中国皮肤性病学杂志(4)

·论著· 正常人皮 真皮结合珠蛋白 mRNA 表达研究 王合 ,王雅坤 ,李萍 ,高兴华 ,陈洪铎 　　[摘 　要 ] 　目的 　检测正常人表皮及真皮内结合珠蛋白 mRNA 的表达。方法 　采用逆转录聚合酶链反应 ( RT2 PCR)法。结果 　在 12 例正常人表皮及真皮总 RNA RT2PCR 产物中均扩增出结合珠蛋白片段。结论 　在正常人表皮及 真皮内均有结合珠蛋白 mRNA 的表达。 [关键词 ] 　表皮 ;真皮 ;结合珠蛋白 ;mRNA [中图分类号 ] 　R 322. 99 ;R 339. 11 　　　[文献标识码 ] 　A 　　　[文章编号 ] 　1001 - 7089 (2004) 01 - 0001 - 02 Expression of Haptoglobin mRNA in Human Normal Epidermis and Dermis WAN G He ,WAN G Ya2kun ,L I Ping , et al ( Depart ment of Derm atology , The First A f f iliated Hospital of China Medical U niversity , S henyang 110001 , China) Abstract :　Objective 　To investigate the expression of haptoglobin mRNA in normal human epidermis and dermis. Meth2 ods 　RT2PCR method were used. Results 　All of the samples (epidermis and dermis) cDNA was amplified by PCR method with Hp primers and got 197bp products. Conclusion 　There was haptoglobin mRNA expression in normal human epidermis and der2 mis. Key words :　Epidermis ;Dermis ; Haptoglobin ;mRNA 　　结合珠蛋白 ( haptoglobin , Hp) 是一种急性期蛋 白[1 ] 。它最主要的功能是结合游离血红蛋白 ,但近年 来的研究发现 Hp 还具有重要的免疫作用[2 ] 。谢勇等 发现在人表皮朗格汉斯细胞 (langerhans cells , LC) 内 有大量的 Hp ,并发现 Hp 可以抑制表皮内 LC 向 T 细 胞递呈外源性抗原的功能[3 ] 。Hp 主要在肝脏内合 成[4 ] ,为了推测 LC 内 Hp 的来源及证实正常人表皮及 真皮中是否具有合成 Hp 的能力 ,我们用逆转录聚合 酶链反应 (RT2PCR) 方法检测了正常人表皮及真皮内 Hp mRNA 表达。 1 　材料和方法 1. 1 　标本 　12 例正常人皮肤来自于美容整形手术 中。部位 :包皮 2 例 ,胸部 6 例 ,腹部 4 例。其中男 2 例 ,女 10 例。新取下来的皮肤经 75 %乙醇消毒 ,剪去 皮下脂肪 ,用 0. 1 %焦碳酸二乙酯 (diethyl pyrocarbon2 ate ,DEPC)处理过的双蒸水[5 ]配制的乙二胺四乙酸四 钠 ( ethylenediamine tetraacetic acid Na4 salt , ED TA2 Na4)液中 37 ℃浸泡 2 h 后分离真、表皮 ,0. 01 mol/ L PBS(0. 1 % DEPC 处理过的双蒸水配制) 漂洗后吸干 水分 ,分 100 mg/ 管 ,置 0. 1 % DEPC 水处理过的 Ep2 pendorf 管内 , - 70 ℃冻存备用。 　[基金项目 ] 　国家自然科学基金资助 (39970681) 　[作者单位 ] 　中国医科大学附属第一医院皮肤科 ,辽宁 沈阳 　 110001 　[作者简介 ] 　王合 (1968 - ) ,女 ,辽宁省沈阳市人 ,副主任医师 ,副教 授 ,医学博士 ,主要从事皮肤免疫学研究及皮肤性病临床工作。 1. 2 　实验方法 1. 2. 1 　主要试剂 　DEPC 购自 Sigma 公司 ; Trizol 总 RNA 提取试剂盒购自 Life Technology 公司 ; Rav2逆转 录酶 ,5 ×逆转录缓冲液 , dN TP 混合液 ,oligo ( dt ) 15 , 逆转录酶抑制剂 , Taq 酶 ,均购自大连 Ta KaRa 公司 ; PCR 引物由大连 Ta KaRa 公司合成。 1. 2. 2 　实验方法 　(1) 总 RNA 提取 :应用 Trizol 总 RNA 提取试剂盒 ,按照试剂盒说明抽提各份标本的总 RNA ,同时抽提 1 ×106 个 Hep G2 肝细胞系细胞 (由华 中科技大学同济医学院龚非力教授惠赠) 的总 RNA 做为阳性对照。(2) RT2PCR ①RT 反应体系 (20μl) :5 ×逆转录缓冲液 4 μl , dN TP 各 1 mmol/ L , Oligo (dt) 15 50 pmol , 逆转录酶抑制剂 20 U , Rav2逆转录酶 10 U ,标本总 RNA < 1μg , DEPC 处理过的双蒸水加 至 20μl。反应程序 :42 ℃1 h , 94 ℃2 min。RT 反应 产物 - 20 ℃冻存备用。②PCR 反应体系 (50μl) :10 × PCR 缓冲液 5μl , dN TP 各 1 mmol/ L , MgSO4 1. 5 mmol/ L , RT 反应所获 cDNA 2μl , Hp 上、下游引物 各 0. 8μmol/ L , Taq 酶 1. 5 U ,灭菌双蒸水加至 50μl。 PCR 反应程序 : 94 ℃ 2 min , 1 个循环 ; 94 ℃ 1 min , 55 ℃90 s ,72 ℃90 s ,35 个循环 ;72 ℃5 min ,1 个循环。 PCR 产物 4 ℃保存备用。同时扩增人β2globin 片段做 为内对照 ,扩增提取的各份 RNA 做为阴性对照。人 Hp 5’端上游引物序列[6 ] : 5’2CTG TGC TGG CA T GTC TAA G23’,人 Hp 3’端下游引物序列[6 ] :5’2CA G CTA TGA TCT TCT GAAC23’;人β2globin 5’端上游 ·1·中国皮肤性病学杂志 2004 年 1 月第 18 卷第 1 期　　Chin J Derm Venereol ,Jan. 2004 ,Vol. 18 ,No. 1 引物序列[7 ] :5’2GAA GA G CCA A GG ACA GGT AC2 3’;人β2globin 3’端下游引物序列[7 ] : 5’2CAA CTT CA T CCA CGT TCA CC23’。③PCR 产物 : 取 PCR 扩增产物 5μl ,在含有 0. 25 %溴化乙啶的 1. 5 % 琼脂糖凝胶中电泳 ,电泳后于紫外灯下观察结果 , Hp PCR 产物片段长度为 197 bp ,β2globin PCR 产物片段 长度为 286bp。 2 　实验结果 在 12 例正常人表皮、真皮及 Hep G2 肝细胞系细 胞总 RNA RT2PCR 产物中均扩增出 Hp 197bp 及β2 globin 286bp 片段 ,而各份 RNA 的 PCR 产物均为阴性 (见图 1) 。结果提示在正常人表皮及真皮内均有 Hp mRNA 表达。 1. 阳性对照 Hp 197bp 片段 ;2. 阳性对照β2globin 286bp 片段 ;3. 正常人 表皮总 RNA RT2PCR Hp 197bp 片段 ;4. 正常人表皮总 RNA RT2PCRβ2 globin 286bp 片段 ;5. 正常人真皮总 RNA RT2PCR Hp 197bp 片段 ;6. 正 常人真皮总 RNA RT2PCRβ2globin 286bp 片段 ; 7. 阴性对照 (标本总 RNA PCR 无 Hp 197bp 片段) ;M :分子量标准。 图 1 　正常人表皮、真皮总 RNA RT2PCR 产物 3 　讨论 最初对 Hp 的研究表明 ,Hp 具有结合游离血红蛋 白、在红细胞破坏后减少血红蛋白及铁的流失并保护 肾脏的功能。近年来的研究表明除以上的功能外 , Hp 尚有对游离基的防护、抑制前列腺素合成、抑制细菌、 促进血管生成及重要的免疫作用[1 ] 。目前的研究结 果证实 Hp 可通过调节中性粒细胞及单核细胞的活性 来调节免疫反应[2 ] 。谢勇等人发现在正常人表皮 LC 中有大量的 Hp 蛋白 ,而且 ,Hp 可抑制表皮内 LC 向 T 细胞递呈外源性抗原的功能 ,说明 Hp 能抑制表皮内 的 LC 免疫功能成熟[3 ] 。 最初的研究认为 Hp 仅在成年的肝脏内合成 ,并 且在感染、炎症、组织坏死、恶性肿瘤等疾病时肝脏内 合成的 Hp 数量明显增加[4 ] ,是一种活跃的急性期反 应蛋白。后续的研究发现在人的子宫内膜异位症组 织[8 ]及小肠上皮[9 ]内也有 Hp mRNA 表达。在小鼠 肝[10 ] 、肺[11 ]及脂肪细胞中[12 ]也发现 Hp mRNA 表达 , 给予小鼠炎性刺激后各种组织中 Hp mRNA 表达显著 升高 ,并且 ,在正常状态下未发现有 Hp mRNA 表达的 肾脏及脾中也有明显表达[6 ] 。对小鼠皮肤的研究发 现在小鼠全层皮肤中有 Hp mRNA 表达 ,但没有进一 步明确其在表皮及真皮中的分布[6 ] 。以上的研究结 果表明多种组织也具有合成 Hp 的能力。 本实验结果证实在正常人表皮、真皮内均有 Hp mRNA 的表达 ,提示正常人表皮、真皮具有合成 Hp 的 能力。同时 ,我们实验室的另一实验小组应用原位杂 交方法检测了正常人皮肤中 Hp mRNA 的表达 ,初步 结果表明在皮肤的角质形成细胞、毛囊上皮细胞、皮脂 腺细胞、汗腺细胞中 Hp mRNA 均阳性 (结果待发表) 。 这从另一方面证实了我们的实验结果。有关表皮 LC 中 Hp mRNA 表达的研究工作正在进行中。我们推测 对人皮肤内 Hp 的分布及其功能的深入研究可能对某 些免疫炎症性皮肤病的预防或治疗有重要意义。 [ 参 　考 　文 　献 ] [1 ] Langlois MR ,Delanghe J R. Biological and clinical significance of hap2 toglobin polymorphism in humans [J ] . Clin Chem , 1996 , 42 : 1589 - 1600. [2 ] Wagner L , Gessl A ,Baumgartner Parzer S , et al . Haptoglobin pheno2 typing by newly developed monoclonal antibodies. Demonstration of haptoglobin uptake into peripheral blood neutrophils and monocytes [J ] . J Immunol ,1996 ,156 :1989 - 1996. [ 3 ] Xie Y ,Li Y , Zhang Q , et al . Hp is a natural regulator of Langerhans cell function in the skin[J ] . J Dermatol Sci ,2000 ,24 :25 - 37. [ 4 ] Bensi G ,Raigei G , Klefenz H , et al . Structure and expression of the hu2 man haptoglobin locus[J ] . EMBO J ,1985 ,4 :119 - 126. [ 5 ] 萨姆布鲁克 J ,弗里奇 EF ,曼尼阿蒂斯 T(金冬雁等译) . 分子克隆实 验指南[ M ] ,第 2 版. 北京 :科学出版社 ,1998. 344. [ 6 ] Gonzalez R. Pig MAP/ ITIH4 and haptoglobin are interleukin262depen2 dent acute2phase plasma proteins in porcine primary cultured hepato2 cytes[J ] . Eur J Biochem ,2000 ,267 :187821885. [ 7 ] 迪芬巴赫 ,维德克斯勒 (黄培堂译) . PCR 技术实验指南[J ] . 北京 :科 学出版社 ,1998. 71. [8 ] Piva M , Sharpe2Timms KL . Peritoneal endometriotic lesions differen2 tially express a haptoglobin2like gene[J ] . Mol Hum Reprod ,1999 ,5 :71 - 78. [9 ] Pelletier N ,Boudreau F , Yu SJ , et al . Activation of haptoglobin gene expression by cAMP involves CCAAT/ enhancer2binding protein iso2 forms in intestinal epithelial cells [ J ] . FEBS Lett , 1998 , 439 : 275 - 280. [10 ] D’Armiento J ,Dalal SS ,Chada K. Tissue ,temporal and inducible ex2 pression pattern of haptoglobin in mice[J ] . Gene ,1997 ,195 :19 - 27. [ 11 ] Yang F , Freidrichs WE , Navarijo2Ashbaugh AL , et al . Cell type2spe2 cific and inflammatory2induced expression of haptoglobin gene in lung [J ] . Lab Invest ,1995 ,73 :433 - 440. [12 ] Friedrichs WE , Navarijo2Ashbaugh AL ,Bowman BH , et al . Expres2 sion and inflammatory regulation of haptoglobin gene in adipocytes[J ] . Biochem Biophys Res Commun ,1995 ,209 :250 - 256. [收稿日期 ] 　2002212224 　[修回日期 ] 　2003205206 ·2· 中国皮肤性病学杂志 2004 年 1 月第 18 卷第 1 期　　Chin J Derm Venereol ,Jan. 2004 ,Vol. 18 ,No. 1