第五讲 显微鉴别法

null第五讲 显微鉴别法第五讲 显微鉴别法刘晓芬 穆向荣 张慧慧 康亚兰 郑佳null显微鉴别法显微制片法显微鉴别发展史植物细胞壁和细胞内含物性质的鉴别显微测量、显微常数测定、显微定量显微鉴 别新技术显微鉴别法发展史显微鉴别法发展史显微鉴定(microscopical idenifi-ction)是利用显微镜来观察生药的组织构造、细胞形状以及内含物，描述显微特征，制定显微鉴别依据，用以鉴定生药品种和质量的重要手段之一。 国外显微鉴别法发展史 世界上的第一架显微镜是荷兰眼睛匠詹森父子在1590年前后制成的，效果不理想。前后经过伽利略和胡克改良，效果较好 1878年，制成现代的光学显微镜 20世纪30年代，制造了第一架电子显微镜 1981年，扫描隧道显微镜应运而生 国外显微鉴定发展史国外显微鉴定发展史列文虎克制作的显微镜显微鉴别法发展史显微鉴别法发展史1838年德国学者利用显微镜观察了多种生药的显微构造，于1857年发表了《植物性生药学基础》一书，发现根据显微构造的不同，各种生药可以准确区别。 1900-1907年，英国B.E.Nelson将197种粉末按类别编制了详细的检索表。 1916年，英国生物学家Wallis创立了以石松孢子为参考的显微定量方法 1921年，美国A.Schneider所著的《粉末植物生药显微》第二版，较全面、详细地叙述了研究粉末植物生药的通则、操作方法、显微描述及检索表的编列等，并收载了210种粉末生药的显微特征和特征图。显微鉴别法发展史显微鉴别法发展史近年来，国外药典收载显微鉴别项数如下：国内显微鉴别法发展史国内显微鉴别法发展史1912年教育部公布的药学教育课程中，列有“粉末生药学”课程；国立药学专科学校于20世纪30年代末开设有生药粉末鉴定课程，新中国成立前很少进行这方面的研究。 1948年，我国学者做了云南白药中“保险子”的粉末鉴定，开创了中成药的显微鉴别法。 1975年出版了《粉末药材显微鉴定》专著收录了100种粉末鉴定的全文和特征图。 1977年中国药科大出版了《中成药显微分析》，收录了200种中成药的显微鉴别全文和特征图。国内显微鉴别法发展史国内显微鉴别法发展史2010年版药典在2005年版基础上新增显微鉴别663。随着我国显微鉴别研究的不断深入，各版药典收载有显微鉴别项下的中药材和成方制剂不断增加，如下表：显微鉴别法的应用显微鉴别法的应用显微鉴别适用于性状鉴定不易识别的药材、破碎的或粉末状的、完整的药材，以及含有粉末药材的各种中成药制剂的鉴定。 显微鉴定主要包括组织鉴定和粉末鉴定，通过显微镜观察药材的切片或磨片、粉末制片或解离制片，鉴定其组织构造、细胞形状及内含物特征、矿物的光学特性；利用显微化学方法，确定细胞壁及细胞内含物的性质或某些品种有效成分在组织中的分布等，以鉴别药材的真伪与纯度甚至品质，以及对中成药是否按处方规定投料进行鉴定。显微制片方法显微制片方法横切片或纵切片制片花粉粒与孢子制片表面制片解离组织制片含饮片粉末的中成药显微制片粉末制片磨片制片横切片或纵切片制片横切片或纵切片制片取供试品欲观察部位，经软化处理后，切成10～20μm的薄片，选取平整的薄片置载玻片上，根据不同的需要，滴加适宜的封藏剂处理后制片。 组织切片的方法有徒手切片法、和机器切片法。机器切片机器切片机器切片按包埋与否及包埋材料的不同，有滑走切片法（不包埋，多用滑走切片机切）、石蜡切片法（材料经脱水，用石蜡包埋后切片）、冰冻切片法、棉胶切片法（材料经脱水并用火棉胶包埋后切片）、炭蜡切片法（材料不经脱水，直接用炭蜡包埋后切片）。木类三维切片木类三维切片 对于根、根茎、茎藤、皮、叶类等，一般制作横切片观察，必要时制备纵切片；果实、种子类需作横切片及纵切片；木类需观察三维切片（横切、径向纵切及切向纵切）。1-横切、2-径向纵切、3-切向纵切木类三维切片木类三维切片 1 木纤维 2 木射线 3 木薄壁细胞 4 导管 5 髓A 横切面B 切向切面C径向切面粉末制片粉末制片供试品粉末过四号筛，挑取少许置载玻片上，滴加甘油醋酸试液、水合氯醛试液或其他适宜的试液，盖上盖玻片。必要时，加热透化。表面制片表面制片将供试品湿润软化后，剪取欲观察部位约4mm2，一正一反置载玻片上，或撕取表皮，加适宜的试液或加热透化后，盖上盖玻片。本法适用于叶类、花类及全草类中药的鉴定 解离组织制片解离组织制片对一些纤维、导管、管胞、石细胞等细胞彼此不易分离的组织，需利用化学试剂使组织中各细胞之间的细胞间质溶解，使细胞分离，以便更好的观察细胞的完整形态。将供试品切成长约5mm、直径约2mm的段或厚约1mm的片，如供试品中薄壁组织占大部分，木化组织少或分散存在，采用氢氧化钾法，若供试品质地坚硬，木化组织较多或集成较大群束，采用硝铬酸法或氯酸钾法。解离组织制片解离组织制片如解离厚朴组织：取厚朴一小块，放在装有5%氢氧化钾溶液的试管中，在沸水浴上加热10-15min，然后将剩余的试剂倾出，用水洗2-3次，取出已解离的厚朴小块放在载玻片上，加水，用解剖针将厚朴撕开，封藏于稀甘油中进行观察。解离组织制片解离组织制片A 横切面简图B 径向纵切面详图1 木栓层 2 石细胞带 3 石细胞群 4 皮层 5 初生韧皮纤维 6 分泌细胞 7 韧皮射线 8 韧皮纤维 9 草酸钙簇晶 10 筛管解离前：解离组织制片解离组织制片解离后：1 石细胞 2 筛管 3 纤维 4 分泌细胞 5 木栓细胞 6 淀粉粒花粉粒与孢子制片花粉粒与孢子制片 花粉粒、花药或孢子囊群 沉淀捣碎、离心加入醋酸与硫酸混合液，水浴沉淀加入甘油、苯酚品红甘油胶封藏镜检磨片制片磨片制片选取厚度约l〜2mm的供试材料，置粗磨石（或磨砂玻璃板）上，加适量水，用食指、中指夹住或压住材料，在磨石上往返磨砺，待两面磨平，且厚度约数百微米时，将材料移置细磨石上，加水，用软木塞压在材料上，往返磨砺至透明，用水冲洗，再用乙醇处理和甘油乙醇试液装片。 坚硬的动物、矿物类药，可采用磨片法制片。磨片制片磨片制片含饮片粉末的中成药显微制片含饮片粉末的中成药显微制片散剂、胶囊剂（物为颗粒状，应研细），可直接取适量粉末；片剂取2〜3片，水丸、糊丸、水蜜丸、锭剂等（包衣者除去包衣），取数丸或1〜2锭，分别置乳钵中研成粉末，取适量粉末；蜜丸应将药丸切开，从切面由外至中央挑取适量样品或用水脱蜜后，吸取沉淀物少量。根据观察对象不同，分别按粉末制片法制片（1〜5片）。含饮片粉末的中成药显微制片含饮片粉末的中成药显微制片先按植物性、动物性和矿物性药材分出三大类。 再把植物性药材按药用部分分成小类 植物性药材各小类中，还可按植物科属排队。 把各种药材的显微特征罗列出来，互相比较。 根据处方中各药材的用量比例与突出性，估计各鉴别特征在此中成药中检出的难易程度。 有些药材在加工过程中如已失去细胞组织，如已水煎成膏或已将挥发油蒸馏供药用而弃去残渣，则不可能用显微方法鉴定，应单独列出。含饮片粉末的中成药显微制片含饮片粉末的中成药显微制片养阴清肺丸 地黄100g，麦冬60g，白芍40g，玄参80g，牡丹皮40g，川贝母40g，薄荷25g，甘草20g 处方分析归类 按药用部位归类 根和根茎：地黄，麦冬，白芍，玄参，川贝母，甘草；皮类：牡丹皮；全草类：薄荷 按原植物归类： 双子叶植物 玄参科：地黄，玄参；毛茛科：白芍，牡丹皮；唇形科：薄荷；豆科：甘草 单子叶植物 百合科：川贝母，麦冬含饮片粉末的中成药显微制片含饮片粉末的中成药显微制片罗列特征： 地黄1 薄壁组织碎片 2 分泌细胞 3 导管 4 草酸钙方晶 5木栓细胞含饮片粉末的中成药显微制片含饮片粉末的中成药显微制片白芍1 含糊化淀粉粒的薄细胞 2 草酸钙簇晶 3 纤维 4 导管 5管胞 6薄壁细胞 7草酸钙方晶含饮片粉末的中成药显微制片含饮片粉末的中成药显微制片麦冬1 草酸钙簇晶及柱晶 2 石细胞 3 内皮层细胞 4 木纤维 5导管含饮片粉末的中成药显微制片含饮片粉末的中成药显微制片玄参1 石细胞 2 薄壁组织碎片 3 木纤维 4 木薄壁细胞 5 导管 6 后生皮层细胞含饮片粉末的中成药显微制片含饮片粉末的中成药显微制片牡丹皮淀粉粒草酸钙结晶含饮片粉末的中成药显微制片含饮片粉末的中成药显微制片薄荷气孔腺鳞非腺毛含饮片粉末的中成药显微制片含饮片粉末的中成药显微制片甘草1 纤维及晶纤维 2 导管 3 草酸钙方晶 4 淀粉粒 5 木栓细胞 6 色素块 7 射线细胞含饮片粉末的中成药显微制片含饮片粉末的中成药显微制片专属性特征： 纤维束周围薄壁细胞含草酸钙方晶，形成晶纤维（甘草） 薄壁组织灰棕色至黑棕色，细胞多皱縮，内含棕色核状物（地黄） 石细胞黄棕色或无色，类长方形、类圆形或形状不规则，直径约94μm(玄参）。 草酸钙针晶成束或散在，长24〜50μm，直径约3μm(麦冬） 腺鳞头部8细胞，扁球形，直径至90μm，柄短，单细胞（薄荷）细胞壁和细胞内含物性质的鉴别细胞壁和细胞内含物性质的鉴别细胞壁和细胞内含物细胞壁的性质 木质化细胞壁 木栓化或角质化细胞壁 硅质化细胞壁 纤维素细胞壁 黏液化细胞壁细胞内含物性质 淀粉粒 糊粉粒 脂肪油、挥发油或树脂 菊糖 黏液 草酸钙、碳酸钙结晶 硅质 细胞壁的性质细胞壁的性质木质化细胞壁 鉴别方法：加间苯三酚试液1~2滴，稍放置，加盐酸1滴，因木质化程度不同，显红色或紫红色。 多为后壁组织如石细胞或纤维，木质部的输导组织如导管或管胞，有的射线细胞或输导组织以外的细胞也木化。细胞壁的性质细胞壁的性质2、木栓化或角质化细胞壁（没有图片)? 鉴别方法：加苏丹Ⅲ试液，稍放置或微热，显橘红色至红色。 多存在于植物体的体表，如木栓层、表皮或表皮内方的数列细胞。 3、硅质化细胞壁 鉴别方法：加硫酸无变化。 多存在于表皮组织内。 1.角质化表皮细胞；2.硅质化表皮细胞；3.栓质化表皮细胞 细胞壁的性质细胞壁的性质4、纤维素细胞壁 鉴别方法：加氯化锌碘试液，或先加碘试液湿润后，稍放置，再加硫酸溶液（33→50），县蓝色或紫色。 薄壁细胞或韧皮部输导组织的细胞壁。细胞壁的性质细胞壁的性质5、黏液化细胞壁 鉴别方法：加钌红试液，显红色。 多存在于表皮组织内。车前子种皮外表皮细胞细胞内含物性质细胞内含物性质1、淀粉粒：属碳水化合物。 鉴别方法：(1)加碘试液，显蓝色或紫色。（2）用甘油醋酸试液装片，置偏光显微镜下观察，未糊化的淀粉粒显偏光现象；已糊化的无偏光现象。细胞内含物性质细胞内含物性质2、糊粉粒：贮藏蛋白质 鉴别方法：（1）加碘试液，显棕色或黄棕色；（2）加硝酸汞试液，显砖红色。 材料中如含有多量脂肪油，应先用乙醚或石油醚脱脂后进行试验 蓖麻胚乳细胞细胞内含物性质细胞内含物性质脂肪油、挥发油、树脂 鉴别方法：（1）加苏丹Ⅲ试液，显橘红色、红色或紫红色；（2）加90%乙醇，脂肪油和树脂不溶解（蓖麻油及巴豆油例外），挥发油溶解；椰子胚乳细胞中的油滴细胞内含物性质细胞内含物性质4、菊糖 菊糖多溶于水，观察时宜用70%乙醇或水合氯醛试液冷处理材料后，方可析出菊糖结晶。 鉴别方法：加1%α-萘酚乙醇溶液，再加硫酸，显紫红色并溶解 5、黏液 鉴别方法：加钌红试液，显红色细胞内含物性质细胞内含物性质草酸钙结晶 鉴别方法：（1）加稀醋酸不溶解，加稀盐酸溶解而无气泡发生；（2）加硫酸溶液（1→2）逐渐溶解，片刻后析出针状硫酸钙晶体细胞内含物性质细胞内含物性质碳酸钙结晶（钟乳体） 鉴别方法：加稀盐酸溶解，同时有气泡发生1 表皮及皮下层 2 栅栏组织 3 钟乳体细胞内含物性质细胞内含物性质硅质（这个图片的名称）？ 鉴别方法：加硫酸不溶解显微测量显微测量显微测量系指用目镜测微尺，在显微镜下测量细胞及细胞内含物等的大小。 目镜测微尺 放在目镜筒内的一种标尺， 为一个直径1 8 2- 0 m m 圆形玻璃片，中央刻有精确等距离的平行线刻度，常为50格或100格显微测量显微测量载物台测微尺 在特制的载玻片中央粘贴一刻有精细尺度的圆形玻片。通常将lmm( 或2mm)精确等分成100( 或200)小格，每1小格长为10μm，用以标定目镜测微尺。显微测量显微测量目镜测微尺的标定 用以确定使用同一显微镜及特定倍数的物镜、目镜和镜筒长度时，目镜测微尺上每一格所代表的长度。显微测量显微测量测量方法 将需测量的目的物显微制片置显微镜载物台上，用目镜测微尺测量目的物的小格数，乘以上述每一小格的微米数。通常是在高倍镜下测量，但欲测量较长的目的物，如纤维、导管、非腺毛等的长度时，需在低倍镜下测量。最大值与最小值(μm),允许有少量数值略高或略低于规定。显微测量显微测量举例：用显微测量法,以草酸钙簇晶作为显微特征数, 并分别考察了簇晶直径, 用数理统计方法考核了检测数据的可靠性。人参与西洋参显微簇晶数有极显著性差异,人参显微簇晶数多于西洋参,族晶直径小于西洋参。显微常数测定显微常数测定常见的显微常数主要有用于叶类鉴别的气孔数、气孔指数、栅表比、脉岛数、脉端数等。这些显微常数因植物种类不同而异，而同种植物则较为恒定。 气孔数（stomatal number)是指每平方毫米叶表皮面积上的气孔数目。 气孔指数（stomatal index)是一种植物叶的单位面积上气孔数与表皮细胞数的比例，常用来区别不同种的植物和中药。显微常数测定显微常数测定栅表比（palisa ratio）一个表皮细胞下的平均栅栏细胞数目。栅表比在同属不同种的叶的鉴定上亦具有一定的意义。叶片的内部结构显微常数测定显微常数测定脉岛：叶脉中最细微的叶脉所包围的叶肉单位。 脉岛数（vin-islet number）：每平方毫米面积中脉岛的数目。同种植物的叶，单位面积的脉岛数目是固定不变的，且不受植物生长的年龄和叶片的大小而变化，因此可以作为叶类中药的鉴别特征之一。显微常数测定显微常数测定不同产地广藿香的显微常数分别按气孔指数、栅表比、脉岛数的测定方法, 所获得的叶表面显微常数有较大的差异四种不同产地广藿香叶表面显微常数的比较显微定量显微定量显微定量法是利用药材某种显微特征具有固定常数的特点,采用重量分析法或容量分析法测定药材百分含量的一种中药鉴定方法。 该法对中成药中主药、贵重药和有毒药可从形态特征大体上判断其数量,在一定程度上可保证中成药的质量及用药的安全有效。显微定量显微定量采用被测药材自身的显微特征代替参比物的作用,并利用容量分析法,创立了非参比物显微定量法。该法改进了参比物显微定量法的两大缺点,同时加入了现代统计学的方法,使得到的结果更加准确、可靠。测定样品中定量药材的显微特征常数:按比例制备定量药材的混悬液,装片观察计数,用公式计算:P: 药材显微特征常数(个/mg) X: 每片盖玻片下药材显微特征数(个) V: 定量药材混悬液总体积(mL) V1: 盖玻片下药材混悬液体积( mL) W: 药材称取量显微定量显微定量白芍显微特征常数与化学成分相关性研究 白芍粉末中的草酸钙簇晶显微特征明显,不仅具有生物学稳定的特性,而且数量众多,易于观察计数。本实验采用容量分析方法测定白芍中草酸钙簇晶的显微特征常数,采用高效液相法对白芍中的指标性成分芍药苷进行含量测定,并对得到的结果进行相关性分析,旨在为评价白芍的质量提供一种新的方法。 白芍中草酸钙簇晶显微特征常数与其不同化学成分的相关性也不相同。建议中国药典将显微特征常数与化学成分具有显著相关性的药材项下增加显微特征常数测定项目,丰富药材品质评价的内容；同时将含有这些药材(原粉入药)的中成药项下增加显微定量显微定量显微定量天麻丸 方中天麻祛风定惊,平肝熄风为主药,又因天麻为名贵中药材,来源紧缺,价贵。在成药制剂中,近几年,常以马铃薯茎,大丽菊根或紫茉莉根代之或不按处方规定投料等,因此,对中成药中的贵重药、剧毒药、短缺药及成分中的主药进行定量研究,这对控制中成药的质量,保证临床疗效具有重要意义。用显微定量法对天麻丸中的主药天麻进行显微定量,发现天麻显微特征物(木化厚壁细胞)数目与药材含量在一定范围内呈显著正相关。显微定量显微定量优点 操作成本低,方法简便、易于掌握,检测结果准确可靠。尤其为有效成分不清楚的药材的含量测定提供了一种可能的解决方法。显微鉴定新技术在中药材鉴定中的应用进展显微鉴定新技术在中药材鉴定中的应用进展显微鉴 定新技术 显微观察技术显微制片技术 显微分析技术扫描仪法、体式显微镜法、激光共聚焦扫描显微镜、扫描电镜联用仪、原 子 力 显 微 镜荧光制片、激光显微切割技术、图像分析仪、CCD显微分析系统、高分辨率蓝光光学显微分析系统、计算机图像分析技术显微观察技术显微观察技术扫描仪法 利用扫描仪的实物扫描和图像放大功能，对药材局部进行高像素的扫描， 再利用计算机进行放大处理。如对药材鹤虱与蛇床子的鉴别， 通过扫描仪法观察， 鹤虱的边是棘状， 而蛇床子是比较光滑的脊状。计算机图像分析的基本设备配置显微观察技术显微观察技术体视显微镜法（补图） 利用体视显微镜对药材的表面特征进行观察鉴定。它可以直接观察， 也可与计算机联用， 将观察到的中药材表面特征记录 （拍摄）下来。如对罂粟种子的观察， 能清楚的看到其表面纹理， 带假种皮能透过假种皮隐约看到黑色种皮。体视显微镜显微观察技术显微观察技术激光共聚焦扫描显微镜 （Confocal laser scanning microscope， CLSM）是在普通荧光显微镜的基础上， 加装了激光扫描装置， 并利用计算机图像处理技术， 使用紫外或可见激光激发荧光探针， 从而得到细胞或组织内部细微结构的荧光图像。显微观察技术显微观察技术扫描电镜-X射线能谱仪将两种仪器的结合， 能很清楚地鉴别样品表面的细微形态特征和完成微区元素成分的定性、 定量分析， 具有样品处理简单、 保持样品原貌、 分析速度快等特点， 已应用于麦冬、 川牛膝、 川白芷、 杜仲等无机元素的分析。显微观察技术显微观察技术原 子 力 显 微 镜 （Atomic force microscopy，AFM）是一种以物理学原理为基础， 通过扫描探针与样品表面原子相互作用而成像的新型表面分析仪器。主要适用于超分子聚集体及细胞的观察， 如见中药材多糖分子结构的研究。 显微制片技术显微制片技术 显微制片技术除常用的组织切片、 表面制片、解离组织片、 花粉粒与孢子制片、 磨片制片及粉末片， 近年来又出现荧光制片和激光显微切割制片等新技术。 荧光制片：主要用于激光共聚焦扫描显微镜等荧光检测。 激光显微切割技术：是目前最为成功的解决组织中细胞异质性问的技术。这种方法能够保持极好的组织形态。 显微分析技术 显微分析技术 图像分析仪CCD显微分析系统高分辨率蓝光光学显微分析系统计算机图像分析技术 显微数量分析 显微分析技术 显微分析技术举例： 张春荣利用数码显微测量技术测量扶桑叶中显微结构的大小和显微常数：扶桑叶中草酸钙簇晶的直径为5-20 μm，栅表比为1:(3.6±0.4)，脉岛数为（11.7±2.1）个/mm2，下表皮气孔数为（0.37±0.04）个/mm2，气孔指数为（16.19±2.61）%。null