环孢菌素A衍生物的合成及其生物学活性研究(可编辑)

环孢菌素A衍生物的合成及其生物学活性研究(可编辑) 环孢菌素A衍生物的合成及其生物学活性研究 福建医科大学 硕士学位 环孢菌素A衍生物的合成及其生物学活性研究 姓名:方剑英 申请学位级别:硕士 专业:药理学 指导教师:郑卫 20080301摘要 环孢菌素衍生物的合成及其生物学活性研究 摘要 环孢菌素已作为免疫抑制剂广泛应用于器官移植时的抗排斥反 应,在抗真菌、抗寄生虫、抗、抗炎以及逆转肿瘤细胞多药耐药 等方面也 有一定的作用。免疫抑制活性的构效关系研究表明其结构中位上 的氨基 酸?,,毋..羟基甲基甲氨基.一辛烯酸对环孢菌素的生 物学活性起着重要的作用,也是环孢菌素化学结构修饰的一个重 要位点。本 研究以作为结构修饰的位点,开展了以下工作: .合成并分离纯化了未见文献报道的个衍生物。对专利文献报道 的合成方法进行改良,提高了收率和简化了反应步骤。 .建立了以硅胶柱色谱、高速逆流色谱和高效液相色谱等现代分离技术为 主的分离纯化方法,对合成得到的化合物进行了有效而快速的纯化。通过质谱、 红外光谱和核磁共振进行了结构确认。 .研究合成的化合物对淋巴细胞转化的抑制活性。结果表明合成的衍 生物对淋巴细胞转化的抑制活性均低于环孢菌素。但这些基团改变后的衍生 物之间抑制活性有明显的变化,初步讨论了他们的构效关系。 .研究合成的化合物对真菌的生长抑制活性。结果表明衍生物的抗真 菌谱窄,只对少数真菌有作用,有些化合物对某些特定菌有较强的抑制作用。 关键词:环孢菌素衍生物 免疫抑制活性 抗真菌活性摘要 .. , . 一一,, 一一一一一 . . ? .: . . .,衄咖跗锄 . . , . .. 如【印芏镪. .. . : ;; ; 学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究 工作所取得的真实成果。除文中已注明引用的内容外,本论文不含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本论文的研究做出重要贡献的个人和集 体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名手写./麦型董. 导师签名手写 丝塞年』月上三日 进年 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借 阅。本人授权福建医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书 作者签名手写:二丕剑互 导师签名手写 ?竺年 一竺皇年』月』土日第一章概论 论 第一章概 环孢菌素,结构见图.是一种从丝状真菌 培养液中分离出的由个氨基酸组成的环肽。该药发现 于年。年瑞士公司首次报道了由半知菌属多孔木霉 和光泽柱孢菌 后更名为雪白白僵菌 产生的环孢菌素?。此后各国的科学家又陆续报道了 由种其他产生菌,如茄病镰刀菌 和侵菅新赤壳菌 纠等产生环孢菌素心。 从世纪年代作为免疫抑制剂用于临床以来,在器官移植治疗中 发挥了重大作用,奠定并推动了器官移植的发展。目前,全世界已有超过万 例的患者使用环孢菌素作为器官移植时的抗排斥反应药物?。作为免疫抑制 剂它还被应用于一些自身免疫性疾病的治疗,如对类风湿关节炎及白塞 ’ ,贝赫切特综合征,取得了较为满意的疗效,对型糖尿病、 牛皮癣和寄生虫病如疟疾、血吸虫等有一定疗效哺呵。此外,环孢菌素还具有 广泛的其它生物学活性如抗真菌、抗寄生虫、抗、抗炎、逆转肿瘤细胞多 药耐药等作用,但是,由于其存在比较严重的肝肾毒性以及溶解性差,治疗指 数窄,生物利用度低等缺点影响了它在这些领域的进一步应用。人们开始尝试 对其结构进行改造合成了一系列化合物,并从中寻找毒副作用低的免疫抑制剂 或虽然无免疫抑制活性,但毒性低,具有其它生物学活性的衍生物饽。 \./四 ‰ :。;:孓‖。嚣急掌“‰, , 。。 ?砖。一智一电“?一如一《一曩: ?止。 矗。 :矗。 ;, 凇避箨 ? 工 /、 』..‘ 。?鸯挂史第一帝概论 福建省微生物研究所于年首次报道了从国内土壤中筛选到环孢 菌素 的产生菌一茄病镰刀菌.,并从该菌的代谢产物中先后分离出环 孢菌素 、环孢菌素、环孢菌素、环孢菌素和环孢菌素 等组份,并开展了半合成衍生物的工作,为开展环孢菌素的研究 工作提 供了条件‘‘。 . 免疫抑制作用机制和构效关系研究进展 环孢菌素发挥作用的主要机制是环孢菌素与亲环孢素, 形成复合物再与依赖钙/钙结合蛋白的钙调磷酸酶作用,抑制 . ,活化细胞核因子的去磷酸化使其不 能进入核内,从而抑制.的产生,淋巴细胞的生成受抑制?。 ..构效关系 ... /复合物的形成 环孢菌素结构的,,,,位氨基酸是环孢素与的结合区; 位氨基酸是与作用的效应区。是广泛存在于原核和真核生物组织 中的一种蛋白,是肽酰一脯氨酰顺反异构酶家族成员,具有活性, 可以催化肽或蛋白底物的肽酰一脯氨酰顺反式之间的内部转化 见图。 一 芦斟 芦附 图 的作用模式 当和结合后,分子结构与游离分子结构相比其构象发 生了明显的变化,分子中原有的氢键均断裂,形成新的氢键;分子 中的酰氨键 也由顺式转化为反式,这样形成的复合物才能与作用;单独的或 都不能与作用到。研究发现,环孢菌素只需要结合%~%的亲环孢 素就能发挥其免疫抑制活性。 但是在环孢菌素中与的结合能力的强弱并不能体现为免疫抑制 的强 第一奄概论 弱,如下图表中所示与结合能力强的免疫抑制活性不一定就强, 而与 结合能力很弱的也不一定就没免疫抑制活性朝见表。 表不向化合物的抑制活性 章‘‘”:有;“卅”:强;““或.”:无 ...相似的底物结构 和的结合是产生抑制活性的基础,在环孢菌素与的 结合区中对结合有重要贡献的是的位氨基酸~,,目.. 羟基..甲基,.甲氨基一.辛烯酸,氨基酸结构与的最适底物结构 相 似,形成的过渡态能量最低最稳定,这对和的高亲和力是很重要 的引。 ...特殊氨基酸的改造 对进行的构效关系研究表明的被取代或消除后 。 的免疫抑制活性几乎消失,若上的双键被饱和,活性也受影响 等人对上的进行化学修饰,得到了三个环孢菌素衍生 物,证实了位氨基酸的的氢被甲基取代或者甲基被氢取代免疫 抑制活性都会大大降低明见表.。‘ 表.不同环孢菌素的免疫抑制活性 事:十卜十:强;:中等;:弱;:没有活性第一章概论 . 的研究 加拿大公司设计合成了环孢菌素衍生物见图.。 此化合物是具有顺反异构体的混合物。药理学实验表明的肾毒性 比 低,用药天内血清肌苷水平没有明显上升见表,免疫抑制活性增 强见图.。 瑚 瑚 枷 聃 嘲 ??哪.噜,村 图. 结构及其与环孢菌素相比对抑制 表.环孢菌素,对雌性家兔血清肌苷水平变化的比较,, 进二步实验研究表明反式的免疫活性分别是顺式.的 .倍和的倍,目前已经进入用于肾移植时的抗排斥期临床研究和治 疗牛皮癣的期临床研究鲫,极有可能开发成新型免疫抑制药物。 . 具有的其它生物活性研究进展 抗炎作用:甲酰肽受体属于蛋白偶联受体。其参与了 宿主炎症反应口。研究显示,具有强的免疫抑制活性,也具有抑制甲酰肽 受体激动剂的作用,抑制其诱导的细胞脱颗粒、趋化性和钙动员等啪。 抗真菌作用:、最早是在筛选抗真菌活性产物中被发现的,但是 第一章概论 研究表明其抗真菌谱窄,只对少数真菌有作用,如链孢霉菌,粗 球孢子菌 等,但作用机制还不清楚眩。 转肿瘤多药耐药:环孢菌素系列化合物逆转肿瘤多药耐药的作用 机 制可能是它们与.糖蛋白,目前认为肿瘤多药耐药主要是由该蛋白的过 度表达引起的结合后抑制了的转运功能,或使分子变构降低了 与药物结合的亲和力,也可能是环孢菌素介导了非活性构象形式的募集, 导致与活性形式比例失衡所致瞳引。 实 抗寄生虫作用:在研究抗微口膜壳绦虫 验中发现,有抗该绦虫的作用。虽然目前实验证明环孢菌素与的结合 并非是抗寄生虫的重要因素但具体作用机制尚未明了口。 对人类免疫缺陷病毒?的作用:衣壳蛋白中的部分肽段能与甲 酰肽受体作用,如上的/,亮氨酸锌指结构域/、 、和肽段,上的两个肽段肽段和肽段等,结合 后它们能激活受体或和受体甲酰肽同源受体豫钊。 . 研究的前景 环孢菌素具有广泛的生物学活性如免疫抑制、抗真菌、抗寄生虫、抗 、抗炎、逆转肿瘤细胞多药耐药等作用。但是,由于其存在比较严重的肝 肾毒性以及溶解性差,治疗指数窄,生物利用度低等缺点影响了它在这些领域 的进一步应用。人们开始尝试对其结构进行改造合成了一系列化合物,并从中 寻找毒副作用低的免疫抑制剂或虽然无免疫抑制活性,但毒性低,具有其它生 物学活性的衍生物。对进行结构改造合成一系列衍生物,分离纯化后进行 活性和相应的构效关系分析,就可以为进一步开发成新的药物提供必要的 理论依据和实验数据。第二章实验 第二章实验 环孢菌素位上的氨基酸是化学结构修饰的一个重要位点,其 被修饰后各种衍生物的生物活性有较大的变’化。同时上具有较容 易被改造的羟基和双键官能团,所以本课题以为起始原料对其位上的氨 基酸结构进行修饰,得到其衍生物,经分离纯化和结构鉴定得到目标化合物; 并对和合成的衍生物进行免疫抑制活性淋巴细胞转化实验和体外抗真菌 活性的生物学检测;进行初步构效分析。 .合成实验 ..合成实验设计和路线 ... 实验设计 本实验根据环孢菌素的.位氨基酸的特点对其进行化学结构修 饰,引入其他基团,合成了个新的衍生物。 ...技术路线 .... ’.羰基’,’二羟基环孢菌素和’甲基甲砜醚一’一去 .丙烯基.’.羟甲基..环孢菌素的合成见图。 一 瓯 璺璺垄趋型堂? % % 了 研 .% 气 。 。 。? ?? . ,% .% 召~ 拶、、 图环孢菌素和环孢菌素的合成 ....’..丙烯基.’.甲酰一一环孢菌素的合成。的合成采 用臭氧直接氧化成醛,合成路线简单且收率高见图.。 .... ,.甲基..羟基.,.环氧..甲氨基.壬酸环孢菌素 .第二幸实验 和’,’.环氧..环孢菌素的合成见图.。 .... ’去丙烯基?’甲醛肟..环孢菌素,’.去.丙烯 基一’一甲醛腙.环孢菌素,.’.甲基.’.丁内酯。.甲氨基.乙酸. 环孢菌素和’去丙烯基一’.羟甲基..环孢菌素的合成见 图.。 丝坐出, .% .% ?/? .】% 蔓, 邕坐出, % .% 图环孢菌素和环孢菌素的合成 , 加热回流 . 九沁洲薯》如毗删 % 。.% \ 。 \弼 图环孢菌素 、、和的合成 ..合成实验过程 ...仪器和主要试剂、材料 .电加热磁力搅拌仪:集热式恒温磁力搅拌器浙江乐清,.集 热式恒温加热磁力搅拌器河南巩义 .旋转蒸发仪:.瑞士第二章实验 .氐温反应仪:.,.日本 型美国基因公司 .冷冻离心机: .纯水系统: 英国 .超声波清洗器:.昆山市超声波仪器厂 .硅胶板和硅胶板:青岛海洋化工厂 .环孢菌素是由福建省微生物研究所提供 .其余试剂从试剂公司购买为化学纯或分析纯 ...实验方法 .... 【’一羰基一’,’一二羟基环孢菌素和’一甲基甲砜醚一’去 丙烯基’一羟甲基一一环孢菌素的合成 ’.羰基..环孢菌素和’.甲基甲硫醚..环孢菌素的 合成 取化合物 ..无水乙酸酐.,室温搅拌后,加二 甲基亚砜,室温搅拌反应约。薄层层析跟踪反应进程,展开剂: 水饱和乙酸乙酯。环孢菌素.,产物.,产物.,反 应结束后,反应液用乙酸乙酯提取,有机层饱和盐水洗一次,加无 水硫酸钠干燥过夜,过滤后滤液真空干燥浓缩得白色粘状物。分 离提纯 溶剂体系正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水比例为:::得化合物 .收 率%和化合物 .收率.%。化合物:/:.】, .,.图?;,:,,,, ,。附图。化合物:/:.,.图 :., ;:,,,附图; ,,.,,附图;” :.,., .,.,.,。,.,.,,,.,.,.,., .,.,.,.,.,。,.,.,.,.,.,., .,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,., .,.附图。 第二章实验 图 化合物的和图谱 图 化合物的和图谱 ’.羰基.’,’.二羟基.环孢菌素的合成 取化合物 .力氧六环和水体积比为:的溶液, 室温搅拌后,加四氧化锇溶液..四氧化锇溶解在水中, 加.甲基吗啉.氧化物,室温搅拌反应约。点板观察反应展 开剂:水饱和乙酸乙酯,.,反应结束后,反应液用乙酸乙酯提 取,有机层饱和盐水洗一次,加无水硫酸钠干燥过夜,过滤后滤液 真空 第.二章实验 干燥浓缩得白色固体化合物 收率%,为一同分异构体。 分离提纯溶剂体系正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水比例为:::纯度 为.% 的化合物 .收率。%,? /:.,.【】 图?;:,,, ’附图; :.,.,.,.,.,.,.,., .,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,., .,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,., .,.,.,.,.,.,.附图。 图 化合物的和图谱 ’.甲基甲砜醚.’.去.丙烯基.’.甲酰..环孢菌素的合成 取化合物 ..姗加二氧六环和水体积比为:的溶液, 室温搅拌后,加四氧化锇溶液..四氧化锇溶解在水中, 力:.甲基吗啉.氧化物,室温搅拌反应约。后加高碘酸钠 . .,室温反应约。点板观察反应展开剂:水饱和乙酸乙酯, .,反应结束后,反应液用乙酸乙酯提取,有机层饱和盐水 洗一次,加无水硫酸钠干燥过夜,过滤后滤液真空干燥浓缩得白 色固体化合物 .收率.%。/:.】十,.,.】 图.;:,,,,,,,附 第一二章实验 图。 七 ‘ 化合物 ? 一 ?‘ ‘ . ? 卜。 ’左‘幽。壶。;。南’。’ 屉 图. 化合物的和图谱 ’.甲基甲砜醚一’去一丙烯基一’羟甲基一一环孢菌素的合成 取化合物 ..溶解在甲醇中,搅拌,加入硼 氢化钠.. ,继续搅拌约,点板水饱和乙酸乙 酯为展开液示反应完全,.,后加入. /盐酸中止反应。反应液 用乙酸乙酯提取,有机层饱和盐水洗一次,真空干燥浓缩得浅黄 色 固体,硅胶柱层析,丙酮和石油醚:溶剂为洗脱液,收集目标化合 物蒸干 得浅黄色固体化合物 .收率.%。/:., .,.】图;,,,,, ,附图; :.,,附图; :.,.,.,.,.,.,.,., .,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,., .,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,., .,.附图。第二审实验 图 化合物的和图谱 ....’一去?丙烯基一’一甲酰一环孢菌素的合成 取化合物 ..环孢菌素溶解于二氯甲烷中,在.。, 通臭氧氧化,维持臭氧气泡均匀产生,几分钟反应完全,反应液呈 淡蓝色,停 臭氧,再加入. 二甲基硫醚自然升至室温继续搅拌反应,蒸去溶 剂得 白色固体,收率:%。/:.,.图 .;:,,,以附图。 ....,甲基一.羟基一,一环氧一.甲氨基.壬酸】.环孢菌素和 ’,’.环氧.】.环孢菌素的合成。 ,一甲基一,一环氧一甲氨基一壬酮酸】环孢菌素的合成 取化合物 .. 和叔丁醇钾..溶解在丙酮 中,搅拌过夜,点板水饱和乙酸乙酯为展开液示反应完全,., 反应液蒸干后用乙酸乙酯和水提取,有机层饱用饱和盐水 洗一次,真空干燥浓缩得浅黄色粘状化合物,经分离提纯溶剂体 系 正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水比例为:::得浅黄色固体.收率. %。/:.】,.图.;:, ,,以附图; :.,,附图; :.,.,.,.,.,.,., 第二章实验 .,.,.,.,.,.,.,.,.,.,., .,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,., .,.,.附图。 .. 博草 / . . 化合物 一 一 ? . . .。 卜 。‖池?‘‖崩?诫 ‖尚?‘’尚”; 图. 化合物的和图谱 图. 化合物的和图谱 ,..甲基..羟基.,.环氧..甲氨基. 环孢菌素的合成 取化合物 ..溶解在甲醇中,搅拌,加入硼 氢化钠.. ,继续搅拌约,点板水饱和乙酸乙 第一二章实验 /盐酸中止反应。反应液用 酯为展开液示反应完全,.,加入. 乙酸乙酯提取,有机层饱和盐水洗一次,真空干燥浓缩得黄色油 状 物。经分离提纯溶剂体系正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水比例为::: 得浅黄色固体化合物 .收率.%。/:. .图?;:,,,,’附图; 附图;” :.,.,., .,.,.,.,.,.,.,.,.,.,., .,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,., .,.,.,.,.,.,.,.附图。 图. 化合物的和图谱 ’一羰基一’,’一环氧?一环孢菌素的合成 重铬酸吡啶盐的制备:溶于水中,缓慢向其中加入 吡啶,温度控制在以下,再加入丙酮,析出桔黄色结晶,抽滤干燥 后 得 .,收率%。 取化合物 .和重铬酸吡啶盐. 溶解在冰乙酸中,室温搅拌过夜,点板水饱和乙酸乙酯为展开液 示反 应完全,.,反应液蒸干后用乙酸乙酯水提取,有机层饱 用饱和盐水洗一次,真空干燥浓缩得棕白色固体化合物,经分 第二章实验 离提纯溶剂体系 正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水比例为:::得浅蓝色 固体 .收率%/:.,.,.】 图;:,,,,以附图; 附图; .,.,.,., .,.,.,.,.,.,.,.,.,.,., .,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,., .,.,.,.附图。 . .. 傅他 化合物 . 仙 吣 ? ? . 蛇 . : 图. 化合物的和图谱 ’,’.环氧.一环孢菌素的合成 取化合物 ..溶解在甲醇中,搅拌, ,继续搅拌约,点板水饱 加入硼氢化钠.. 和乙酸乙酯为展开液示反应完全,.,后加入. /盐酸中止反 应。反应液用乙酸乙酯提取,有机层饱和盐水洗一次,真空干燥浓 缩得白色固体化合物,. 收率.%,为个同分异构体。 分离提纯溶剂体系正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水比例为:::得其一 异构 体化合物,.收率.%,纯度为.%。/..】, .,.】图?;:,,,。 附图。 :.,.,.,.,.,., 第二章实验 .,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,., .,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,., .,.,.,.,.附图。 瞧...铂 。 .化合物 .? ? : . . .? ?~ .~ 一儿枷 ~’‘。’‘’‘ 。。。。‘。’。 口 图. 化合物的和图谱 .... ’.去丙烯基一’一甲醛肟一】一环孢菌素,【’去一丙烯 基.’.甲醛腙..环孢菌素,’甲基一一一甲氨基乙酸 环孢菌素和’一去一丙烯基一’.羟甲基】一环孢菌素的合成。 去.丙烯基一’甲醛肟环孢菌素拘合成 取盐酸羟胺溶解在.水中,振荡下逐滴加入., \ 水溶液,冷却备用。 取化合物 .溶解在在无水乙醇中,搅拌下逐滴加入上 述备用溶液,加热回流时,点板水饱和乙酸乙酯为展开液示反应 完全, .,反应液蒸干,溶于乙酸乙酯,饱和盐水和水各洗一 次,真空干燥浓缩得白色固体化合物 .收率。%。/: .】,.,.十图?;:,, ,‘附图; 附图; :.,.,.,.,.,.,.,.,., .,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,., 第二章实验 .,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.附图。 /。 :? . ‘ 娥.。 卜 『 ’ 。。‘。。。。。。。‘’’’’?‘ 。。‘。。一。。。& 图. 化合物的和图谱 ’.去.丙烯基一’.甲醛腙一.环孢菌素的合成 取化合物 .溶解在在无水乙醇中,搅拌下下逐 滴加入. %水合肼,搅拌过夜,点板水饱和乙酸乙酯为展开液示 反应完全,.,反应液蒸干,溶于乙酸乙酯,饱和盐水和水 各洗一次,真空干燥浓缩得白色固体化合物 .收率%。 /:.】,.,.图;: ,,, 。附图。 ’.甲基.’一丁内酯.甲氨基乙酸环孢菌素的合成 取化合物 .溶于冰乙酸中,加入三氧化铬. 和水,室温搅拌过夜,点板饱和乙酸乙酯为展开液示反 应完全后,反应液用乙酸乙酯提取,有机层饱和盐水洗一次, /: 真空干燥浓缩得白色固体化合物 收率.%。. .,.】图;如:,,,, 。附图? ..,.,.,.,., .。.,.,.,.,.,.,.,., .,., 第二章实验 .,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,., .,.,.,.,.,.,.,.附图。 图. 化合物的和图谱 图. 化合物的和图谱 “【’.去.丙烯基.’.羟甲基..环孢菌素的合成 取化合物 .溶解在甲醇中,搅拌,加入硼氢 第二:章实验 ,继续搅拌约,点板水饱和乙酸乙酯为 化钠. 展开液示反应完全,.,加入 /盐酸中止反应。反应液用乙酸 酯提取,有机层饱和盐水洗一次,真空干燥浓缩得白色固体化合 物 .收率.%。/:.】,.】, .图一;:,,,。附图; 附图; :.,.,.,., .,.,.,.,.,.,.,.,., .,., ,,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,., .,.,.,.,.附图。 图. 化合物的和图谱 .分离纯化 对合成的初产物初步处理后,采用液液萃取,硅胶柱层析,高速逆流色谱 和结晶等方法进行分离纯化。 ..分离纯化原理 ...硅胶柱层析的分离、提纯精制机理 柱层析硅胶胶体骨架的呈硅氧四面体结合,原子间的力场是平衡的。 硅胶有很高的比表面积,硅胶粒子内部孔隙的表面结构与形成的骨架内部结构 第二章实验 不同,表面的硅原子与胶体所含的结构水形成硅醇基。这种结构的不平衡性使 硅胶的表面产生自由力场,即对水分子或其他极性分子有吸附能力,被吸附物 质因分子极性强弱不同,胶体粒子表面对其表现的吸附力大小有不同程度的差 别。故不同物质的混合物因在通过硅胶过程中因保留时间的差别 而得到分离瞳。 ...高速逆流色谱分离原理 高速逆流色谱 ,简称是 世纪年代在液.液分配色谱基础上发展起来的新型分离技术,高速逆流色 谱利用螺旋柱在高速行星运动时产生的巨大离心力,使螺旋柱中互不相溶的两 相不断混合,同时保留其中的一相作为固定相,将另一相作为流动相用恒流泵 连续输入,随流动相进入螺旋柱的溶质在两相间反复分配,按其在两相中分配 系数的大小而依次得到分离啪。 ..分离纯化过程 ...实验材料 .正己烷:国药集团化学试剂有限公司,分析纯 .乙酸乙酯:汕头达濠精细化学品公司,分析纯 .甲醇:汕头达濠精细化学品公司,分析纯 。 .水:蒸馏水 .硅胶目:青岛海洋化工厂 .高速逆流色谱:.型高速逆流色谱同田生化 .高效液相色谱仪:.日本岛津.自动分部收集器:. 上海泸西分析仪器厂 ...实验方法 ....硅胶柱层析的分离、提纯 化合物的分离纯化中,应用了硅胶柱层析,方法为:取约硅胶 .目与丙酮搅拌混匀至浆状,分次加入色谱柱中。取 溶 于丙酮中并加入少量硅胶搅拌均匀,放置至溶剂挥发完后填入色谱柱的上 层。以丙酮和石油醚比例为:溶剂为洗脱液,收集洗脱液,合并水饱 和乙酸乙酯为展开液检测含化合物的洗脱液,真空干燥浓缩得浅黄色固体 . 收率.%。 第二章实验 ....高速逆流色谱分离 .溶剂体系的选择 溶剂系统的选择对于高速逆流色谱分离样品十分关键,要求溶剂可分层、被 分离的溶质的分配系数:上相样品浓度/下相样品浓度范围在,,分离的 两个化合物的分离度.?’。以高速逆流色谱分离化合物为例说 明。 按溶剂体系筛选方法,首先选择正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水比例为:: :配制一定量的两相溶剂,静置分层。计算值:取上相于小试管,加入 毫克样品摇匀定为“原上相”,取该原上相于另一小试管中,并加入下相 ,上下振荡次,静置分层,计算分层需要时间秒秒,否则固定 相保留率过小,分层后上相定为“后上相”。分别取“原上相”和“后上相”溶液进行 检测,化合物和在“原上相”和“后上相”溶液中峰高分别为原、后和 原、后。分配系数后/原.后.;后/原.后.。 两个异构体分离度/.。该溶剂体系和,出峰时间较晚,不 适合。 下一步试验方法中脂溶性稍弱的溶剂体系,选择正己烷:乙酸乙酯:甲醇: 水比例为:::体系,按上述方法测定。,.,/。。 该体系分配系数符合要求,.。因此选择‘:::系。 其它化合物溶剂体系均为正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水的体系的选择方 法同上,具体见表.。 固定相保留率的测定 按文献?’进行固定相保留率的测定。将固定相泵满螺旋柱,开启色谱仪, 调节转速正转,然后以恒定速度将流动相泵入螺旋柱,收集主机出口流出的 固定相。当主机出口流出流动相时,螺旋柱内固定相和流动相己达到动力学平 衡状态,此时测量被流动相推出的固定相体积出,按下式计算固定相保留率 定相保留率必须?%,否则该溶剂系统不适用。 总?出/总×% 出一流动相推出的固定相体积 式中:意一管路总体积 样品分离、收集和检测 第二章实验 称取一定量样品,用流动相下相配成的样品溶液,在固定相和流 动相达到平衡状态后,由进样阀将样品溶液引入螺旋柱,用流动相以一定的流速 洗脱,用分部收集器收集,每收集一管。 将收集到的各试管进行高效液相色谱分析,根据分析结果合并相同化合物, 真空干燥浓缩可得分离后化合物。各化合物高速逆流色谱分离方 法见表。。 表环孢菌素衍生物的分离 幸指正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水体系 .结构鉴定 本课题合成的一系列衍生物均是以为初始化合物。由十一个氨基 酸组成的环状多肽,除了第一位氨基酸具有双键和羟基外,其它氨基酸 不具有活泼基团,所以主要通过熔点、高效液相色谱检测其纯度;通过熔点、 高效液相色谱、质谱、红外光谱以及核磁共振来鉴别化合物和进行结构确定。 ..结构鉴定原理 ...熔点测定 熔点的测定可用于鉴别有机化合物,还可以作为该物质的纯度标志。 。 ...高效液相色谱检测 高效液相色谱在经典液相色谱法的基础上,以高压输送流动相,采用高效第二章实验 固定相及高灵敏度检测器的现代液相色谱分析方法。具有分离效率高、选择性 好、检测灵敏度高、操作自动化和应用范围广的特点九。 ...质谱测定分子量 质谱分析法利用离子化技术,将物质分子转化为离子,按其质荷比 /,离子质量与电荷之比的差异分离测定,从而进行物质成分和结构分析 的方法四。 ...红外光谱测定 红外吸收广谱是用波长.~的电磁波照射样品,引起样品分子的 振动、转动能级的跃迁,在跃迁中吸收了能级相当的能量的光子形成的。分子 的结构不同,出现的吸收广谱也不同,由此进行化合物的定性分析啪。 ..结构鉴定过程 ...实验仪器 .熔点仪:.瑞士熔点未校正 .高效液相色谱仪:.日本岛津.液质联用仪/: 型液质联用仪美国 .傅立叶变换红外光谱仪: 美国 .核磁共振氢谱和碳谱由中科院昆明植物研究所测定 ...实验方法 ....样品的熔点测定 用一端封口玻璃毛细管内径...的开口一端插料,翻转毛细管, 自由下落以堆实样品至高度约为,同法准备相同样品的毛细管根, 分别 放入熔点仪测定,计算其平均值为该样品熔点。 ....样品的高效液相色谱测定 高效液相色谱条件为: 色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶为填料 流动相:.甲醇.水::化合物、、;.甲醇.水::化合物、、 、.、、;.乙腈:水:乙醚:甲酸:::化合物、 流速:./笫二章实验 柱温:? 检测波长: ....样品的质谱测定 质谱条件为: 常谱扫描范围:? 分辨率: 质量分析仪: 电离方式: ....样品的红外光谱测定 各取样品.和色谱级溴化钾在红外灯下,磨成粉状,混合均匀, 用压片机在.压力下压成半透明薄片,红外光谱仪扫描完背景后 将之 放入红外光谱仪样品槽,进行扫描次。 ....化合物的核磁共振氢谱和碳谱 由中科院昆明植物研究所测定见附图。 .生物活性检测 自环孢菌素作为免疫抑制剂广泛应用以来,在多达近种真菌的次级 代谢产物中分离得到多种环孢菌素类化合物,世界上已报道的天然和半合成的 环孢菌素及其衍生物己超过个。除外其他的一些有免疫抑制活性的环 孢菌素类化合物也具有抗真菌作用,因此,一般在开发研究新的免疫抑制剂时 将体外免疫抑制活性和抗真菌活性筛选相结合。 ..生物活性检测原理 ...免疫抑制活性试验 淋巴细胞增殖和分化是机体免疫应答过程的一个重要阶段,因此,检测淋 巴细胞增殖水平是细胞免疫研究和免疫功能检测的一种常用方法。细胞表面 具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体,在特异性抗原刺激下可使淋巴细胞克 隆发生增殖叫。本课题通过特异性抗原刀豆蛋白的刺激下,检测样 品对混合淋巴细胞增殖的抑制比色法来对所合成化合物进行了 免疫抑 制活性的测定。 第二章实验 ...体外抗真菌试验 目前评价真菌对药物敏感性的方法就是测定药物的最低抑菌浓 度。本 实验采用半固体琼脂法,参考相关文献呤选择了株真菌,对所得 化合物进行 的测定。 ..生物活性检测过程 ...实验仪器及材料 .电磁炉: .高压灭菌器 .恒温培养箱 .培养箱:? .酶标仪:型美国 .小鼠:清洁级昆明小鼠 . ...实验方法 ....免疫抑制活性检测 溶液配制 ‘培养基 . 谷氨酰胺. . . .巯基乙醇? .斗 氨苄青霉素 . 硫酸链霉素 .魄 丙酮酸钠 . 双蒸水 制备小鼠脾淋巴细胞悬液 无菌取清洁级昆明小鼠?的脾脏,置盛放有培养液的平皿中, 用玻璃注射器柄将脾脏轻轻挤过目筛网,用吸管充分吹打后,吸 取液体到第.二章实验 离心管,离心分钟,沉淀物用培养液洗涤,离 心分钟,重复一次,沉淀物用完全培养液调整细胞浓度至个/。 三刀豆蛋白诱导的小鼠淋巴细胞转化 各样品用 培养液配成/、/、 /、/, 每孔%加入在孔细胞培养板样品终浓度分别为/、/、 /、/,上述小鼠脾淋巴细胞悬液每孔加,/的 每:办 %。其中单加%细胞悬液的作为空白对照,加有细胞悬 液和/的作为对照。加好样的孔细胞培养板置?, %培养箱培养小时。终止培养前小时每孔加入/, 继续培养小时,甩弃上清夜,每孔加入二甲基亚砜,用酶标 仪测定样品的光吸收值,计算样品对淋巴细胞反应的抑制率: ‘ 一~ 型掣畿蒜蔫笋枷。% 以对照的?四均值 ....体外抗真菌活性实验 测定菌菌悬液制备 本课题参考有关文献碱引,共选择了株真菌菌株作为试验菌株, 如下: .尖镰孢 . . .粗糙脉孢菌 .链格孢 ? . .根霉 . .娄地青霉菌 . .木霉 . .毛霉 . .黑曲霉 福建省微生物研究所提供 .烟曲霉 福建省微生物研究所提供 .白色念珠菌 福建省微生物研究所提供 .啤酒酵母 福建省微生物研究所提供 .红酵母 福建省微生物研究所提供第一二章实验 将真菌接入沙氏琼脂葡萄糖 .,蛋白胨.,琼脂 .,蒸馏水. 斜面,?培养天,长好的斜面菌苔分别用适量的%甘油溶液 洗下,玻璃珠打匀黑曲霉悬液无菌过滤,分装在/管,。 保存备用。 体外抗真菌活性测定 配制马铃薯葡萄糖培养基。成分刁铃薯,葡萄糖,琼脂, 蒸馏水. 。将马铃薯去皮切块,加蒸馏水,煮沸~。 用纱布过滤,补加蒸馏水至。加葡萄糖和琼脂,加热溶化,分装,? 高压灭菌。 将样品用无水乙醇配成的/、“/、./、 /、./、./、./、.肛/的溶液。溶 液分别倒入各个培养皿,各加入上述马铃薯培养基经加热溶化冷却至?左右 的,加入同时与样品溶液摇匀样品终浓度分别为/、/、 灶/、/、./、../、./、./。凝固 后在培养皿背后划好格以区分各个区域,在各格对应区域的培养基表面移入 测定菌菌悬液。分钟后将平板置?的培养箱培养天,培养结束观察各样 品不同浓度对不同真菌的生长抑制情况。能抑制真菌生长的最低浓度为该样品 的最低抑菌浓度。 第二三章结果和讨论 第三章结果和讨论 .合成实验 合成并分离纯化了文献未报道的个衍生物。化合物’一去一 丙烯基.’.甲酰.环孢菌素作为一个活性中间体可以与多种的亲核 试剂反应得到不同的衍生物,为进一步合成衍生物提供了基础。 本文在合成’羰基一环孢菌素时,对专利文献操作过程 进行优化,专利报道是利用二甲基硫醚和.氯代琥珀酰亚胺,在低温条件下对 的’.羟基氧化?,试剂毒性大,操作条件要求高。本文对其进行 改良,采 用.法在常温下直接对其氧化,合成路线简单,操作条件要求较低。 .分离纯化 建立了以硅胶柱色谱、高速逆流色谱和高效液相色谱等现代分离技术为主 的分离纯化方法,对合成得到的化合物进行有效的纯化,具体见表.。 表.:化合物在逆流后纯度的提高 .结构鉴定 本课题是以为出发化合物合成的一系列衍生物。主要通过熔点、高效 液相色谱检测其纯度;通过熔点、高效液相色谱、质谱、红外光谱以及核磁共 振来鉴别化合物和结构确定。其物化性质和光谱数据见表?和表.。高效液 相色谱、质谱、红外和光谱解析见第三章中描述。 第三章结果和讨论 表.:化合物的分子式、纯度、产率和物理性质 表.:化合物的光谱数据 第二三章结果和讨论 ,,,,,,,,,,, . ,,, ?流动相:.甲醇.水::化合物、、;.甲醇水::化合物、、、、 、;.乙腈:水:乙醚:甲酸:::化合物、 .生物活性检测 ..免疫抑制活性检测 本文对合成的个化合物,以化合物为对照,检测样品浓度分别 为/、/、/和/时对淋巴细胞转化的抑制情 况。具体见表.和表.化合物、.、、和抑制不明显未列出。 表样品对淋巴细胞转化的抑制率% . . . . .... ... . .第三章 结果和讨论 由结果可以表明: .环孢菌素的位氨基酸上’羟基被氧化合成化合物,其无 免疫抑制活性。化合物的双键氧化成邻二羟基得到化合物,发现 其存在免 疫抑制活性,但较下降。说明在化合物双键位置引入双羟基可以 保持 的部分免疫抑制活性: .化合物是’羟基被甲基甲硫醚取代,化合物上的双键断裂合成了 化合物,化合物经还原得到了化合物。它们的活性下降到几乎没 有; .新的环孢菌素衍生物是将 中的氧原子与 位碳原子相 连形成五元环氧化合物,并在’位引入羰基,其存在免疫抑制活性,但较 降低。化合物是将化合物中的羰基还原成羟基,免疫抑制活性消失; , .新的环孢菌素衍生物是将的氧化成羰基,并将 双键环氧化,其存在免疫抑制活性,但较降低。化合物是将化合物 中的羰基还原成羟基,结构与相比只是双键被环氧化,其免疫抑制活性消 失,说明环孢菌素双键环氧化免疫抑制活性下降。 .合成的新环孢菌素衍生物和利用了生物电子等排原理,用 来取代,虽有免疫抑制活性,但都较下降。化合物和的免疫抑 制活性相差较多,化合物是碳氮双键上连接胺基,胺基上的氮原子的吸电子 诱导效应相对较弱,而给电子共轭效应相对较强;化合物是碳氮双键上连接 羟基,羟基氧原子的吸电子诱导效应相对较强,而给电子的共轭效应相对较弱。第三章结果和讨论 的免疫抑制活性较强,说明吸电子诱导效应相对较强时,免疫抑制活性 可能增强。但两者活性仍较低,说明环孢菌素的术端将碳碳双 键用碳氮双键取代,其免疫抑制活性下降; .在环孢菌素的位氨基酸上双键氧化成醛得到化合物,其 免疫抑制活性基本消失,化合物经还原后得到的化合物有免疫抑 制作用, 但与相比活性下降。 ..体外抗真菌活性实验结果和讨论 本文对合成的个化合物,以化合物为对照,检测样品浓度分别 为/./、./、/、/、./、./、../、 /、././时在马铃薯葡萄糖培养基上对株真菌菌株的生长抑制情 况。结果见表..和..。 表? 化合物对真菌菌株的生长抑制情况第三章结果和讨论 表一. 化合物对真菌菌株的生长抑制情况 由抗真菌实验结果可知: 化合物对尖镰孢抑制作用较略强,而化合物、、、、和 对尖镰孢抑制作用与相当;所有的化合物对链格孢的抑制作用与 相当;化合物对娄地青霉菌抑制作用较略强;化合物、、、、、 和对木霉的抑制作用较强,而化合物对木霉的抑制作用与 相当;化合物、、、和对毛霉的抑制作用较强,化合物 对毛霉的抑制作用与相当。说明所得环孢菌素衍生物的抗真菌谱 窄,只 对少数真菌有作用,不同结构的衍生物对真菌的作用具有选择性, 其抗真菌作 用的构效关系与淋巴细胞转化抑制的构效关系是不同的。第网章结论 第四章结论 本课题以为原料,以结构中位上的氨基酸一作为结构修饰的 位点,合成并分离纯化了文献未报道的个衍生物,并对和合成的 化合物进行了体外淋巴细胞转化抑制和对真菌生长抑制活性研究。 .合成并分离纯化了文献未报道的个衍生物。其中化合物的合 成对专利文献操作进行改良,采用.法在常温下直接对’.羟基氧化, 合成路线简单,操作条件要求较低。 .建立了以硅胶柱色谱、高速逆流色谱和高效液相色谱等现代分离技术为 主的分离纯化方法,对合成得到的化合物进行了有效而快速的纯化,纯度均有 较大提高。 .本文对合成的个化合物对淋巴细胞转化的抑制情况表明:合成的衍 生物对淋巴细胞转化的抑制活性均不高于环孢菌素,但结构中一些基团 改变后抑制活性有明显的变化。通过对其结构和活性变化的关系 分析,初步得 到一些构效关系的结论,为进一步的研究提供依据。 .合成的化合物对体外株真菌菌株的生长抑制实验表明:所得衍 生物的抗真菌谱窄,只对少数真菌有作用,所有的化合物都对链 格孢有较强的 抑制作用,化合物、、、、、和对木霉有较强的抑制作用,化合 物和对毛霉有较强的抑制作用。实验结果说明抗真菌作用的构效 关系与淋巴细胞转化抑制的构效关系是不同的。参考义献 参考文献 删 八, .删 【】 ,,:. . 林永勉,郑孝贤等.环孢菌素两种不同产生菌原生质体的制备和 再生. 中国抗生素杂志,,:.. 【】 陈代杰编.微生物药物学.上海:华东理工大学出版社.,. ? .., ., ’ . , ,:. ..., :. , , . ... .., ,,:... 】. ,,:. 季新燕,温耀明,陈振伟等.环孢素的生物学活性及其衍生物的研 究进展. 国外医药抗生素分册,,:.. 】 郑卫,卓锦明,翁其香等.茄病镰刀菌产生的环孢菌素的研究一 分离纯 化和结构鉴别.中国抗生素杂志,,:. 方金瑞,任林英,唐信东等.环孢菌素的分离和鉴别.抗生素,, ’ :. . , , 榔 同埘】 ..,,:. ... : . . ,,: 洪丽娜等.镰刀菌?产生的环孢菌素提取、分离纯化和鉴别.抗生素, ,:. 方金瑞等.镰刀菌.产生的环孢菌素和的分离、性质和化学结构