蛋白质含量测定

蛋白质含量测定 蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法) 一. 目的 学习和掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和。 二. 原理 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量属于一种染料结合法。考马斯亮蓝G-250是一种蛋白染料，。它在游离状态下最大吸收波长为464nm。 由于它所含的疏水基团与蛋白质的疏水微区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合。当它与蛋白质结合后形成蓝色的蛋白质-染料复合物，其最大吸收波长变为595nm。这种结合在2分钟左右达到平衡，生成的复合物在1小时内保持稳定。 在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，所以可用于蛋白质含量的测定。该方法非常灵敏，蛋白质最低检测量为5mg，而且此法操作简便、快速，干扰物质少，是常用的蛋白质定量方法。但染料易吸附在比色杯上而造成误差，每次更换检测样液时，应及时用乙醇洗涤比色皿，再用蒸馏水冲洗残留的乙醇。 三. 实验及设备 1. 材料: 包心菜 2. 仪器:分光光度计 离心机 电子天平 3. 器材:刻度试管: 25mL×9 刻度试管: 10mL×1 移液管: 1mL×3 20mL×1 烧杯: 250mL×2 50mL×1 离心管:10mL×1 滴管:2 洗耳球:2 研钵、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒:各1 四. 试剂的配制 1. 牛血清白蛋白(BSA)液(100mg/mL) 精确称取10mg牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解后定容至100mL。 2. 考马斯亮蓝G-250染色液 取0.10g考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 95%的乙醇中，加入100mL 85%的正磷酸，再用蒸馏水定容到1000mL。过滤待用。该试剂于常温下可保存1个月。 五. 操作步骤 1. 样品液的制备 (1) 取材:称包心菜叶片1.0g左右，准确记 录其质量 g。 (2) 研磨:将样品置于研钵中，研磨成匀浆后， 准确加20mL蒸馏水。 (3) 提取:将上述匀浆液在研钵内浸提10分 钟，不断搅拌，使蛋白质充分溶解在水中(注 意，已定容，所以在没搅匀之前不能损失样液)。 (4) 离心:将部分浸提液转移到10mL离心管 里，以10000转/分钟离心10分钟。 (5) 分离:将上清液倒入至干净的小试管里， 备用。 2. 标准曲线制作及样品测定 取9支试管，按下所示顺序操作。 六. 结果处理 1. 由0,5号管的数据，以蛋白质含量(mg)为横坐标，A595为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线; 2. 求样品管A595的平均值A595; 3. 由平均值A595从标准曲线中求样品管中蛋白质的含量(mg); 4. 计算你所取生物材料中蛋白质的含量(单位用mg/g鲜重)。 七. 思考题 1. 用本实验方法所得的测定值与样品的实际值之间若有误差，主要是由什么原因引起的, 2. 常见的测定蛋白质的方法还有哪些,比较几种测定蛋白质常用方法的优缺点,