艾滋病疫苗的研究进展

[3]陈世凯. 小半夏汤治疗化疗所致呕吐的体会. 四川中医. 1994，（2）：18 艾滋病疫苗的研究进展 郭选贤 苏芳静 （河南中医学院艾滋病研究所 450008） 摘要 自发现 HIV 是 AIDS 的病因以来，科学家们为开发艾滋病疫苗进行了 20 余 年的潜心研究，取得了重大的进展,他们认为研制出安全、有效的疫苗是阻止艾 滋病流行的唯一可能的途径。目前研制的艾滋病疫苗主要有：HIV 灭活病毒粒子 疫苗、减毒活病毒疫苗、合成肽疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗、DNA 疫苗等。本 文综述了各种疫苗的研究进展及其作用和特点。 关键词 艾滋病；免疫系统；疫苗 艾滋病（AIDS）：即获得性免疫缺陷综合症。其病原体为人类免疫缺陷病毒 （HIV）。人体感染 HIV 后，造成持续性的免疫功能低下、并引发一系列的免疫 缺陷综合症，最终导致死亡。据联合国艾滋病规划署的最新报道，目前 HIV 以 每天 15000 人的速度快速扩散传播，其中 95％以上发生在发展中国家。迄今为 止，宣传及对高危行为的干预仅起到减缓传播速度的作用，高效抗病毒疗法价 格昂贵且不能清除体内的病毒。鉴于上述，控制 HIV 流行最好的办法是发展有 效的艾滋病疫苗。 现有的疫苗还不能有效地刺激肌体产生广泛中和 HIV 毒株的抗体，但基于 过去制备病毒性疫苗的成功经验及对 HIV 生物学和病理学的认识，特别是对 HIV 包膜蛋白结构的研究进展，以及 HIV－1 保护性免疫和疫苗研制的状况的了解， 制备出更安全、更有效的 HIV 疫苗已为期不远了。 1.HIV 疫苗的种类 1.1 HIV 灭活病毒粒子疫苗：经验证明，用各种佐剂携带灭活的完整病毒粒子作 为疫苗，可在人体内产生抗病毒免疫。用 SIV 灭活疫苗接种黑猩猩后，再用大 剂量的 SIV 攻击，动物体内出现抗 SIV 抗体，SIV 逐渐从血液中消失，而对照动 物病情不断恶化，最终死亡。将灭活的 HIV 疫苗注射病人后，可使病人血清阳 转，但不少人对这种灭活的疫苗的安全性示怀疑，而且，目前还难以证实这 种疫苗能否有效地诱导机体产生抗 HIV 的细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）免疫应答。 1.2 减毒活病毒疫苗：对活病毒进行改造，减少其致病性，并用作疫苗可以产 生与天然病毒相同的细胞免疫和体液免疫，早在 1992 年就有学者提出此疫苗的 设想，并在恒河猴中进行验证。Hayami 等用基因突变的方法使 HIV-1/SIV 减毒， 期望这种减毒疫苗能够用于人体实验，而且目前在治疗艾滋病的医生中也有主 张推行活疫苗试验的。但有些学者对减毒活疫苗的安全性表示怀疑，由于 HIV-1 是变异快的病毒，人们始终担心这种减毒活疫苗的潜在的恢复其致病性的能力， 但大多数学者的意见是应当继续加强对 HIV 减毒活疫苗的研究。 1.3 合成肽疫苗：用 HIV-1envV3区合成肽制备的单克隆抗体在体外能部分抑制 gp120 与 CD4分子的结合，V3肽可以刺激动物和人产生抗 HIV 中和抗体和 CTL 应 答。最近有资料说明，给 11 名 HIV 血清阴性个体注射 p17 合成肽疫苗，结果受 试者的细胞免疫应答均得到明显增强，但由于 V3区的氨基酸排列在不同株间有 一定差异，使研究疫苗有一定的困难。 1.4 活载体疫苗：将编码病毒蛋白的基因插入其他病毒或细胞基因组中并用之 感染动物或人体，可产生对基因产物及载体的免疫反应。这种基于重组有机体 的疫苗具有潜在的免疫原性，而无原病毒引起的病理反应。目前较为理想的活 载体疫苗是以痘苗病毒和金丝雀痘病毒为载体的重组疫苗。将 HIV 基因插入痘 病毒基因组中，并感染猕猴，猕猴体内产生了针对 HIV 的特异性细胞和体液免 疫反应。一个表达多种 B 亚型 HIV 蛋白的重组痘苗载体在美国已经进入 I 期试 验。金丝雀痘病毒是天花病毒的一种非致病性近亲，它能进入人体细胞但不能 组装成新的病毒粒子，以它为载体，插入 HIV-1 包膜蛋白基因和 gag 基因，并 用其对 300 多名志愿者进行免疫，可在 70％的人中检测到低滴度的对包膜蛋白 和 gag 的特异性抗体，29％的人中可测到特异性的细胞免疫应答。在美国一些 重组的金丝雀痘病毒已经进入 I期和 II期临床试验，并证明这种疫苗是安全的。 还有报道用腺病毒的单链 RNA 病毒作载体的 HIV 疫苗，腺病毒具有产生粘膜免 疫的能力，而粘膜免疫对防止 HIV 感染是非常重要的，在研究中将选用缺失了 更多有害基因的，已用于基因治疗的腺病毒载体。 1.5 核酸疫苗：核酸疫苗是近年来 HIV 疫苗研究的热点之一，包括 DNA 疫苗和 RNA 疫苗，用插入并表达免疫基因的质粒 DNA 直接注射到体内是一种有效的疫苗 途径。用由 HIV 抗原基因和作为真核细胞表达载体构成的重组质粒免疫动物， 可诱导的特异性抗体产生，同时还观察到特异性 T 淋巴细胞增殖应答和 CTL 应 答。这种疫苗最大的优点是兼有亚单位疫苗的安全性及减毒活疫苗的有效性， 在防治 HIV 感染中具有良好的前景。HIV 核酸疫苗在美国已被批准进入临床试 验，如已有 HIV-1 的 DNA 疫苗进入人体试验阶段。虽然核酸疫苗也存在安全问 题，但核酸疫苗以天然抗原形式被免疫系统识别可激活全面持久的细胞免疫和 体液免疫，且易于构建，热稳定性好，不在体内复制等优点而引起人们的广泛 兴趣。 1.6 亚单位巨分子颗粒化疫苗：这种疫苗是有一种或一种以上，但又不是全部 HIV 蛋白非传染性颗粒构成的疫苗。如 gag 蛋白，它是 HIV 的主要结构蛋白之一， 它既能诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，又能自我装配成病毒样粒子，而且 这种自我装配的功能不因外源基因的嵌合而丧失，即使在病毒粒子的其他成分 缺失的情况下,仍具有自我装配的功能，用这种病毒样粒子作疫苗既安全又能向 免疫系统呈示与天然病毒颗粒相同的抗原，能诱导机体产生持久的免疫应答。 目前，对巨分子颗粒化疫苗的研究主要对象是对 gag、gag-pol、gag-env、及 gag-pol-env 的重组基因表达，其中 gag-env 是目前研究的热点。人们对 gag 蛋白之间如何互相结合，最后形成病毒颗粒了解甚少，这影响了此类疫苗的研 究进程，但这类疫苗是 HIV 疫苗研究的一个很有潜力的领域。 1.7 抗独特型抗体疫苗：抗独特型（Id）抗体，是另一种新型 HIV 疫苗，它是 将抗独特型的抗体用于替代某种抗原作为免疫原，所以它不含 HIV 基因和蛋白。 和抗原结合的抗体的 V 区部位，具有模拟抗原决定族的空间构象，它在体内会 起到和抗原相似的作用，也刺激机体产生相应的抗体。如用 HIVgp120 的中和抗 体和抗 CD4单克隆抗体为抗原，经两条途径制备抗 Id 疫苗，现在 CD4Id 抗体疫 苗已开始进行 II 期临床试验。 1.8 DNA 疫苗 1992 年，Tang 等首先经鼠皮肤直接接种编码外源蛋白的质粒 DNA，发现这种免疫方式也能使肌体产生抗体应答，证实“裸”DNA 可以通过抗 原表达作为免疫原。其后，在小鼠试验中，肌内注射编码流感病毒核心抗原蛋 白的质粒 DNA 进一步证实 DNA 疫苗能够保护流感病毒株的攻击，从而开辟了疫 苗发展的新纪元，被称为疫苗发展的第三次革命。DNA 免疫可诱发细胞和体液免 疫应答，包括产生抗原特异性的 CTL 和 CD4+T 细胞,现已证实该类疫苗可抗多种 传染病. 1.8.1 DNA 疫苗的抗原表达、处理和提呈 使用不同方法和途径注射质粒 DNA 均能诱导细胞和体液免疫应答，均可产生中和抗体和 CTL，表明 DNA 免疫类似于 减毒活疫苗或重组疫苗的免疫作用。 质粒 DNA 免疫途径可经皮内、皮下、粘膜或肌肉等。目前为主的免疫方式 有两类，一是使用基因枪，通过高压氨气将包被在金颗粒上的 DNA 直接注入上 皮细胞细胞浆；二是采用针注方式或无针注射方式将溶于生理盐水的 DNA 注入 皮内或肌肉，DNA 通过细胞间隙被吸收。用基因枪免疫一般只需纳克量 DNA,而 注射式则需 25－100μg，两者相差 5000 倍以上.DNA 疫苗的免疫机制尚不清楚， 一般认为：DNA 疫苗所使用的质粒都含有在真核细胞表达的启动子，如来源于呼 吸道合胞病毒（RSV）的 SV40 或 CMV 启动子，由这些启动子构建的质粒 DNA 均 能在哺乳细胞中高水平的表达外源蛋白，而肌细胞含有肌质网和 T 小管系统， 该系统含有细胞外液并能伸入到细胞内部。肌细胞通过 T 小管和膜穴样内陷将 质粒纳入，这样质粒就象天然病毒感染一样激活免疫系统，质粒 DNA 在细胞内 表达抗原蛋白，一部分留在细胞内作为内源蛋白，另一部分分泌到细胞外成为 胞外蛋白。胞外蛋白首先刺激 B 淋巴细胞，诱导特异性体液免疫应答，其次被 巨噬细胞及或树突状细胞吞噬处理，与 MHCII 类分子结合形成抗原复合物，提 呈到细胞表面后被 CD4+T 细胞所识别，并使之激活释放细胞因子，调节细胞和体 液免疫应答。内源蛋白经蛋白酶体降解成短肽后，在内质网内与β-微球蛋白及 MHCI 类分子结合形成三元复合物，再经高尔基体转运至细胞膜上，被 CD8+限制 的 T 细胞识别并使之激活而成为 HIV 特异的 CTL，引出细胞免疫应答。 1.8.2 DNA 疫苗的优化 DNA 疫苗的免疫可引出啮齿类动物的强烈、持久的细 胞和体液免疫应答，但在非人灵长类动物中的免疫应答不强。Boyer 等在志愿者 中进行 I 期临床试验，在 0、4、8 和 24 周肌肉注射 300μg 虽可引起受试者的 低或中度的 T 细胞免疫应答，但都不能持久，说明需要进一步提高 DNA 疫苗的 免疫原性。目前主要通过两个方面来解决，一是优化 DNA 疫苗本身，二是采用 启动——加强免疫策略来改进。 DNA 疫苗的优化主要采用两个办法：（1）把 IL-2 细胞因子作为 DNA 疫苗的 佐剂，或将表达 IL-2 的质粒 DNA 与 DNA 疫苗同时免疫。Barouch 等使用编码 IL-2/Ig 的质粒 DNA 或 IL-2 融合蛋白在恒河猴中进行免疫扩增效果的研究，在 第 0、4、8 和 40 周以无针肌注方式免疫 DNA，其中，结果同时使用 IL-2/Ig 的 质粒 DNA 的试验组能够产生强烈和持久的免疫应答，并具有很好的免疫记忆应 答反应，能够很好控制强致病性毒株（SIV89.6P）攻击后的病毒血症，改善临 床症状。（2）优化外源 DNA 基因，提高其在哺乳动物细胞中的表达水平。HIVenv 和 gag 等基因富含 AU 碱基，通过点突变将氨基酸三联密码子最后一个摇摆碱基 的 U 改成 C,这种改造方式不改变蛋白的序列，但很有利于外源基因在哺乳细胞 中的表达，与未优化的基因表达比较，产量可提高 10％以上。 目前实施的启动－加强免疫策略也有两种方式。（1）DNA 疫苗启动－重组蛋 白加强免疫方式。美国麻省医学院核酸疫苗研究的 Lu 等使用基因枪经皮内传递 DNA，在 0、4、8 周各免疫一次，2 周后，再用在 CHO 细胞中产生的重组 gp120 肌注，通过这种免疫方式，在小鼠、大鼠、兔和恒河猴中都产生了高效价特异 性抗体和 CTL，现在他们正准备 I 期临床试验。（2）DNA 疫苗启动－重组 MVA 痘 苗病毒加强。应用 SHIV-恒河猴模型，Amara 等在 0 和 8 周两次单用表达多种 SIV 蛋白（gag、pol、vif、vpx、和 vpr）和 HIV-189.6envR DNA 免疫，然后在第 24 周用编码重组 SIVgag、pol、HIV-env 蛋白的 MVA 活载体疫苗加强；采用 250 μg 或 2.5mg 剂量以非针注射式经皮内或肌内途径免疫，MVA 加强免疫使用针式 注射器分别经皮内或肌内途径免疫。DNA 免疫仅产生低水平的 HIV-1 抗原特异性 的 CTL 和中和抗体，在加强免疫后一周，CTL 计数及中和抗体效价均升高，随后 又逐渐降至低水平。在加强免疫 7 个月后，用 SHIV-89.6P 经直肠内攻击所有恒 河猴，两星期后，疫苗免疫组血浆病毒载量至少 10 倍低于对照组，CTL 和中和 抗体效价均达最高峰，在毒株攻击 23 周后，对照组 4 只动物有 3 只死于 AIDS， 所有 24 只免疫动物均保持健康状况。证明 DNA/MVA 免疫能够使动物保持很好的 记忆应答来抗高致病性病毒经粘膜的攻击，而所用 DNA 疫苗的剂量高低及免疫 途径对保护作用影响不大。 1.8.3 DNA 疫苗可能出现的问题 DNA 疫苗仅在近几年取得了快速发展，影响其命运的问题还没有出现，但人 们关注以下两个问题：（1）外源 DNA 与宿主基因组整合的可能性，如果能整合， 则可能导致癌变或遗传性状改变等一系列问题的产生。目前还没有发生此种现 象。（2）基因长期高水平表达，这无疑对疾病的预防有益，但对抗体有可能产 生一些不良后果，如产生免疫耐受性、自身免疫病、超免疫力或自身攻击等。 如果这些问题得以圆满解决，艾滋病的防治问题有可能在下一个世纪解决。 2.艾滋病疫苗研制存在的问题及展望 发展艾滋病疫苗是人类彻底征服艾滋病的根本出路。HIV 是一种极为特殊的 病毒，研制其疫苗有许多前所未有的困难。HIV 对研制疫苗不利的特点有：被膜 尤其是 gp120 常发生变异；HIV 的流行毒株有地区差异；HIV 有由类型之分造成 的差异；HIV 能进入中枢神经受血脑屏障的阻隔，因而使疫苗难以接近；HIV 侵 入部位主要是黏膜，所以黏膜局部必须免疫；对病毒感染细胞所致的感染其免 疫效果不高；部分抗能助长 HIV 的感染等。此外，HIV 还可以以前病毒形式整合 到宿主细胞 DNA 中，受整合的细胞表面却没有 HIV 的抗原成分，这样，刺激机 体产生抗体的疫苗对此就无能为力。HIV 的传播在病毒感染中也非常特殊，对疫 苗接种已成功的所有病毒感染，感染仅由无胞病毒引发，而 HIV 有胞和无胞病 毒均可被传播，因为这些特殊性，所以 HIV 疫苗的研制进展缓慢，现有的疫苗 只能抑制 HIV-1 原毒株的消毒性免疫应答。目前研制的重点是增加疫苗产生 HIV-1 特异性 CTL 及中和抗体的免疫应答能力。随着对 HIV 的生物学特性和宿主 对 HIV 的免疫反应的深入研究和了解，人类将不断开发出创新的、改良的新型 疫苗，最终控制艾滋病的传播。 参考文献 [1]WolffJA,MaloneRW,WilliamsP,etal.Directgenetransferinto mouse muscle in vivo.Scinece,1990,247:1465. 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