淀粉酶活力的测定方法

淀粉酶活力的测定方法 淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界。不同来源的淀粉酶，性质有所不同。植物中最重要的淀粉酶是α -淀粉酶和β-淀粉酶。 α -淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α -1,4糖苷键，单独使用时最 2+终生成寡聚葡萄糖、α-极限糊精和少量葡萄糖。Ca 能使α-淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，pH 3.6 以下可使其钝化。 β-淀粉酶从非还原端作用于α-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的α -1,6键时停止。单独 —作用时产物为麦芽糖和β-极限糊精。β-淀粉酶是一种巯基酶，不需要 Ca 2+ 及 Cl 等辅助因子，最适pH偏酸，与α -淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，60 ?保温15min可使其钝化。 通常提取液中α -淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。可以先测定( α + β)淀粉酶总活力，然后在60 ?加热 15 min ，钝化β-淀粉酶，测出α -淀粉酶活力，用总活力减去 α - 淀粉酶活力，就可求出 β- 淀粉酶活力。 淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸的显色反应来测定。还原糖作用于黄色的 3,5- 二硝基水杨酸生成棕红色的 3- 氨基 -5- 硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。以每克样品在一定时间内生成的还原糖(麦芽糖)量示酶活大小。 1 酶活测定方法 (1)曲线的制作(见下表) ?取7支20 ml具塞刻度试管,预先洁净灭菌干燥,编号,按表加入试剂。?摇匀,至沸水浴中煮沸5 min。取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20 ml,以1号管作为空白调零点,在520 nm的波长下比色测定吸光度值。并建立通过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。 表1 标准麦芽糖溶液成分表及OD测定值 1 2 3 4 5 6 7 试剂 0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 麦芽糖标准液(mL) 2.0 1.8 1.4 1.0 0.6 0.2 0 HO(mL) 2 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 3,5-二硝基水杨酸(mL) 0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 麦芽糖含量(mg) OD 520 (2)粗酶液淀粉酶活力测定 ?待测粗酶液的制备: 发酵24 h后发酵液4000 r/ min离心10 min,去除菌体，在上清液中加入65,饱和度的硫酸铵，待硫酸铵充分溶解后于4?盐析2h，然后5000r/min离心20min，得到初步 纯化的淀粉酶。 ?按以下顺序操作: 取预先洁净灭菌干燥试管,编号。取粗酶液1 ml于各只试管中，于60?水浴中预热5min柠檬酸淀粉缓冲液同时在60?水中预热5min，?取柠檬酸淀粉缓冲液1ml加入试管中,于60?水浴中保温30min?加入1.5 ml 3,5-二硝基水杨酸,沸水中5 min,加入氢氧化钠溶液终止反应,加蒸馏水至20 ml。?摇匀,用分光光度计测定OD520 nm值。在上述条件下以单位体积样品在30 min释放1 mg麦芽糖所需的酶量为一个麦芽糖单位表示酶活性。 在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量按下列公式计算酶活力 酶活力测定公式: 淀粉酶活力=麦芽糖含量(mg)?淀粉酶原液总体积(mL)/所加淀粉质量 每个样品按下表所示步骤操作，在反应过程中，从加入底物开始，向每支管中加入试剂的时间间隔要绝对一致: 表2样品酶活力测定步骤 样品(重复3标准空白 反应顺序 样品空白 个) 样品稀释液(ml) 1 1 0 蒸馏水 0 0 1 60?预热5min 依次加入淀粉溶液1.5 1.5 1.5 (ml) 混合60?保温30min 依次加入DNS试剂1.5 1.5 1.5 (ml) 混合100?煮沸5min加入0.4mol/L NaOH溶液终止反应 加入蒸馏水至总体积20 20 20 (ml) 反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机上以4,000rpm离心10min，上清液以标准空白调零，在分光光度计520nm波长处测定样品空白(A)和样0品溶液(A)的吸光值，A,A为实测吸光值。用直线回归方程计算样品淀粉酶的活性。 0 2 活性计算 酶活力单位定义:在60?、PH5.6条件下，每小时从2,的可溶性淀粉溶液中释放出1mg尔麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位(U) 淀粉酶活性U按下式计算: K×(A,A) 0 U = ×F S×(30?60)×180 其中:U——样品淀粉酶活性，U/ml; K——标准曲线斜率; F——样品溶液反应前的总量，ml; S——样品测试量;表1中S,1ml; 60——1小时为60min; 30——反应时间，min。 试剂 (1)2% 淀粉溶液 (2) 0.4mol/L 氢氧化钠 (3) pH5.6 柠檬酸缓冲液 称取柠檬酸 20.01g ，溶解后定容至 1000mL ，为 A 液。称取柠檬酸钠 29.41g ，溶解后定容至 1000mL ，为 B 液。取 A 液 13.7mL 与 B 液 26.3mL 混匀，即为 pH5.6 之缓冲液。 (4) 3,5- 二硝基水杨酸 精确称取 1g3,5- 二硝基水杨酸溶于 20mL 1mol/L 氢氧化钠中，加入 50mL 蒸馏水，再加入 30g 酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至 100Ml ，盖紧瓶塞，防止 CO 进入。 2