分子生物学实验-理论讲授

null重组人白介素-18(rhIL-18)基因工程菌的构建重组人白介素-18(rhIL-18)基因工程菌的构建分子生物学实验-理论讲授孟凡欣 姜 涛图示：分子克隆图示：分子克隆重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术所需的基本条件 用于核酸操作的工具酶 用于基因克隆的载体 用于基因转移的受体菌或细胞 用于核酸操作的工具酶用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶 连接酶 DNA聚合酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullTaq DNA聚合酶Taq DNA聚合酶1. 特点： 分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度75℃， 对95℃高温具良好稳定性，该酶不存在3’→5’外切酶活性 2. 用途： 主要用于DNA的体外扩增，经25次循环后才进入酶的反应稳定期，一个DNA 分子因而可被扩增4×106倍。 DNA扩增技术又称为聚合酶链式反应(PCR)，它包括以下三个步骤： DNA模板变性(95℃)→与DNA引物退火(45℃)→引物延伸（72℃) 用于基因克隆的载体用于基因克隆的载体是用来在生物学寄主和试管间‘传送’克隆的序列的DNA分子 (如从细菌到试管再到植物细胞)。 其共性有四点： 启动自发复制的能力 含有遗传标记 (通常是显性的) 供选择 多个限制酶切位点以利于插入克隆的DNA 非必需DNA序列尽可能少，以克隆更大片段质粒(plasmid )质粒(plasmid ) Plasmid--独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。     Plasmid chromosome    pUC系列质粒pUC系列质粒2.7Kb的双链DNA质粒 一个氨苄青霉素抗性基因 一个多克隆位点 实验室常用的基因工程受体实验室常用的基因工程受体大肠杆菌： 用于接受质粒：DH5α、TB1、JM109、JM101 用于接受λ-DNA：LE392、ED8654 酵母菌： 毕赤酵母 啤酒酵母哺乳动物细胞： CHOnullnull连接产物转化大肠杆菌感受态细胞连接产物转化大肠杆菌感受态细胞转化细菌有两个基本方法。 一是化学法：即用CaCl2 处理并加以热激促进DNA进入菌体 二是电激法：即施加短脉冲的电荷以促进DNA 吸收氯化钙法氯化钙法