于转染 或置于- 70 �保存。 待 6孔细胞板( GIBCO, NY, USA)中的 BHK- 21细胞形成 80%左右的细胞单层后小心吸出上清, 每孔加入2 mL 平衡至室温的 Opt-i MEM � I Reduced Serum M edium( Invitrogene Corporation, NY, USA) 洗涤 1~ 2次。将 1 mL Opt-i MEM � I Reduced Serum Medium 与10 �L DMRIE-C脂质体( Invitrogene)涡旋 混匀,再加入 5 �g RNA,轻柔混匀后立即转入细胞单 层,同时设 Opt-i MEM � I Reduced Serum Medium 和 DMRIE-C脂质体对照。CO2 培养箱 37 �培养 4 h 后,小心吸出转染液,加入2 mL 2% DMEM 维持液继 续培养,每隔一段时间观察细胞病变( CPE)。 1. 5�拯救病毒 rVBJC3W遗传标记的酶切鉴定及全 基因组测序 � �将拯救病毒的细胞培养上清反复冻融 3次后提 取 RNA,以 EcoR -I F/ EcoR -I R 为引物(表 2)利用 RT-PCR方法扩增病毒基因组 5 924-7 062区域。取 20 �L PCR产物用 EcoR �进行酶切, 同时扩增 BJC3 野生毒基因组上的相同区域,也用 EcoR �酶切作为对 照;用 0. 8%琼脂糖凝胶电泳对 PCR扩增产物及酶切 产物进行分析。 利用 RT-PCR分段扩增拯救病毒的全长 cDNA, 拼接获得拯救病毒 rVBJC3W的全基因组序列。测序 工作由上海英骏生物技术有限公司完成。 1. 6�拯救病毒的间接免疫荧光( IFA)检测 待 96孔细胞培养板( GIBCO, NY, U SA)中的细 胞长成良好的细胞单层后,每孔接种第 4代拯救病毒 100 �L,同时设阴性对照,于 37 �吸附 1 h后, 加入 100 �L 含 2%新生小牛血清的 1� DMEM 营养液继 续培养。接种 10 h后轻轻甩去上层液体,用� 20 � 预冷的丙酮室温固定15 min, PBS洗涤3次。每孔加 入 100 �L 1: 100 稀释的 EMCV VP1 单克隆抗体 C11, 37 �湿盒作用 1 h; PBS 漂洗 3次,每次 5 min; 每孔加入50 �L 1: 100 稀释的含 0. 01%伊文斯蓝的 荧光标记( FITC)羊抗鼠 IgG, 37 �恒温箱中避光作 用 45 min; PBS漂洗 3次,每次 5 min; 自然晾干后加 PBS缓冲甘油( 0. 01 mol � L-1 pH7. 4 PBS: 甘油= 1: 9)封片,于荧光显微镜下观察结果并照相。 1. 7�拯救病毒的生长特性分析 待 96孔细胞培养板中的细胞长成良好的细胞单 层后,将拯救病毒以维持液进行 10 倍梯度稀释,取 1352 � 9期 张国庆等:猪脑心肌炎病毒分离株 BJC3 全长感染性克隆的构建与拯救病毒鉴定 10 -4 ~ 10 -8稀释度的病毒液进行接种;每个稀释度平行 接种4孔,每孔 100�L。37 �吸附1 h后小心吸弃上 清,加入 100 �L 维持液继续培养。20 h 后观察 CPE 并记录各个梯度出现 CPE的孔数,根据Reed-M�ench 法计算 TCID50。 第4 代拯救病毒 rVBJC3W 和第 8 代亲本毒 BJC3均以100 TCID50的病毒量接种 BHK-21单层细 胞,接种后每间隔 4 h吸取细胞上清, 直至接种后 36 h。按照上述方法测定每个时间点所取细胞上清的病 毒滴度, 绘制病毒在 BHK-21 细胞上的一步增殖 曲线。 1. 8�拯救病毒对小鼠的致病性试验 取 30只 6周龄的雄性BALB/ c小鼠,随机分为 3 组,每组 10只。其中2组作为攻毒组,分别注射BJC3 野生毒和拯救病毒 rVBJC3W,每只小鼠腹腔注射 0. 2 mL 病毒液,攻毒剂量为 2� 106TCID50 �mL-1。另外 一组作为对照,腹腔注射 0. 2 mL 细胞维持液。攻毒 后观察 14 d,并绘制存活曲线。 图 1� pWSKBJC3/ w全长质粒的构建策略 Fig� 1� The construction strategy of pWSKBJC3/ w 1353 畜� 牧� 兽� 医� 学� 报 40 卷� 2�结果与分析 2. 1 �覆盖 EMCV BJC3 全基因组的重叠片段的 RT-PCR扩增 � �用设计的 3对引物, RT-PCR 扩增获得 EM- CVBJC3覆盖全基因组的重叠片段 A、B 和 C, 预期 扩增片段大小为2 957、4 005和1 497 bp。用0. 8% 琼脂糖凝胶电泳进行分析, 扩增条带大小与预期相 符,结果见图 2。 2. 2�全长质粒 pWSKBJC3/ w的酶切鉴定与测序分析 构建的全长质粒 pWSKBJC3/ w 用 Cla � 和 Sph �进行双酶切鉴定,酶切产物经 0. 8%琼脂糖凝 胶电泳分析证实获得 BJC3全长 cDNA 克隆, 大小 约为 7. 8 kb。对全长质粒进序分析,结果显示 获得的 BJC3 cDNA 克隆全长为 7 736 nt�不含 poly ( A) �, 5�非翻译区( 5�U TR)的 Poly ( C)可读长度为 15 nt , 基因组 3�末端的 Po ly ( A) 为 79 个腺嘌呤。 与 EMCV BJC3 登陆 GenBank 序列相比, 全长 � � � � � cDNA克隆除 E coR �遗传标记外, 共有 3个随机分 布的点突变,其中 1个位于 5�非翻译区, 另外 2个位 于编码区。 M. DL2000 P lus Marker; 1. Segment A; 2. Segment B; 3. Segment C 图 2 � EMCV BJC3 cDNA 的 RT-PCR扩增 Fig� 2 � Amplification of BJC3 cDNA by RT-PCR 表 2� 全长 cDNA与 EMCV BJC3 基因组序列比较 Table 2 � Genomic comparison of ful-l length cDNA and parental EMCV BJC3 位置* Location* 三联密码子 T riplet code 核苷酸改变 Nucleot ide change 突变类型 T ype of mutation 氨基酸改变 Amino acid change 所在蛋白 Predicted domain 628 - G� T Replacement - 5� UT R 2 958 TAT A� T Replacement Y� F VP1 4 368 GT C T � C Replacement V � A 2C * 核苷酸位置指在 EMCV BJC3 序列中的位置 ( GenBank 收录号: DQ464062) * Nucleo tide locations ar e numbered acco rding to BJC3 sequence ( GenBank accession number : DQ464062) 2. 3�病毒的拯救 以 BamH �线性化后的全长质粒为模板, 采用 T7 MEGA script � Kit ( Ambion Inc. , T exas, USA)进行体外转录,获得大约40 �g mRNA。将约 5 �g mRNA 转染6孔板培养的 BH K-21细胞,转染 后 20 h可以观察到明显的 CPE, 与 EMCV BJC3病 毒感染所产生的 CPE一致(图 3) , 将拯救的病毒命 名为 rVBJC3W。取 1 mL 转染后产生的拯救病毒 的细胞上清接种细胞瓶中的 BHK-21细胞, 连续传 代扩大培养。 2. 4�拯救病毒的遗传标记鉴定与全基因组测序 同时提取拯救病毒与 BJC3 野生毒 RNA, 用 RT-PCR扩增病毒基因组 5 924-7 062 nt区域,同时 设 RNA 和水对照。各取 20 �L PCR 产物进行 EcoR �单酶切, 37 �水浴作用 1 h。用 0. 8%琼脂 糖凝胶电泳对 PCR扩增产物及酶切产物进行分析。 拯救病毒的 RT-PCR产物酶切后产生 338和 801 bp 2个片段,而 BJC3的扩增产物 EcoR�不能切开, 仅得 到唯一条带;对照均未有特异性条带出现(图 4)。 利用 RT-PCR 分段扩增拯救病毒的全长 cD- NA,送至上海英骏生物技术有限公司进行测序, 拼 接获得拯救病毒 rVBJC3W 的全基因组序列。测序 结果证实拯救病毒的全基因组序列与构建的全长 cDNA 克隆序列一致。 2. 5�拯救病毒的间接免疫荧光( IFA)鉴定 用 EMCV VP1蛋白单克隆抗体 C11作 IFA鉴 定拯救病毒 rVBJC3W。结果显示, 第4代拯救病毒 rVBJC3W 接种 BHK-21 单层细胞 10 h后,感染细 胞胞质内呈现可见的特异性荧光, 细胞对照则未见 荧光(图 5)。 1354 � 9期 张国庆等:猪脑心肌炎病毒分离株 BJC3 全长感染性克隆的构建与拯救病毒鉴定 A. BH K-21 cells; B. CPE o f rVBJC3W ; C. CPE o f BJC3 图 3� 拯救病毒 rVBJC3W在 BHK-21 细胞上产生的细胞病变( 200 � ) Fig� 3 � CPE of rescued virus rVBJC3W on BHK-21 cells ( 200 � ) M. DL2000 Plus marker; 1. rVBJC3W RT-PCR product; 2. BJC3 RT-PCR product; 3. rVBJC3W RT-PCR product dig ested by EcoR I; 4. BJC3 RT-PCR product dig ested by EcoR I; 5. rVBJC3 RNA RT-PCR control; 6. Water contro l 图 4� 拯救病毒 rVBJC3W遗传标记的酶切鉴定 Fig� 4� Genetic marker detection of rescued virus rVBJC3W 2. 6�拯救病毒的增殖特性 将第 4代拯救病毒以维持液进行 10倍梯度稀 释,取 10-4 ~ 10-8稀释度的病毒液接种 96孔细胞培 养板中的 BHK-21单层细胞, 37 �吸附 1 h 后换 液。20 h 后观察 CPE, 并记录各个梯度出现 CPE 的孔数,根据 Reed-M�ench 法计算 T CID 50 ,结果为 10-8mL-1 ,与亲本病毒的 TCID50没有明显差异。第 4代拯救病毒 rVBJC3W 和第 8 代亲本毒 BJC3均 以 100 TCID50的病毒量接种 BHK-21单层细胞,绘 制病毒在 BHK-21细胞上的一步增殖曲线(图 6)。 结果显示拯救病毒与亲本毒在 BHK-21 细胞上的 增殖动态相似, 各时间点的病毒滴度无统计学 差异。 � � A. rBJC3W; B. BH K-21 cells 图 5 � 拯救病毒 rVBJC3W感染 BHK-21细胞的间接免疫荧光检测( 400� ) Fig� 5� Identification of rescued virus rVBJC3W by IFA ( 400� ) 2. 7�拯救病毒的小鼠攻毒试验 用第 4代拯救病毒 rVBJC3W 和第 8代亲本毒 BJC3对 BALB/ c小鼠进行腹腔接种,攻毒总量均为 4� 105T CID 50。攻毒小鼠均在攻毒后 3~ 5 d 出现 明显的临床症状, 主要表现为被毛粗乱、精神沉郁、 反应迟钝、蜷缩、流泪、呼吸急促,并表现出明显的神 经症状,如震颤、后肢麻痹、转圈、侧颈和四肢呈划水 状等。拯救病毒与亲本毒的小鼠存活曲线(图 7)显 示,拯救病毒对小鼠的致病性和毒力与亲本毒一致, 接种小鼠全部死亡。对照小鼠全部健活。 1355 畜� 牧� 兽� 医� 学� 报 40 卷� 3�讨�论 EMCV 全基因组大小为 7. 8 kb 左右, 基因扩 增、连接全长 cDNA 相对容易。但是, 由于 EMCV 基因组结构的特殊性, 特别是 5�非翻译区的特殊结 构,在病毒复制翻译中起着举足轻重的作用, 是感染 性克隆能否成功构建的重要因素。EMCV 转录机 制独特,其 5�末端没有�帽�结构,由 20个氨基酸组 成的 VPg 充当病毒的�帽�;且 5�U TR区域较大, 包 括 1个特殊结构 ���内部核糖体进入位点( Internal ribo somal ent ry site, IRES)。IRES 由大约 450 个 碱基组成,其作用是引导病毒基因组不经过正常的 5�末端�帽�结构而直接进行多聚蛋白的翻译 [ 12-14]。 IRES序列的扩增要求完整、准确, 才能有效启动 EMCV 的转录, 从而产生具有感染性的 RNA [ 15]。 本研究构建的感染性克隆在 628位发生的 G �T 碱 基置换正好位于 IRES内部, 但是与 EMCV 其它分 离株相同位置( HB1、EMCV-R、BEL-2887A/ 91)的 序列比对发现,其它分离株 5�U TR 该位置均为 T。 这至少说明此点突变在自然毒株中存在, 不会导致 病毒的致死性变化。 5�末端另外一个重要组成部分就是 Po ly( C)结 构域,其序列组成为 CmU CU C3UCn。连续 C的结 构一方面导致反转录酶在反转录过程中识别、校正 困难,以及高保真酶在 PCR扩增过程中连续扩增及 校正的难度增大; 另一方面, Poly ( C)的测序同样是 难点,普通测序很难准确地测定其长度。本研究构 建的 EMCV BJC3感染性克隆通过测序证实可读的 Poly ( C ) 较 短, 长 度 为 32 nt, 序 列 为 C15U CUC3U C10。获得的拯救病毒 rVBJC3W 能 够对 BHK-21产生明显的 CPE, 且体内试验表明拯 救病毒与亲本毒在鼠体上的毒力相似, 已有的研究 表明,较短的 Poly( C)并不一定影响 EMCV 毒株的 细胞适应性及致病性[ 16-17] 。 EMCV 3�U TR在病毒基因组的复制中也发挥 重要作用。3�末端为异源长度的 Poly ( A) , 构建的 EMCV 全长感染性克隆质粒测序结果显示, Poly ( A)为 79 nt; 亲本株 BJC3的 Po ly ( A )较短, 仅 15 nt。Po ly( A)的长度似乎对全长感染性 cDNA 克隆 的影响不大, 7个 A 的 Po ly ( A)即能使细胞发生明 显的 CPE,引起小鼠致病[ 18] ,本试验获得的拯救病 毒 rBJC3W 与亲本株病毒 BJC3的 T CID50、CPE、细 胞生长曲线都没有明显的差异。 本研究在国内首次成功构建 EMCV 全长感染 性 cDNA 克隆,为 EMCV 的分子致病机理、疫苗构 建、基因功能等病毒分子生物学研究提供了有力的 工具。 参考文献: [ 1 ] � SEAMAN JT , BOULTON J G, CARRIGAN M J. 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