不同碳源对酵母代谢有机酸的影响

不同碳源对酵母代谢有机酸的影响 2007NO.10 ?20?SerialNo.175ChinaBrewingR esearchReport 不同碳源对酵母代谢有机酸的影响 杨文洲,薛永常,窦少华z,黄建华,赵长新术 (1.大连轻工业学院生物与食品工程学院,辽宁大连l16034;2.大连大学生物工程学 院,辽宁大连l16622) 摘要:对啤酒酵母在以葡萄糖,果糖,麦芽糖作碳源的培养基中的代谢生长状况进 行了跟踪检测,应用高效液相色谱检测各发 酵液中酒石酸,苹果酸,琥珀酸和柠檬酸的含量变化,得出了碳源对啤酒酵母有机 酸代谢的影响:其中酒石酸,苹果酸和柠檬酸 含量差别明显,琥珀酸含量差别较小. 关键词:酵母;发酵;碳源:有机酸 中图分类号:TQ926.4文献标识码:A文章编号:2054—0571(2007)10—0020—03 Ectsofdifferentcarbonsourcesontheorganicacidmetabolismofyeasts YANGWen-zhou,XUEYong-chang,DOUShao-hua2HUANGJian-hua,ZHAOChang-xin {1.CollegeofBiologyandFoodEngineering,DalianInstituteofLightIndustry,DalianI16034,China; 2.CollegeofBiologicalEngineering,DalianUniversity,Dalian116622,China) Abstract:Themetabolismandgrowthofbeeryeastweretrackedwhenculturedinthemediumcontainingglucose,fructoseormaltoseas carbonsource.Thevariationinthecontentoftartaricacid,malicacid,succinicacidandcitricacidwasdetectedbyhigh-performanceliquid chromatography0-IPLa.Theresultsindicatedthatthecarbonsourcehadagreateffectonorga nicacidconten~especiallytotartaricacid,malicacid andcitricacid,butitdidaffectedalotonsuccinicacidcontent. Keywords.yeast;fermentation;carbonsource;organicacid 有机酸是啤酒中一类重要的化合物,酵母的代谢 是啤酒中有机酸主要来源,其组成和含量影响啤酒的风 味.啤酒酵母发酵所产主要有机酸为柠檬酸,苹果酸, 琥珀酸和酒石酸等.在啤酒酿造过程中,虽然有机酸类 物质并不构成啤酒的香味,但是由于有机酸本身所具 有的酸味和特殊气昧,使得它对酒风味影响的重要性 仅次于酯类.并且在啤酒酵母发酵过程中,有机酸的形 成能逐步降低发酵液的pH值,这有助于蛋白质凝固析 出,还可抑制部分杂菌的生长繁殖;除了影响啤酒的pH 值外,还影响啤酒的风味和口感. 培养基中碳源的生理功能主要有2点:一是构成 细胞物质和各种代谢产物的碳架.二是提供细胞活 动所需能量.碳源经分解代谢产生能量(ATP)和一系 列重要的中间代谢物,供合成代谢所需.在不同糖 作碳源的培养基中培养,酵母对不同碳源底物的利 用速度不同必然导致其对有机酸代谢产生很大影 响.本文主要讨论啤酒酵母在3种不同碳源培养下代 谢有机酸的情况,应用高效液相色谱(HPLC)对不同 碳源培养的酵母产酒石酸,苹果酸,琥珀酸,柠檬酸等 动态变化进行了分析研究,以期探讨啤酒酵母细胞在 不同碳源条件下代谢产酸规律. 1实验材料与设备 1.1材料 啤酒酵母:由大连华润啤酒厂提供. 1.2试剂 酵母膏(生化试剂),葡萄糖,果糖,麦芽糖,磷酸氢 二钾,硫酸镁,盐酸,酒石酸钾钠,尿素. 1.3仪器 wFJ7200型可见光分光光度计:尤尼柯(上海)有 限公司;压力蒸汽灭菌锅:上海第二分析仪器厂;电热 恒温干燥箱:大连第四仪器厂;电子秤:北京光学仪器 厂;高速冷冻离心机B一22M:ThermoIEC;HPS一250生化 培养箱:哈尔滨市东明医疗仪器厂;高效液相色谱仪: Jasco,日本. 2实验分析与检测方法 2.1培养基制备 收稿日期:2007—03—12 作者简介:杨文洲(1979一),男,辽宁沈阳人,主要从事微生物代谢机理方面的研究 工作;赵长新,教授,通讯作者. 中国酿造2007年第10期 总第175期?21? I葡萄糖10%,酵母膏0.5%,尿素0.1%,磷酸氢二 钾0.1%,II果糖10%,酵母膏0.5%,尿素0.1%,磷酸氢二 钾0.1%,III麦芽糖10%,酵母膏0.5%,尿素0.1%,磷酸氢 二钾0.1%,各用盐酸调节pH值为5.4左右,定容至200mL. 2.2菌种培养 上述各培养基在温度121oC,压力0.15MPa灭菌 15min后冷却备用.取新鲜酵母泥样品在6000r/min离 4~,5min,然后用6?无菌去离子水反复洗涤3次后,沉淀 酵母泥,在无菌条件下按0.6%(V/v)接种.好氧培养条件 为恒温(20?0.5)oC,转速(150+5)r/min摇床培养,每12h 取样检测1次. 2.3有机酸标准溶液的配制 标准有机酸溶液采用超纯水配制,经0.221xm微孔 滤膜过滤后备用.标准有机酸:酒石酸,柠檬酸,琥珀 酸,苹果酸(色谱纯);超纯水:娃哈哈纯净水经0.451xm 孔径的合成纤维素酯滤膜进行真空超滤. 2.4检测方法 还原糖的测定:参照文献[2]进行. 发酵液预处理:取20mL发酵液,快速于5oC,l8000r/min 超高速冷冻离心lOmin.上清液留样以测发酵液中有机 酸备用. 有机酸的检测:采用高效液相色谱法(HPLC)对有 机酸的测定.分离柱C8填料,Sep.PakC8(S.P柱,国产); 流动相:0.01mol/LKH2PO,TJ~溶液,pH2.65(磷酸调节)用 0.451xmTL径的合成纤维素酯滤膜进行真空超滤,超声 波脱气30min.流速为ImL/min;监测器波长:215nm:柱 压:100kPa;柱温:室温;灵敏度:0.04;进样:20p.L/次.经 上述l8000r/min离心lOmin后的发酵液,用一次性无菌 注射器(2mL)配合0.22Ixm的针筒式水膜过滤器直接进 样检测. 3结果与分析 3.13种碳源培养基中的糖含量变化 啤酒酵母在培养基生长过程中还原糖含量的变化 见附表. 附表啤酒酵母通风培养时糖含量变化 Attachedtable.ChangesofresidualgIucOsecOntentduring aer~ionfermentationforbeeryeast mg/mL 从附表可以看出,啤酒酵母发酵84h后,发酵液中 糖分消耗殆尽,所以取84h为停止检测时间. 3.2酵母在3种碳源培养基中代谢有机酸变化 3.2.1酵母在3种培养基中代谢酒石酸的变化(见图1) 三 发酵时间m 图1啤酒酵母在3种碳源培养基中代谢酒石酸的变化 Figure1.Variationoftartaricacidcontentincarbonsource mediumforbeeryeast 由图l可知,啤酒酵母在3种碳源培养基中代谢酒 石酸的含量有着较大的区别,但酒石酸的变化趋势大 致是一致的.发酵前期,酒石酸分解代谢快于它的合成 代谢,酒石酸快速积累,36h左右酒石酸含量均达到最高 值.其中果糖培养基中的酒石酸质量浓度最高,约为 250.18mg/L;麦芽糖培养基中的酒石酸质量浓度最少, 为l87.36mg/L.随着酵母在培养基中的生长进入对数生 长期和稳定期后,发酵液中酒石酸质量浓度都表现出不 同程度的下降趋势.其中果糖培养基中的酒石酸下降趋 势比较明显.在84h左右,随着培养基中的还原糖逐渐减 少直至为零,酵母生长基本结束.3种培养基中酒石酸的 质量浓度分别葡萄糖144.68mgm果糖为129.28mgm,麦 芽糖l18.62mgm. 3.2.2酵母在3种碳源培养基中代谢苹果酸的变化 g 母{? 抖 一葡萄糖 一果糖 — .r_麦芽糖 发酵时间/h 图2啤酒酵母在3种碳源培养基中代谢苹果酸的变化 Figure2.Variationofmalicacidcontentincarbonsoume mediumforbeeryeast 由图2可知,啤酒酵母在3种碳源培养基中生长, 苹果酸的质量浓度和达到最大值的时间跟碳源底物有 着密切的关系.啤酒酵母在葡萄糖和果糖培养基中代 2007NO.1O ?22?SerialNo.175ChinaBrewingResearchRe po~ 谢苹果酸的趋势基本相同,发酵液中苹果酸达到最大 值的时间是在36h左右,最大值分别为179.34mg/L, 162.55mg/L;在麦芽糖培养基中,啤酒酵母代谢苹果酸 达到最大值的时间是在48h左右,发酵液中的苹果酸最 大值为175.95mg/L.在麦芽糖培养基中苹果酸达到最 大值的时间要比葡萄糖,果糖培养基延迟12h,这是由 于麦芽糖是二糖在培养基中首先要经过一个水解的过 程,水解后生成2个分子的单糖,然后被酵母吸收利用, 这就限制了酿酒酵母的发酵速率,致使发酵液中苹果酸 达到最大值的时间推迟.在发酵液中的苹果酸质量浓 度达到最大值后,随着糖酵解途径过程中的3羧酸循环 中的苹果酸脱氢酶的酶活逐渐增加,苹果酸又被氧化 成草酰乙酸重新回补进入循环,同时NAD被氧化成 NADH.随着发酵的结束,在84h左右3种培养基中的苹 果酸质量浓度恒定,依次为葡萄糖培养基中的质量浓 度为76.37mg/L,果糖培养基中67.26mg/L,麦芽糖培养 基中93.69mg/L.麦芽糖培养基中的含量最高,果糖培 养基中的含量最少. 3.2_3酵母在3种碳源培养基中代谢琥珀酸的变化 ? 詈 母 烬 _?I葡萄糖 十果糖 +麦芽糖 12243648607284 发酵时间/h 图3啤酒酵母在3种碳源培养基中代谢琥珀酸的变化 Figure3.Variationofsuccinicacidcontentinca~onsource mediumforbeeryeast 由图3可知,啤酒酵母在3种碳源培养基中代谢琥珀 酸的波动都比较大,出现多次的波峰现象,这表明啤酒 酵母代谢琥珀酸的条件受多种因素的影响,包括发酵液 的pH值,培养基中的底物浓度和代谢产物等等,这些因 素造成TCA循环途径的琥珀酸下游酶或上游酶活性变 化,使得发酵液中的琥珀酸波动较大.总体来讲,这3种 糖对啤酒酵母代谢琥珀酸影响较小.在代谢终止时,麦 芽糖培养基发酵液中的琥珀酸含量高,葡萄糖培养基中 的含量最少.在发酵后期,由于酵母活力的下降,代谢 水平的降低,各有机酸的含量波动较小. 3.2.4酵母在3种碳源培养基中代谢柠檬酸的变化 由图4可知,啤酒酵母在3种碳源培养基中代谢柠 檬酸的量较少,而且动态变化大.在啤酒酵母生长代 谢初期,柠檬酸有少量的积累,随着啤酒酵母生长趋于 正常,柠檬酸作为良好的经济性碳底物,容易被酵母重 新利用,使得代谢途径能够顺利进行下去.其中葡萄糖培 养基和果糖培养基中柠檬酸含量最大值都出现在24h左 右,但是葡萄糖培养基中柠檬酸积累的最高值为 56.85mg/L,最终柠檬酸质量浓度为35.77mg/L,下降幅度 达到37.08%;果糖培养基中柠檬酸积累的最高值为 49.82mg/L,最终柠檬酸质量浓度40.59mg/L,下降幅度 为18.53%.下降幅度葡萄糖培养基要远高于果糖培养 基.麦芽糖培养基中柠檬酸含量最大值出现在36h 左右,质量浓度为59_3lmg/L;最终柠檬酸质量浓度为 50.39mg/L;下降幅度分别为15.04%.麦芽糖培养基中 柠檬酸的最终质量浓度要高于葡萄糖和果糖,这是 因为在发酵后期由于单糖利用的速度要快于双糖,致 使单糖培养基中的柠檬酸碳底物被酵母重新摄入胞 内利用,引起柠檬酸酸含量逐步降低【,所以单糖培养 基中的柠檬酸的质量浓度要小于双糖培养基. ?+葡萄糖 +果糖 +麦芽糖 12243648607284 发酵时间/h 图4啤酒酵母在3种碳源培养基中代谢柠檬酸的变化 Figure4.Vanationofcitricacidcontentincarbonsource mediumforbeeryeast 4结论 啤酒酵母在3种糖类物质作碳源培养基中生长,通 过高效液相色谱(HPLC)对发酵液中酒石酸,苹果酸, 琥珀酸,柠檬酸4种有机酸含量进行检测,可以得出以 下结论: (1)啤酒酵母在葡萄糖培养基中生长代谢酒石酸 最终质量浓度最大,为144.68mg/L;果糖培养基129.28mg/L; 麦芽糖培养基为l18.62mg/L. (2)啤酒酵母在单糖培养基中代谢达到峰值时间 要比双糖快约12h,而最后麦芽糖培养基中苹果酸的含 量最高,为93.69mg/L;葡萄糖培养基中为76.37mg/L;果 糖培养基中为67?26mg门L. (下转第61页) 经验交流中国酿造2007年第10期 总第175期?61? 即堆积前加入总量的30%,其余入窖前加入.生香酵母 采用固态法培养,使细胞数增加,菌体蛋白增加,有助 于芝麻香的形成.窖底加发酵好的香泥,使酒中有一定 量的己酸乙酯,对芝麻香有烘托作用[". 麸曲大曲结合法生产工艺采用90%麸曲,10%大曲 一 同参与发酵,产出的酒芝麻香更浓,酒体更丰满. 2工艺技术特点 高梁为主要原料,加适量麸皮,混蒸混烧,高,中温 曲和强化菌混合使用,高温堆积,砖池偏高温发酵,缓 慢蒸馏,量质摘酒,分级入库,长期贮存,精心勾. 2.1原料 以高梁为_丰,加适量麸皮(有的厂又加适量小麦), 麸皮,小麦和麸曲中含有丰富的蛋白质,它们的加入可以 调整原料中的氮碳比,从1:(18-20)调整到1:(13,15), 增加了美拉德反应产物,有利于芝麻香味成分的产生. 2.2糖化发酵剂 以大曲为主,配加河内白曲,麸曲,生香酵母等. 2-3发酵池 采用砖池,有的酒厂采用砖池挂适量人工窖泥或采 用水泥池,底部铺人工窖泥. 不同厂家其生产工艺不尽相同,现以某企业芝麻香 型酒为例,介绍其工艺特点:即高温大曲与强化麸曲混 合使用,高温堆积(45?,50?),高温入池(28~C,30?), 发酵1个月,高温流酒(30~C,35?),储存时间2,5年以上. 在堆积发酵时,加入意大利酵母,地生酵母的麸曲, 有利于芝麻香物质的产生.这2种酵母可将蛋氨酸转化 为硫甲基丙醇,硫甲基丙醛等芝麻香味物质. 3芝麻香型白酒的香味成分特点及风味特征 芝麻香型白酒介于清香,浓香,酱香之间,自成一 格,在风味特征上有别于清香,浓香,酱香.从定性成分 ,浓,酱香型白酒的定性成分大致相同,主 上看,它与清 要是一些特征组分的差异: 吡嗪类化合物占有相当的绝对含量[]为1100~g, 1500~g/L的范围,低于茅台及其他酱香型酒.低于白云 边酒,却大大高于清香,浓香型酒.蛋白质在酶的作用 下分解为氨基酸,氨基酸之间发生反应生成吡嗪类化 合物,其在芝麻香型白酒香气中作用突出. 呋喃化合物含量低于酱香型白酒,略低于兼香型白 酒,而明显高于清香型白酒和浓香型白酒.它是糖经脱 水后与氨基酸发生美拉德反应的产物之一(还生成吡 喃,醛类风味物质).呋喃类化合物大多具有甜样的焦香 气味,与吡嗪类化合物气味混合形成独特的焦香香气, 它在芝麻香型白酒香气中起着不可忽视的作用[. 总酯含量及己酸乙酯的含量相对较低[,己酸乙酯 含量平均为174mg/L.甲硫基丙醇是芝麻香型白酒的特 征成分.3一甲硫基丙醇是蛋氨酸在酵母中酶的作用下 水解放出氨与脱羧基后的代谢产物. CH3?SCH2?CH2?CH(NH2)COOH+H2OCH3?S? CH2~CH2?CH2OH+NH3+CO2 芝麻香型白酒国家行业标准规定:3一甲硫基丙醇? 0.50mg/L,乙酸乙酯?0.40g/L,己酸乙酉.1Ogre,0.80L. B一苯乙醇,苯甲醇及丙酸乙酯含量低于酱香型白 酒.有人认为这3种物质跟酱香浓郁有关. 景芝白干含有一定量的丁二酸二丁酯,平均值为 4mg/L,高于浓香,酱香,兼香型白酒,低于清香型白酒【2_. 芝麻香型白酒的风味特征:闻香以芝麻香的复合 香气为主,入口后焦糊香味突出,细品有类似芝麻香气 (近似焙炒芝麻的香气)后昧有轻微的焦香,口味醇 厚爽净. 芝麻香型白酒近几年发展迅速,但还有不尽人意之 处,其微生物的消长规律,香味特征成分的形成机理以 及工艺技术的进一步改进,还需要深入研究. 参考文献: [1]沈怡方.白酒生产技术全书.北京:中国轻工业出版社,1998. [2]中国酿酒工业协会白酒品酒师[M].全国酿酒品酒师统一一培 训教材,2005. [3]李大和.白酒勾兑调味的技术关键.酿酒科技,2003(3):29.31. (上接第22页) (3)啤酒酵母在3种碳源培养基中代谢琥珀酸的波 动幅度大,在代谢终止时麦芽糖培养基中的琥珀酸含量 高,葡萄糖培养基中的含量最少.但3种碳源培养基对 啤酒酵母代谢琥珀酸影响较小. (4)啤酒酵母在3种碳源培养基中代谢柠檬酸的 最终质量浓度很小,葡萄糖培养基中质量浓度为 35.77mg/L:果糖培养基中质量浓度40.59mg/L;麦芽 糖培养基中质量浓度为50.39mg/L;啤酒酵母在双糖 做碳源的培养基中代谢柠檬酸的质量浓度要高于单 糖培养基. 参考文献: [11董霞,李崎,顾国贤.啤酒有机酸类物质研究进展[JJ.酿 酒,2003(6):63—66. [2]孙付保,任洪艳,窦少华,等.离子与啤酒酵母生理代谢相关 性的初步研究[J].中国酿造,2004(8):12.15.