硕士论文-红曲霉产色素培养条件及其抑菌活性物质的研究

硕士-红曲霉产色素培养条件及其抑菌活性物质的研究 大连轻工业学院 硕士学位论文 红曲霉产色素培养条件及其抑菌活性物质的研究 姓名:邹宇 申请学位级别:硕士 专业:食品科学 指导教师:侯红漫 20050401 ,,,,,,;, ,,,,,,,,;,,,,,,,,,;,,,,,,,,;,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,;,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,(，,,,,,, ,,,,,，,,;,,,,,,,,,;,,;,,,,,,,;,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,;,,,;,,,;,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,;,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ;,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,;,,,,,(,,,,,,,,,;,,,,,,,,,;,,,;,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,;,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,，,,,,,,;,,,,,,,,;,,,,,,,, ;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,( ，,,,,,,,,,,，,,,,,,;,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,),,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,;,,,，,,,,,;,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,，,,,,;,,,,,?,,,,,,，,(,,,,;,,,,,，,(,,,;,,，,,,,,,，,,,,;,,,,,,，,,,,，,,,,,„,,,， ,(,,,,;,,,,,，,,,,,,(,,,;,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,?,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,，,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,;,,,;,;,,,,,,,,，,,,,,;,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,(，,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,, ,,(,,,,,,,,,,,,,,巧;, ,,,,,,,,( ,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,, ,,,,,,,,，,,,,,,,,;,;;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,(;,,,，,,,,,,,,,,,;,,,,(,,, ,,,,,,,,,;,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,;,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,, ;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,;,;;,, ,,,,,,,,,,(;,,,，,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,, ,,,,,,;,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,(,,,,,,,,,,,,;,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,, ;,,,,,,,;,,;,,,,,,,, ,( ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,(,,,,,,,,,,,,, ? ;,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,， ;,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,，，,,,,，,,,,,,,,,;;,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,(,,,,,,,,,, ;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,;,,,,,,,;,,,,,,,,;,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,？,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,( ,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,;,,,,,,，;,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,;,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,; ,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,;,,,,,; ,,,,( ,,,,,,,:,,,,,,,,(;,，,,,,;,,,,,,,,,，,,,,,,,;,,,,,,,,,。;,,,,,,,， ,,,,,,,,,,,,,,,,,,。,,,,,,,,,;,,,,,,,;, ?， 关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题目:红些耋芒鱼塞蛰差釜住题墓地苴活性塑厦的婴究 本学位论文作者完全了解大连轻工业学院有关保留、使用学位论 文的规定，大连轻工业学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论 文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文 的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密(炙)，保密期至如易年争月,日为止。 学生签名:塑罡宣导师签名:,主～二,童 钞咕年争月，,日 第一章文献综述 第一章文献综述 ,(,红曲概述 红曲古代称丹曲，是以红曲霉为主的一种独特的酒曲，它具有耐酸、耐高温的特性， 在制造上也有独到之处，所以，《本草纲目》里评论它说:“此乃人窥造化之巧者也: 和“盖奇药也:。所以，红曲的闻世，是我国制曲技术的重大成就，开创了世界上用微 生物发酵方法制造食用色素的新纪元，给我国和世界食品微生物发酵史写下了光辉的一 页。 在我国，红曲的生产主要分布在福建、浙江、台湾等省，其中以福建的古田红曲最 为著名。红瞌不仅被用于酿造黄酒，而且在腐乳、食醋、食用色素、中药等制造方面也 有广泛应用。近几年来，由于化学合成色素对人类的致癌作用引起了人们对微生物色素 开发的兴趣，特别是在红曲色素的研究与开发方面。如上海市工业微生物研究所、宁夏 轻工研究所、四川食品工业研究所、北京食品研究所、福建粮油科研所等，他们在 红曲色素的生产与应用研究方面都取得了成绩和经验。但红曲色素的耐光、耐热性较差， 容易退色成淡黄色，成本较高，这些方面还有待进一步深入研究。在医药方面，沈阳市 副食品厂用淀粉渣代替大米原料，用红曲霉制成红曲应用于酿酒，并从酒醅中提取粗制 红曲霉素，治疗慢性肠炎、痢疾等有特效;在白酒生产方面，在红曲酯化菌、强化大曲 等方面有新发现;在保健食品方面，已开发出了红曲醋以及醋饮料、红曲健身酒、红曲 清酒、红曲补酒等，向红曲保健食品系列化方向发剧?。 ,(,红曲霉属的特征和主要种【,捌 ,(,(,红曲霉属的特征 (,)细胞结构 红曲霉菌丝有横隔，多核，分枝甚繁且无规律。细胞幼时含有颗粒，老后含有空泡 及油滴。在菌丝体中常出现联结现象，即两条菌丝接触在一处时，由一细胞生出突起， 与另一细胞接触处细胞壁消失，将二者互相沟通。 第一章文献综述 (,)无性繁殖 红曲霉无性繁殖时，由菌丝生出分生孢子梗，在其顶部产生分生孢子，单生或以向 基式生出,,,个成链。分生孢子大多为梨形，多核，萌发后又形成菌丝。 (,)有性繁殖 红曲霉有性繁殖时在菌丝顶端或侧枝顶端首先形成一个单细胞多核的雄器，随后在 雄器下面的细胞处以单轴方式又生出,个细胞，这个细胞就是原始的雌器，即产囊器的 前身。由于雌性器官的生长和发育，将雄器向下推压，使雄器与柄把呈一定角度。这时 雌性器官在顶部又生出一隔膜，分成两细胞，顶端的细胞为受精丝，另一细胞即产囊器。 当受精丝尖端与雄器接触后，接触点的细胞壁解体产生,,，孔。雄器内的核和细胞质经 受精丝进入产囊器。此时只进行质配，而细胞核则成对排列，并不结合。在此同时，在 两性器管下面的细胞生出许多菌丝将其包围，形成初期的被子器。被子器内产囊器膨大， 并长出许多产囊丝，每个产囊丝形成许多双核细胞，核配于此时发生，经过核配的细胞 即为子囊母细胞。每个子囊细胞中的核经过三次分裂(形成八个子囊孢子，这时被子器 已发育成熟，其中子囊消解，子囊孢子成堆地留在被子器内，好似其中只有一个子囊。被 子器外壳破裂后，散出子囊孢子，子囊孢子萌发后形成多核菌丝。 (,)培养特征 培养红曲霉多用麦芽汁琼脂培养基。红曲霉在上述培养基上生长良好，菌丝初为白 色，老熟后变为淡红色、紫红色、赭红色、橙红色、烟灰色等，因种而异。菌落的结构 有呈绒毡状者，有呈皮膜状者，呈皮膜状的菌落少褶皱或有辐射纹。红曲霉也可在,,, 培养基上生长，但呈现局限生长，而不像在麦芽汁琼脂培养基上那样蔓延的幅度大。一 些种在,,,培养基上的菌落呈疮疤状。红曲霉都能形成红色素，常将色素分泌到培养基 中，故使培养物的背面着色。 ,(,(,红曲霉属的主要种 (,)发白红曲霉 它在麦芽汁琼脂培养基上有自色气菌丝，成熟后培养基内和培养基表面的菌丝体为 皮膜状，呈淡红褐色。分生孢子球形或梨形，直径,:,,,,,,,，不着色。被子器球形，直 径,,,,,,,。子囊孢子椭圆形，,，,,,,,(,,,,， 不着色。 (,)巴克红曲霉 在麦芽汁琼脂培养基上，菌落初呈白色，后变为深褐色、绒毡状。分生孢子梨形， , 第一章文献综述 ,:,,,,,,。被子器球形，直径,,，,,,，,,,,,，外壳褐色。予囊孢子椭圆形，,,,,,,,,，淡 褐色。 (,)烟灰色红曲霉 在麦芽汁琼脂培养基上，菌落初呈白色，渐变为灰黑色、毡状，背面红褐色。分生 孢子单生或成链，梨形或球形，直径,(,,,,(,,,,，或(,:,,,,,),,,(,:,,,),,。被子器 褐色，球形，直径,,一,,,,,,。子囊孢子卵形，(,(,,,(,),,,,(,(,:,,,,)“,，褐色。 (,)紫红曲霉 菌落在麦芽汁琼脂培养基上，初为粉色，后变为紫色或葡萄酱紫色，有褶皱及气菌 丝，背面紫红色。分生孢子成链，球形或梨形，直径,:,,,,,,,。被子器球形，直径,,, ,,,,，橙红色。子囊孢子卵形或椭圆形(,,,,,,(,),,,,(,(,,,),,,，淡红色。 (,)红色红曲霉 菌落在麦芽汁琼脂培养基上初为白色，后变为赭红色，呈毡状，气菌丝赭色，背面 红色。分生孢子梨形或球形，直径,,,,,,,,。被子器球形，直径,,:,,,,,,,,，红色。子 囊孢子卵形，(,,,,，,)，(,,,(,,,) ,,，无色。 (,)锈色红曲霉 菌落在麦芽汁琼脂培养基上形成厚的皮膜，初为白色，后变为鲑肉似的橙红色，上 面覆盖短的白色菌丝。分生孢子梨形或球形，直径,:,,,,,,,,，无色。被子器球形，直径 ,,,,,，，,。子囊孢子椭圆形,(,,,,×,(,,,,， 不着色。 (,)变红红曲霉 菌落在麦芽汁琼脂培养基上形成皮膜状，有褶皱，白色，色素产生非常缓慢，,, 天后才变为粉红色或桃红色。气菌丝稀少，分生孢子球形或梨形，直径,:,,,,,,,，无色。 被子器球形，直径,,,,,(,,,,,以下、,,,,,以上者极少)。子囊孢子椭圆形，(,:,,,),, ,(,:,,,(,),,。 (,)毛霉状红曲霉 菌落在麦芽汁琼脂培养基上产生白色气菌丝，底部菌丝体为淡红色，背面白红色。 分生孢子梨形或球形，,,:,,，,,,,，成链状。被子器球形，直径,,，,,，,,,(,，无色。子囊 孢子长圆形，,，(,,,,,,,，无色。 ,(,红曲霉的代谢产物【,,,】 ,(,(,初级代谢产物 , 第一章文献综述 (,)酶 红曲霉能产生多种酶类，主要有洳淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、糊精化酶、蛋白酶、果 胶酶、羧肽酶，不同种类菌株产酶的类型及产量会有差异。某些红曲霉菌株还能分泌直 接催化己酸和乙醇合成己酸乙酯的胞外酶。对己酸乙酯合成能力较强的红曲酯化菌进行 四级扩大培养得到了酯化率,,,,,的酯化酶制剂，用于白酒生产已取得较好的效果。 (,)脂肪酸 ,,,,年，日本学者的研究表明红曲霉培养物主要含有的脂肪酸是,,,:,，,,,:,， ,,,:,，,,,:,，,,,:,，认为不同红曲霉菌株产生的脂肪酸成分有很高的相似性。国内 宋洪涛采用气相色谱进行分析，结果表明不饱和脂肪酸含量达,,,,,,,，多烯不饱和 脂肪酸含量达,,,:,,,,,。经过活性测定认为它们可能有增强,,,,;,,,,,分解甘油三 酯，降低极低密度脂蛋白胆固醇的功能。,,,,年，德国学者发现,,,,,;,,,,,,,,,,, 能将短链脂肪酸转变为甲基酮，并对其代谢途径进行了初步探讨。在不饱和脂肪酸方面， 尚有待深入研究，以便对红曲的降脂作用能有较为全面的了解。 (,)有机酸 日本有人在利用红曲霉突变株生产酒精饮料时对产生的有机酸进行了分析，发现突 变株与亲株产生的有机酸成分很相近。泰国研究者对收集到的,,株红曲霉菌株进行筛 选，发现，勿撇站淞,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,菌株在含有,,,葡萄糖、,(,,,,牛肉膏提取物 的培养基中培养，,(苹果酸产量达,,,(,,,,，随后又对菌株进行诱变处理，分离得到的 白化突变株最大产量可达,,(,,，,,。 ,(,(,次级代谢产物 (,)红曲色素 红曲色素是红曲霉在生长代谢过程中产生的多种色素的混合物，它是由结构类似的 红、橙、黄三类不同色素组成的，包括红色的红斑素、红曲红素;橙色的红斑胺和红曲 红胺;黄色的红曲素和红曲黄素。 (,)降血脂类物质 ,,,,年，日本东京农工大学远藤章教授等对红曲进行研究，从红曲霉的红色红曲中 发现了强力的胆固醇合成阻碍剂莫纳可林,、接着又从同一菌株分离出与莫纳可林,构 造相似的其他活性物质，这些物质毒性都极低，有较强的降低胆固醇的作用，其特征为 对抗阻碍胆固醇合成系统中的限速酶,,,,,,,(,(羟基(,一甲基一戊二酸单酰,,砧还原 , 第,索文献综述 酶。莫纳可林,不仅能降低多种动物(兔子、狗等)血中的胆固醇，而且对高胆固醇血症 患者也极有效，其最大特征是能对低密脂蛋白,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,;,;,,),,,胆固醇具 有优先降低作用。,,,是最能引起动脉硬化的物质。 (,)降血压物质 红曲具有很强的降压作用，推测其有效成分为,(氨基丁酸(,,,,)及,,,;,,,,,,, (或红曲霉的其它细胞壁成分)。研究发现红曲还可以用作血压升高剂，对血压有双重控 制作用。,,世纪,,年代，日本研制的“群势:红曲有很强的降压功能，因而获得高血压 改善剂的专利。日本还开发了用,(,,,,的提取物制备保健饮料用于治疗高血压的技术。 还可以根据红曲的降压功效来开发低盐食品，比如日本研制成功的低盐大豆酱油。日本 的研究者还发现用麸皮制备的红曲中除了含有,,,,;,,,,,之外还含有,,,;,,,,,,,(? ,,,,,干重)，因此该麸皮红曲既有降脂功能又有降压功能。最近日本的研究又发现进 行厌氧处理可使,(,惦昭量提高, (,)降血糖物质 ,倍以上。 远藤章教授曾直接用红曲霉的培养物作饲料进行动物试验，发现试验兔子在进食饲 料后半小时内血糖降低了,,,:,,,,,，而在,小时后血糖量仍比对照组下降了,,,, ,,,，其有效成分尚待研究。 (,)其他代谢产物 不少红曲霉菌株能产生麦角固醇。麦角固醇是,,,的前体，而且还是生产“考的 松”、黄体酮的原料，它还可与胆固醇竞争肠道中的吸收部位，从而减少外源性胆固醇 的吸收。也有人发现从传统家酿红酒的小曲中分离到的红曲霉菌株可以产生,,,,自由 基的清除剂。,,世纪,,年代初期研究了红曲霉生产,(肉毒碱、核酸酶的技术。从红曲 霉中分离得到的单胺氧化酶抑制物可治疗某些精神疾病，而其产生的黄酮酚又是有潜在 防癌和抗癌作用的药物。之后又发现了三种植酸酶，可以用来提高食品的营养价值。红 曲霉在化妆品上的应用也大都见于日本。发现用酶水解发酵液后可提取一种细胞活化剂 用于防止皮肤粗糙、延缓衰老。将红曲霉产生的色素溶于乙醇再与丝心蛋白混合后形成 的红曲色素一丝心蛋白结合物可用作化妆品着色剂。 ,(,红曲霉的抑菌活性物质 我国自元代以来红曲就己用在鱼、肉制品的防腐保存上，现存的明代宋应星所撰写 的《天工开物》有如下的记载:„„世间鱼肉最朽腐物，而此物薄施涂抹，能固其质于炎 , 第一章文献综述 暑之中，经历旬月蛆蝇不敢近，色味不离初，盖奇药也??。这段记述说明红曲有杀菌和 抑菌作用，可防止鱼肉因感染杂菌而发生变质，肯定了其中抑菌活性物质的存在。 ,(,(,,,,,,,,,,,,【,，,】 ,,,,年香港中文大学的,,,;,,,,,,,,,等人首次报道了经快中子及,射线诱 变的紫 红曲霉有抑菌作用，变异,,朱,,,,较,,的抗菌活性高，主要抑制芽孢杆菌、链球菌、假 单胞杆菌的生长。,,,,年他们又首次分离出红曲中的一种抑菌因子，并命名为,,,,,;,,,, ,，继而建立了,,,,,;,,,,,的提取方 法。 ,(,(,,,,,，,,,,,,【, ,, ,,,,年，,,,,,,,,,,,,,等舭,(,,,将其命名为,,,,,,;,,,,，这种红曲霉的代谢产物对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有抑制作 ,的发酵培养液中分离得到一种抑菌活性物质，并 用，经鉴定为,，,不饱和，,,内脂衍生物。,,,,年捷克斯洛伐克也同样分离出了这种物质。 ,,,,,,;,,,,的结构式如图所示: , 图,(,,,,,,,,,,,,结构 式 ,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,(,(,红曲色素【,,,,, , 红曲色素由红色素、黄色素和紫色素三种基本色素组成。最近郭东川等人又发现了 两种新色素，它们的分子式为,,,,,,,,,和,,,,,,,,,。华南理工大学童群义等人使用自 制的红曲色素粉末配成,，,,,,,的红曲色素水溶液进行抑菌实验，结果证实红曲色素对 枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用，对大肠杆菌、灰色链霉菌抑菌作 用较弱，而对啤酒酵母、霉菌等无抑制作用。中国食品发酵工业研究所王柏琴等人研究 表明，红曲色素溶液能抑止肉毒梭状芽孢杆菌生长，对发酵菌株的生长和产酸均无显著 , 第一章文献综述 影响，因此将其应用于发酵香肠生产，替代亚硝酸盐是切实可行的。 ,(,(,橙色素分离液,,,，,,, ,,,,年，,,,,,,,,,,等人报道红曲霉的抑菌作用是由橙色素引起的。天津轻工业 学 院宫慧梅等人将分离获得的六种红曲样品色素分别进行抑菌实验，实验结果表明红衄色 素的三种分离液，对细菌的抑制能力较强，对阴性菌的大肠杆菌也有一定的抑制作用， 对酵母菌和霉菌无抑菌性，而其中起主要抑菌作用的成分为橙色素分离液，黄色素与红 色素分离液无抑菌活性。橙色素结构式如下图: ,,, ,,, , , 图,(,橙色素结构式 ,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,(,(,几丁质酶【,, , ,,,,年，台湾的,,,,,,在虾蟹壳粉末制成的培养基中，从,(,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,的细胞外产生出一种有抗菌作用的几丁质酶，并得到纯化和鉴定。该几丁 质酶分子量约为,,,,,道尔顿，等电点为,(,，最适,,为,，最适温度为,,:,、稳定 的,,为,,,。该酶可被,,,，强烈抑制，可抑制细菌和真菌。 ,(,红曲霉产桔霉素的发现及其性质 ,(,(,红曲霉产桔霉紊的发现【,, , ,,,,年，法国学者,,,,;等分别用不同的固体和液体的培养基培养红曲霉，将培养 物经,,;硅胶板分离，发现分离出的已报道的抑菌活性物质,,,,,;,,,,,与桔霉素在薄层 层析板上具有相同的,,值，在波长,,,,,的紫外灯下均发淡黄色荧光，且同样具有抑菌 第一奄文献综述 ,,,,;等人还通过核磁共振、质谱、紫 性，而分离出的另外两种物质无抑菌性。同时， 外吸收光谱等对,,,,,;,,,,,进行了结构分析， 证实,,,,,;,,,,,就是桔霉素。 ,(,(,桔霉素的产生菌【,,】 桔霉素是由真菌产生的次级代谢产物。自然界中许多青霉和曲霉菌株能产生桔霉 素，产桔霉素的特征菌是桔青霉(,,,;,,,,,,;,,,,,,,,)，用查氏葡萄糖培养液,,,接种 桔青霉，培养两周后可提取桔霉素,,,,,,，产量高达,,,,,,,,,,,,,。 ,(,(,桔霉素的物理化学特性【,, , 桔霉素纯品为黄色晶体，熔点,,,,,一,,,。,，难溶于水，溶于氯仿、丙酮、乙酸乙脂、 乙醇等有机溶剂，分子量为,,,，分子式为,,,,,,,,，结构式如图所示: ,,,, , ,,,, 图,(,桔霉素结构式 ,,,,(,,,,,,,,,;,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,(,(,桔霉素的毒性和抑菌性【,,,, ,】 桔霉素是一种真菌毒素，具有肾毒性，且怀疑是人类某些地方病的潜在致病剂。最 近的研究表明桔霉素对肾脏的结构和功熊极为不利。桔霉素可在线粒体内聚集且干扰电 子传递系统，导致,,,合成受到抑止，并进一步使,,,和蛋白质合成受到抑止，肝糖原 下降，胆固醇和甘油三酸脂合成受阻。桔霉素还可以诱发突变。,,,,,,等报道，桔霉素 在大肠杆菌,,,完整性方面会导致单峰和双峰的形成，并且诱发大肠杆菌细胞,,,修 复合成。另外，在大肠杆菌突变试验中，逐渐增加的碱基对也被发现。,,,,,,,,等发现桔 霉素抑止聚合酶并且导致,,,细胞染色体中的,,,,,(阳性微核的突变。桔霉素以口服方 式喂给小鼠，会造成小鼠的骨髓细胞中染色体断裂、空缺等畸变现象，也会导致肾细胞 , 第一章文献综述 肿瘤的出现。同时，桔霉素可使稳定表达人类,,,,,,基因的基因细胞发生突变。 ,(,(,红曲霉中桔霉素的合成途径【,,】 自法国学者,,,,;等人发现,,,,,;,,,,,和桔霉素是同一种物质以后，红曲霉中桔霉 素的合成途径就成为人们探讨的主要问题。最近的研究表明，桔霉素与红曲色素的合成 开始在同一途径上，如图所示，先由一个乙酰辅酶,和,个丙二酰辅酶,合成丁酮和辅酶， 复合物经甲基化，在丙二酰辅酶,的参与下合成戊酮，然后分开，一条途径合成己酮， 最后产生红曲色素;另一条途径最后产生桔霉素。所以桔霉素常伴随在红曲色素中产生。 这也解释了色价高的菌种，桔霉素含量也高的原因。 ,,酮聚合 丙删鳅,。,，产醋 酶 ;。彩心?,酗 , 配黼,卜卜 上、、, ,。,解决桔霉素问题的途径 自从发现红曲霉产桔霉素后，美、日、欧各国制定了针对我国红曲出口的新， 严格限制红曲中桔霉素的含量，而我国红曲中桔霉素含量很难达到控制标准，桔霉素问 题已成为限制我国红曲出口的瓶颈问题。解决桔霉素问题，可以从以下几个方面考虑: , 第一章文献综述 ,(,(,筛选不产或少产桔霉素的优良菌种„,:,】 红曲霉产桔霉素是普遍现象，但不同菌株产桔霉素的能力差别较大，因此可以筛选 出色价高，而桔霉素含量低的优良菌种。无锡轻工大学许赣荣等筛选出的,,,,,菌株生 产红曲米，色价高于:,,,,,,,，桔霉素质量分数低于,,,,,,。杭州商学院王雅芬等通过诱 变处理筛选出红曲霉,,一,—,,,，桔霉素质量分数低于,叫蚝，而色价高达,,,,,,,以上。 ,(,(,培养基与发酵工艺条件优化，减少桔霉素的生成,,,，,,, 桔霉素的生成与培养基的成分密切相关。酵母膏营养丰富，含有多种有利于微生物 分泌代谢产物的因子，有利于桔霉素的分泌，因此在红曲霉的培养基中应尽量避免加入 酵母膏。在氮源中，精氨酸和丙氨酸可强化桔霉素的生成，而缬氨酸、组氨酸、色氨酸、 亮氨酸可消除桔霉素的生成。在红曲霉液体深层培养中，供氧量对桔霉素的生成具有很 大的影响。高通气量和搅拌速度都可加速桔霉素的生成，因此在满足供氧需求的情况下， 减少通气量和搅拌速度。 另外，最新研究报道:脂肪酸和甲基酮会影响红曲中桔霉素的生成，尤其是,(三十 碳酮，能强烈抑制桔霉素的生成，同时并不影响色素的形成，解析其原因可能有二，其 一可能性是抑制了桔霉素形成的支路反应;其二是由于脂肪酸的加入增加了过氧化物的 活性，从而使桔霉素改变结构，转化为无毒物质。 ,(,立题意义 列入我国食品添加剂使用卫生标准范围的防腐剂有苯甲酸、苯甲酸钠、山 梨酸等,,个品种，年产量约,,,,多吨，除乳链球菌肽属天然防腐剂(年产, 吨)外，其余均为化学合成品。因此，开发天然防腐剂一一红曲防腐剂具有重 要意义，但目前国内外对红曲的应用只是停留在生产色素及其保健食品上，红曲防腐 剂的研究尚未有生产报道。同时，红曲的防腐作用虽有报道，但其抑制微生物的种类， 提取方法和防腐效率国内外研究甚少。因此分离优良红曲霉菌株，并通过对红曲霉 发酵液中活性物质抑菌作用的研究，确定最佳的工艺条件，从而开发具有抑菌 和着色双重功效的红曲防腐产品，符合天然食品添加剂替代合成食品添加剂的 发展方向，具有很好的市场前景。 ,, 第一章文献综述 ,(,本论文的主要研究内容 本论文意在进行高色价、低桔霉素产量的红曲霉菌株的分离，红曲霉产色素液 体深层发酵工艺条件优化，红曲色素抑菌特性，桔霉素检测方法等方面的研究。 在红曲霉菌株的分离方面，分离并确定红曲霉菌株(并对其产色素条件作 研究，检测其产桔霉素能力，确定其研究和开发前景。 在液体深层发酵工艺条件优化研究中主要是确定最佳碳源、氮源、金属离子添加量 以及温度、,,、培养时间等对红曲霉产色素能力的影响，使其达到最大产色素能力。 在红曲色素抑菌特性方面，主要研究红曲霉胞外发酵液和胞内浸提液对大肠杆菌， 金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，酵母菌，黑曲霉和米曲霉等的抑菌性，并与桔霉素抑 菌性进行比较，分析红曲色素与桔霉素抑菌性方面的差异。 桔霉素检测方法主要是通过薄板层析和液相色谱结合的方法，定性和定量的 确定红曲霉发酵液中桔霉素的含量，从而可以检测分离出的红曲霉所产色素的 桔霉素含量，确定其安全性。 第二章红曲霉分离及液态发酵工艺条件优化 第二章红曲霉分离及液态发酵工艺条件优化 ,(,实验材料与方法 ,(,(,实验材料 ,(,(,(,实验菌种 红曲霉,,,,(,，,,编号) 购于中国工业微生物保藏中心 红曲霉,,,, 微生物教研室分离保藏 ,(,(,(,实验试剂 名称 纯度 生产厂家 葡萄糖 分析纯 成都化学试剂厂 ,,, 谷氨酸钠 沈阳红梅味精股份有限公司 硫酸锌 分析纯 沈阳市新城化工厂 沈阳市试剂一厂 磷酸二氢钾 分析纯 磷酸氢二钾 分析纯 沈阳市试剂五厂 硫酸镁 天津开发区海晶精细化工厂 分析纯 硫酸锰 分析纯 大连市华中试剂厂 分析纯 蔗糖 北京化工厂 福建泉州市泉港化工厂出品 琼脂 硝酸钠 分析纯 天津市科密欧化学试剂开发中心 硫酸铁 分析纯 北京化学试剂三厂 公主岭市化学试剂厂 乙酸乙酯 分析纯 分析纯 沈阳市试剂五厂 苯 天津市科密欧化学试剂开发中心 分析纯 氯仿 分析纯 天津市广成化学试剂有限公司 丙酮 化学纯 可溶性淀粉 浙江湖州食品化工联合公司 分析纯 大连市华中试剂厂 无水乙醇 ,, 第二章红曲霉分离及液态发酵工艺条件优化 甘油 大连无机化工厂 分析纯 果胶 上海试剂二厂 棉子糖 分析纯 中国预防医学科学院劳卫所 松三糖 分析纯 上海试剂二厂 纤维二糖 分析纯 中国预防医学科学院劳卫所 海藻糖 分析纯 浙江永嘉精细化工厂 阿拉伯糖 分析纯 上海试,,,厂 ,(木糖 分析纯 上海试剂二厂 正丁醇 分析纯 丹东市集贤化学试剂厂 沈阳试剂一厂 尿素 分析纯 酵母膏 沈阳试剂一厂 蛋白胨 中国预防医学科学院劳卫所 分析纯 上海试,,,厂 酪蛋白 沈阳试剂一厂 硫酸铵 分析纯 上海试剂二厂 ,一赖氨酸 分析纯 层析纯 上海试剂二厂 丙氨酸 ,,,色氨酸 层析纯 上海试剂二厂 甘氨酸 层析纯 上海试,,,厂 上海康达氨基酸厂 层析纯 ,,,天门东氨酸 层析纯 上海化学试剂采购供应站试剂厂 谷氨酰胺 中国科学院上海生物化学研究所 分析纯 半胱氨酸 北京化工厂 酒石酸铵 分析纯 ,(,(,(,实验仪器与设备 开封大河机电厂 煤电两用手提式消毒器 沈阳市第四十五中学电器厂 电热恒温培养箱 国营沈阳医疗器械厂 电热鼓风烘箱 上海医疗器械八厂 架盘药物天平 哈尔滨市东明医疗仪器厂 ，,,,,,空气浴振荡器 上海安亭科学仪器厂 ,,,,,,,台式离心机 上海精密科学仪器有限公司 ,,,,分光光度计 ,, 第二章红曲霉分离及液态发酵工艺条件优化 电光分析天平上海天平仪器厂 恒温水浴锅巩义市英裕予华仪器厂 电子调温万用电炉龙口市先科仪器公司 生物显微镜上海光明仪器厂 ,(,(,(,培养基,,,，,, , (,)麦芽汁培养基 ,波美度的麦芽汁(,,约,(,)加入,(,,琼脂。 (,)马铃薯蔗糖培养基 马铃薯，,,,,;蔗糖，,,,;琼脂，,,,;水，,,,,,,。 制法:马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸半小时，然后用纱布过滤，滤液加糖和琼 脂，熔化后，补足水分至,,,,,,。 (,),,,培养基 ,,,,,，,,,,;,,，,，,,,，,,,,;,,,，,(,,,,，,,,,,?,,,,，,(, ,,,,;,,,,,。,,,,,,， ,(,,,,,;酵母膏，,,，,,;琼脂，,,,,,;蔗糖，,,,,,;水，,,,,,,。 (,)查氏培养基 ,,,,,，,,;,,,，,(,,;,,，,，,,,，,,:,,,,,，,(,,;, ,,,,，,(,,,;蔗糖，,,,: 琼脂，,,:,,,,,,,;水，,,,,, ,。 (,)大米培养基 大米，,,,,;葡萄糖，,,,;琼脂，,,,;水，,,,,,,, 制法:大米加水煮沸半小时，然后用纱布过滤，滤液加糖和琼脂，溶化后，补足水 分至,,,,,,。 (,),,,固体培养基 葡萄糖，,,,,,;谷氨酸钠，,,,,;,,,,,?,，,,,,，,(,,,,;,, ,,,，,(,,,,;,,,,,,， ,,,,:,,,,,,，,,,,;,,,,,?,,,，,(,,,,:,,,,,。,，,,,,，,(,,,,,:琼脂，,,:,,,,,,: 水，,,,,,,:,,，，,(,。 (,),,,液体发酵培养基 葡萄糖，,,,,,;谷氨酸钠，,,，,,;,,,,,?,，,,,,，,(,,,,;, ,,,,，,(,,,,;,,,,,,， ,,,,;,,,,,,，,,,,;,,,,,:,,,，,(,,,,(，;,,,,,?,,,,，,(,,,,,:水，,,,,,,;,,， ,,。 ,, 第二章红曲霉分离及液态发酵工艺条件优化 ,(,(,实验方法 ,(,(,(,红曲霉培养方法 将红曲霉接种于麦芽汁培养基斜面上，,,?条件下恒温培养,天，产生的大量孢子 可供液体培养接种使用。将斜面孢子剥下，溶于无菌水中，用玻璃珠将其打碎，适当稀 释(含孢子数约,,,个,,,)，取,,,孢子悬浊液加入到已灭菌的、装液量为,,,,的 ,,,,,三角瓶中，于往复式摇床,,,,,,,,，,,,,,?条件下培养,天。 ,(,(,(,红曲霉形态特征观察方;去,, ,】 将分离得到的微生物孢子用玻璃珠打碎，无菌水逐步稀释，分别涂布于麦 芽汁培养基上，,,:,条件下恒温培养,天，挑取使培养基变红的单个菌株，再用无菌水 逐步稀释，分别涂布于麦芽汁培养基上，,,?条件下恒温培养,天，如此培养，一直 到所分离获得的菌种无杂菌为止。 按照,(,(,(,配制培养基，并湿热灭菌，条件为,,,?，,,,,,。灭菌之后的培养基 在无菌室内分别倒平板，冷却至培养基凝固。取一支红曲霉，用接种针在每个培养基平 板上接种,环，三环均匀分布于平板内，然后放入培养箱内，在,,:,，培养,天。观察 菌落色泽、大小、结构、质地;在显微镜下观察菌丝、子囊孢子、分生孢子等。 ,(,(,(,培养基配制方法 (,)不同碳源培养基的配制方法 以相同添加量的不同碳源代替,,,液体发酵培养基中的葡萄糖，其它成分不变。 (,)不同氮源培养基的配制方法 以相同添加量的不同氮源代替,,,液体发酵培养基中的谷氨酸钠，其它成分不变。 ,(,(,(,红曲霉胞外发酵液色价测定方法,,,，,,，,, , 取红曲霉三角瓶培养的发酵液，用移液管或小量筒取少量(,,,,,,,,)，过滤除去 菌体，用水适当稀释，,,,,,,,,,离心,,,,，取上清液，以水做空白对照，分光光度计 测其在,,,,,、,,,,,下的,,值。 红色素色价计算公式:色价,,,,,,×稀释倍数; 黄色素色价计算公式:色价,,,,,,,,稀释倍数; ,(,(,(,红曲霉胞内浸提液色价测定方法【,,，, ,，,,, ,, 第二章红曲霉分离及液态发酵工艺条件优化 取红曲霉三角瓶培养的发酵液，用移液管或小量筒取少量(,:,,,,,,,)，过滤收集 菌体，用,,,(体积分数)乙醇浸提，,,。,振荡萃取(,:,)，,,,后，所得浸提液在离 心 机中以,,,,,,,,,,离心,,,,,，取上清液用,,,乙醇稀释，以,,,(体积分数) 乙醇做空 白对照，分光光度计测其在,,,,,、,,,,,下的,,值。 红色素色价计算公式:色价,,,,,,,稀释倍数; 黄色素色价计算公式:色价,,,,,,×稀释倍数; ,(,(,(,菌体生物量的测定方法,,, 取一定量发酵液，过滤除去上清液，放入已知重量的瓶皿或烧杯内于,,,?烘干至 恒重，取出冷却至室温，称重，与容器重量相减即为菌体生物量。 ,(,(,(,红曲霉发酵液,,测定方法 采用精密数显,,计法。 ,(,(,(,红曲霉红、黄色素总色价计算方法 将红曲霉胞外发酵液或胞内浸提液中测得的红、黄色价相加，即为红、黄色素总色 价。 总色价计算公式:总色价,色价渺,发酵液，色价胞内漫提液 ,(,实验结果与讨论 ,(,(,红曲霉形态特征观察结果 表,(,未知红曲霉在不同培养基上的形态特征 ,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,～些～璺～里～～～～～～里～～～～～～～ 呈』竺旦～垦～～坚兰 培养基形态特征 砉汁直径,:,(,,,,，背面鲜红色，多皱，辐射不明显，正面淡红色，中央多毛 ,,,百直径,(,,,左右，背面深红色，菌落边缘不规则，多毛，辐射明显，正面红色 ,,,直径,(,;,左右，背面紫红色，正面暗红色，无毛，无褶皱，边缘规则 杏氏直径,(,,,,,左右，背面淡黄色，边缘不规则，正面淡黄色，多毛 大米直径,(,,,,,，背面暗红色，边缘明显正面粉红色，无褶皱，有少量毛 ,,,直径,;,左右，背面深红色，菌落边缘不规则，多毛，正面粉红色 ,, 第二章红曲霉分离及液态发酵工艺条件优化 表,(,未知红曲霉显微镜观察结果 ,,,,—,,,,,,;,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,;,, 结 构显微镜下观察结果 幺幺 菌 气菌丝呈赭色 孢子 子囊 卵形，,,,×,,, 分生 孢子 球形，直径,,归 按照,(,(,(,方法培养和观察分离得到的红曲霉，结果见表,(,，,(,:从表中所得 结 果，初步确定未知红曲霉为红色红曲霉，暂定名为,,,,。 ,(,(,红曲霉最佳胞内浸提液的选择 液态发酵的红曲霉菌体内含有大量的色素，可采用有机溶剂破壁浸提萃取的方法。 本实验选择红曲行业中常用的提取溶剂乙酸乙酯、苯、氯仿、无水乙醇、,,,乙醇、 ,,,乙醇、丙酮在,,。,条件下振荡浸提同一重量的样品，结果如下: 表,—,不同有机溶剂萃取液色价 ,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,？,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,;,,,,,,,,, 从表,(,可以看出，无水乙醇、,,,乙醇、,,,乙醇提取效果明显强于苯、氯仿和 丙酮的提取效果，而,,,乙醇提取效果好于无水乙醇、,,,乙醇的提取效果，这可能是 由于乙醇溶液形成较大的渗透压，促使细胞破裂，使细胞内色素物质释放到溶液中，而 ,,,乙醇溶液易于萃取红曲霉细胞内的醇溶性色素和少量的水溶性色素，所以形成了较 ,, 第二章红曲霉分离及液态发酵工艺条件优化 高的红、黄色素色价。 ,(,(,红曲霉,,,,与,,,,产色素能力比较结果 从表,一,可以看出，红曲霉,,,,在,,,培养基生长良好。因此，将红曲霉 ,,,,接种于,,,液体发酵培养基，并与红曲霉,,,,比较其产色素能力。 按照,(,(,(,方法培养红曲霉，按照,(,(,(,和,(,(,(,的方法分别测定胞 内、外色价， ,(,(,(,的方法测定菌体干重，结果如下: 表,,,红曲霉,,,,，,,,,产色素能力比较 ,,,,?,,,,;,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,, 从表,(,可以看出，筛选出的红曲霉,,,,在产色素能力上优于中国工业微 生物保藏中心保藏菌种,,,,，具有一定的研究价值。 ,(,(,红曲霉,,,,菌株液体发酵培养基优化 ,(,(,(,碳源对红曲霉,,,,菌株产色素和菌体生物量的影响 本实验选择,,种不同的碳源作为研究对象，碳源含量,,,,,，其余成分同,,,液 体发酵合成培养基，结果见表,(,所示。 从表,,,可以看出，以葡萄糖、可溶性淀粉、无水乙醇、松三糖、阿拉伯糖和丁醇 为碳源的培养基中，胞外发酵液和胞内浸提液红、黄色价均较高，而以果胶、棉子糖、 海藻糖为碳源的胞外发酵液和胞内浸提液中，红、黄色价均较低，这说明前几种碳源容 易被红曲霉,,,,利用，刺激了色素的产生，而后几种无法被利用，甚至起到抑制色素 分泌的作用;对于除纤维二糖、海藻糖、,(木糖等的大多数碳源，胞内浸提液色价均远 高于胞外发酵液色价，这是由于红曲色素主要分泌于细胞内，而只有一小部分分泌到细 胞外;大部分胞外黄色素色价高于红色素色价，而大部分胞内红色素色价往往高于黄色 素色价，这可能是因为黄色素易于分泌到细胞外的缘故;以葡萄糖作为碳源红、黄色素 ,, 表,(,不同碳源对红曲霉色素产量和菌体生物量的影响 ,,,,?,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,, ,,,,,,,,;,,,,,,, ,,，,,,,,,,,,,,,,,, ;,, …,胞外发酵液(水)胞内浸提液(,,,乙醇)菌体生物量碳源。…。。一? ——,,,一,,姗,,,,,咖黄,,,,,。红,,,,,。黄(,,,) 注:色价单位为,,,,，。 色价最高，甘油和丁醇与之相差不大;以可溶性淀粉为碳源产生的红曲霉菌体生物量最 高，海藻糖最低，红曲霉几乎未生长。 ,(,(,(,氮源对红曲霉,,,,菌株产色素和菌体生物量的影响 本实验选择,,种不同的氨源作为研究对象，氮源含量,,,,，其余成分同,,,液 体发酵合成培养基，结果见表,,,所示。 从表,,,可以看出，除尿素外，其它氮源均能促使红曲霉色素的产生;采用氨基酸 类物质作为氮源比无机氮源更利于红曲霉色素的产生;酵母膏、酪蛋白、蛋白胨营养丰 富，红曲霉色素多分泌于细胞外，胞外发酵液色价高;硫酸铵和酒石酸铵利于菌体生长， 但色价相对较低;酵母膏、酪蛋白、甘氨酸、谷氨酰胺等氮源与谷氨酸钠均能促使红曲 霉产生较高的色价，但综合考虑桔霉素和价格等因素，谷氨酸钠是工业化生产比较理想 ,, 表,,,不同氮源对红曲霉色素产量和菌体生物量的影响 ,,,,—,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,, ,,,,,,,,,,;,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,;,, …胞外发酵液(水)胞内浸提液(,,,乙醇)菌体生物 量氮源一一…一?…一…一 注:色价单位为,,,,。 的氮源。 ,。,。,。,金属离子浓度对红曲霉,,,,菌株产色素的影响 无机盐是微生物生长必不可缺少的一类营养物质，它们在机体中的生理功能主要是 作为酶活性中心的组成部分、维持生物大分子和细胞结构的稳定性、调节并维持细胞的 渗透性平衡、控制细胞的氧化还原电位和作为某些微生物生长的能源物质等。在微生物 的生长过程中还需要一些微量元素，微量元素是指那些在微生物生长过程中起重要作 用，而机体对这些元素的需要量极小的元素，微量元素一般参与酶的组成或使酶活化。 以下实验考察发酵工业中重要的,,“、,,,，、,,,，离子对红曲霉的影响。 ,, 第二章红曲霉分离及液态发酵工艺条件优化 (,),,,，离子对红曲霉,,,,菌株产色素的影响 本实验选择不同,,,，离子添加量，其余条件同,,,液体发酵合成培养基。实验结 果见图,(,所示: ,, ,, ,,, 逞 团红色素总色价 ,,, 翥,, 圈黄色素总色价 ,, ,, ,(,,,(,,,,,(,,, 添加量(,) 图,,,不同,,,，离子添加量对红曲色素产量的影 响 ,,,,(,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;, ,,,,,,,,,,,,,;,,,, 从图,,,可以看出，,,,，离子的添加对红曲霉产色素有极大的促进作用，这可能是 因为,,,，离子是红曲色素合成酶系中的重要金属离子，但添加量达到,,,以后促进 效 ? 踮 囫红色素总色价 ? ,, ? 圈黄色素总色价 ，,,?,,】 ,,如 明 ? ,,,,,,,, 添加量(,) 图,,,不同孙?离子添加量对红曲色素产量的影响 ,,,,(,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ;,,,,,,,,,,,,,,;,,,, ,, 第二章红曲霉分离及液态发酵工艺条件优化 果已不显著，可能是,,,，离子出现了过剩现象，因此，从经济效益考虑，,,,的添加 量比较合适。 (,),,,，离子对红曲霉,,,,菌株产色素的影响 实验中选择不同,,,，离子添加量，其余条件同,,,液体发酵合成培养基，实验结 果如图,(,所示。 从图,(,可以看出，适量添加,,,，离子对红曲霉产色素的产生有刺激作用，但过多 的添加反而抑制了色素的形成，这可能是因为过量的,,,，离子影响了红曲色素合成酶系 的螯合作用，促使红曲色素合成减少，因此，合适的,,,，离子添加量是,,。 (,),,,十离子对红曲霉,,,,菌株产色素的影响 实验中选择不同,,,，离子添加量，其余条件同,,,液体发酵合成培养基。其实验 结果如图,(,所示: ,, ,, —,, 囫红色素总色价 窭, ,, ,,, 蝴,, 圈黄色素总色价 ,, ,, ,,(,,(,,(,,(,,(, 添加量(,) 图,,,不同,,,，离子添加量对红曲色素产量的影响 ,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,，,,,,,,,,,,,,,;,,,, 从图,(,可以看出，,,,，离子对红曲霉产色素的产生有强烈的抑制作用，可能是,,,， 离子干扰了红曲色素合成酶系的形成，因此，培养基中应禁止添加含,,,十离子的化合物。 ,(,(,红曲霉,,,,菌株液体发酵工艺参数的确定 ,(,(,(,培养温度对红曲霉,,,,菌株色素产量的影晌 实验中选择,,士,?、,,,士,。,、,,,,,,。,和,,士,?四种不同培养温度， 其它条件同 第二章红曲霉分离及液态发酵工艺条件优化 ,,,液体发酵合成培养基。其实验结果如图,,,所示: ， 囫红色素总色价 室 蚤 棚 圈黄色素总色价 鳃,姐眈?他伯 似他阳 ,,,, ,,,, 温度 (?) 图,(,培养温度对红曲色素产量的影响 ,,,,(,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,;,,,, 从图,(,可以看出，,,:,,,,:,均适合红曲色素的产生，,,:,不利于红曲色素的生 成，,,:,左右是红曲霉培养的最适培养温度。 ,(,(,(,培养基起始,,对红曲霉,,,,菌株色素产量的影响 实验中选择不同的培养基起始,,，其余条件同,,,液体发酵合成培养基。其实验 结果如图,(,所示: , , ,, , 豳红色素总色价 , , 耋, ,, 盎脚 圈黄色素总色价 ,, , ,,(,,,(,,,(,, ,, 图,,,培养基起始,,对红曲色素产量的影响 ,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,, 第二章红曲霉分离及液态发酵工艺条件优化 从图,,,可以看出，弱酸和中性起始,,利于红曲色素的产生，强酸和碱性起始,, 红曲色素色价较低，,,,最适合红曲色素的生成。 ,(,(,(,通气量大小对红曲霉,,,,菌株色素产量的影响 实验中采用棉塞(低溶氧)和六层纱布(高溶氧)来控制通气量大小，其余条件同 ,,,液体发酵合成培养基。其实验结果如图,,,所示: ,,, 囫红色素总色价 ,,,一 姜,,一 ?,,, 圈黄色素总色价 脚,, , 棉塞纱布 图,(,通气量大小对红曲色素产量的影响 ,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,, 扣 ? , 十红色素 总色价 , ? ,, 巾黄色素 鲁 总色价 ? 嘲,王 ,《, ,×一菌体生 三 划,,， 柏 物量 脚 ,羞 巾发酵液 ? ,, , , ,,,,,,,,,,,, 时间(,,,) 图,,,红曲霉,,,,菌株发酵过程曲线 ,,,,—,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,;,,,,,, 从图,,,可以看出，棉塞和六层纱布使红曲霉发酵液获得了不同的氧气量，但测得 ,, 第二章红曲霉分离及液态发酵工艺条件优化 色价结果几乎无差别，所以，这两种通气量对红曲色素的产生没有太大影响。 ,(,(,红曲霉,,,,菌株液体发酵过程的研究 根据以上实验结果，培养基优化为葡萄糖，,,,,,;谷氨酸钠，,,,,;,,,,,?, ,,,， ,(,,,,;,,,,,，,(,,,,;,,，,，,,,，,,,,;,，,,,,,,,，,,,,;,,,,,„，,,,,，,(,,,,;水， ,,,,,,，不添加硫酸铁;培养条件为温度,,,,，,,?，培养基起始,,为,(,，其它条件不 变。将红曲霉液体发酵培养,,天，每天测定红、黄色素色价，菌体生物量和发酵液,,， 其实验结果如图,(,。 从图,(,可以看出，红曲霉液体发酵的前两天，菌体生长缓慢，红曲色素色价很低， 微生物生长处于延滞期;第,天到第,天，菌体生长旺盛，色素大量形成，此时，红曲 霉进入对数生长期，,,,,天，菌体生物量和色素色价基本稳定，微生物生长进入稳定期， 此时红色素总色价达到,,(,,,,,,左右，黄色素总色价达到,,(,,,,,,左右，菌体生物 量达到,(,,,,,;以后红曲霉生长将进入衰退期，色价和菌体生物量将下降。整个发酵 过程中,,变化不大，菌体始终处于微酸性环境中。从液态发酵曲线可以看出，,天为 最佳培养时间。 ,(,本章小结 通过分离，得到一株红曲霉菌株，经菌种初步鉴定为红色红曲霉，并暂命名 为红曲霉,,,,:通过液态深层发酵发现红曲霉,,,,在产色素能力上优于中国工业 微生物保藏中心保藏菌种,,,,，具有一定的研究价值。通过试验确定,,,乙醇为胞内 红曲色素最佳提取有机溶剂，然后对红曲霉,,,,液态发酵工艺条件进行了研究，确定 了最佳培养基配方为葡萄糖，,,,,,;谷氨酸钠，,,,,;,,,,,。,，,,,,，,(,,,,;,,,,,， ,(,,,,;,,,,,,，,,,,;,,,,,,，,,,,;,,,,,?,,,，,(,,,,;水，,,,,,,。培养条件 优化为培养温度为,,，,?，培养基起始,,为,(,，培养时间为,天。经工艺条件优化， 红曲霉红色素总色价达到,,(,,,,,,，比初始条件提高,,(,,，黄色素总色价达到 ,,(,,,,,,,，比初始条件提高,,(,,，菌体生物量达到,(,,,,,。下章将对分离得到的红 曲色素作抑菌活性方面研究。 第三章红曲色素和桔霉素抑菌特性研究 第三章红曲色素和桔霉素抑菌特性研究 ,(,实验材料与方法 ,(,(,实验材料 ,(,(,(,实验菌种 红曲霉,,,,(,，,,编号) 购于中国工业微生物保藏中心 红曲霉,,,, 微生物教研室分离保藏 大肠杆菌 微生物教研室提供 枯草芽孢杆菌 微生物教研室提供 金黄色葡萄球菌 微生物教研室提供 啤酒酵母 微生物教研室提供 热带假丝酵母 微生物教研室提供 微生物教研室提供 黄曲霉 黑曲霉 微生物教研室提供 米曲霉 微生物教研室提供 ,(,(,(,实验试剂 生产厂家 名称纯度 桔霉素,,(,, ,,,,,公司 成都化学试剂厂 葡萄糖分析纯 沈阳红梅味精股份有限公司 谷氨酸钠,,, 硫酸锌分析纯 沈阳市新城化工厂 沈阳市试剂一厂 磷酸二氢钾分析纯 磷酸氢二钾分析纯 沈阳市试剂五厂 天津开发区海晶精细化工厂 硫酸镁分析纯 大连市华中试剂厂 硫酸锰分析纯 中国预防医学科学院劳卫所 蛋白胨 第三章红曲色素和桔霉素抑菌特性研究 牛肉膏 成都市华西生化制品厂 酵母膏 上海酵母厂 琼脂 福建泉州市泉港化工厂 无水乙醇分析纯 大连市华中试剂厂 ,(,(,。,实验仪器与设备 开封大河机电厂 煤电两用手提式消毒器 沈阳市第四十五中学电器厂 电热恒温培养箱 国营沈阳医疗器械厂 电热鼓风烘箱 架盘药物天平 上海医疗器械八厂 上海光明仪器厂 生物显微镜 冰箱 海尔集团股份有限公司 微量进样器 上海求情生化试剂仪器有限公司 ,,,,,空气浴振荡器 哈尔滨市东明医疗仪器厂 电子调温万用电炉 龙口市先科仪器公司 数码相机 日本富士公司 ,(,(,(,培养基 (,)麦芽汁固体保藏培养基 ,波美度的麦芽汁(,,约,(,)加入,(,,琼脂。 (,),,,液体发酵合成培养基 葡萄糖，,,,,,;谷氨酸钠，,,，,,，,,,,,?,,,,,，,(,,,,，,,,,,，,(,, ,,，,,,,,,， ,,,,，,,,,,,，,,,,，,,,,,„,:,，,(,,,,，;才,，,,,,,,;,,，,(,。 (,)细菌培养基 蛋白胨，,,;牛肉膏，,(,,;酵母膏，,,;琼脂，,,,，水，,,,,,,:,,， ,(,。 ,(,(,实验方法 ,(,(,(,红曲霉培养方法 同,(,(,(,方法，培养时间改为,天，其它条件不变。 ,(,(,(,桔霉素配制方法 ,, 第三章红曲色素和桔霉索抑菌特性研究 准确称取桔霉素标准品，用乙醇定容至所需浓度，冰箱冷藏保存待用。 ,(,(,(,抑菌实验方法(滤纸片法),，,,, (,,)液体发酵培养红曲霉,,,,、,,,,，分别制备胞外发酵液(水)和胞内浸提液 (,,,乙醇)。 (,)制备不同浓度的桔霉素溶液 (,)将滤纸剪成直径为,,,,左右的滤纸片，与试管、三角瓶、培养皿、吸管、玻璃珠 等玻璃仪器一起干热灭菌(,,,?，,,)。 (,)将实验菌株用接菌环剥下，玻璃珠打碎，无菌水稀释为,,,，,,,的菌悬液。取 ,(,,,的菌液接入相应的培养基中，用无菌涂布器涂布均匀。 (,)将干热灭菌后的滤纸片放入无菌平皿中，向平皿中加入红曲色素胞外发酵液(水) 和胞内浸提液(,,,乙醇)，浸泡,,分钟。取出滤纸片，在,,。,条件下干燥,,,,, 左右。待滤纸片完全干燥后，取出滤纸片，备用。 (,)将已经干燥好的滤纸片，贴在已经涂有菌液的平板上，每个平板贴,:,,,个滤纸片。 细菌置,,?培养,,小时，酵母菌,,。,培养,,小时，霉菌置,,:,培养,,小时。 直尺测抑菌圈大小。 (,)将干热灭菌后的滤纸片贴在已经涂有菌液的平板上，每个平板贴,:,,,,个滤纸片。 将不同浓度的桔霉素溶液通过微量进样器注入到已灭菌的滤纸片的表面，细菌置 ,,:,培养,,小时，酵母菌,,。,培养,,小时，霉菌置,,:,培养,,小时。直尺 测 抑菌圈大小。 ,(,实验结果与讨论 ,(,(,红曲色素抑菌特性的研究 ,(,(,(,红曲色素抑菌实验原理 利用滤纸片法进行抑菌实验的原理:浸有不同浓度红曲霉发酵液(或浸提液)的滤 纸片，加入到涂布有实验菌的琼脂培养基平板上。抑菌物质分子随溶剂向培养基内呈放 射状扩散，同时将培养基平板置培养箱中培养，琼脂培养基内的实验菌开始生长。抑菌 物质在琼脂培养基中的浓度，随离开滤纸片的距离增大而降低，离滤纸片愈远处，琼脂 培养基中抑菌物质的浓度愈低;当抑菌物质分子扩散到,定的时间，这时琼脂培养基中 第三,红,,,,色索?桔霉隶抻萄特悱研究 抑菌物质的浓度恰高于改抑菌物质对实验菌的最低抑苗浓度，实验菌的生长被抑制，就 形成透明的抑菌圈。在抑菌圈的边缘处，琼脂培养基中所含抑菌物质的浓度，应为抑菌 (供试苗为金黄色葡萄球菌)(供试菌为枯草芽孢杆菌) 供试苗为人肠杆卣)(供试苗为啤酒酵母)(供试菌为热带假丝酵母 供试菌为黄曲霉)(供试苗为米曲霉) 图,,,红曲色素抑菌圈 ,,,,—,,,,,,,,,,;,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,, 第三章红曲色素和桔霉素抑菌特性研究 物质对实验菌的最低抑菌浓度。 ,(,(,(,红曲色素抑菌实验结果 利用滤纸片法，对红曲霉,,,,、,,,,胞外发酵液和胞内浸提液进行抑菌试验，分 别以细菌、酵母菌和霉菌为供试菌，所得结果如图,(,所示: 为了验证红曲霉胞外发酵液和胞内浸提液中起抑菌作用的是红曲色素本身，而非水 和,,,的乙醇溶液的作用，分别以无菌水、,,,乙醇溶液对供试菌进行空白试验，结果 表明水和,,,的乙醇对各种供试菌无抑制作用，从而说明抑菌物质是红曲色素中的成 分。直尺测量红曲色素抑菌圈大小，结果如下表所示: 表,(,红曲色素抑菌圈直径大小(滤纸片直径,,,,) ,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,(,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,) 注:“一”表示无抑菌效果。 从上表可以看出，红曲色素对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)具 有较强的抑制作用，对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)、酵母菌(啤酒酵母、热带假丝酵母) 和霉菌(黄曲霉、米曲霉、黑曲霉)无抑制作用。又因为红曲霉,,,,色价低于,,,,， 而抑菌圈也小于,,,,;胞外发酵液色价低于胞内浸提液色价，而胞外发酵液抑菌圈也小 于胞内浸提液，所以抑菌圈大小和红曲色素浓度成正相关性。这也表明红曲抑菌物质存 在于红曲色素中。 ,, 第～章红曲色亲和桔霉索抑苗特性:宄 ,,,桔霉素抑菌特性的研究 供试茁为金黄色葡萄球菌)(供试苗为枯草芽孢杆茁)(供试苗为人肠杆菌 供试菌为啤酒酵母)(供试菌为热带假丝酵母) 供试茁为黄曲霉)(供试苗为米曲霉)(供试苗为黑曲霉 幽,,,桔霉素抑苗刚 ,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,;,,,,,,;,,,,,,, 第三章红曲色素和桔霉素抑菌特性研究 ,。,(,(,桔霉素抑菌实验原理 同,(,(,(,。 ,(,(,(,桔霉素抑菌实验结果 利用滤纸片法，对不同浓度的桔霉素进行抑菌试验，分别以细菌、酵母菌和霉菌 为供试菌，桔霉素添加量为,止，实验结果如图,(,所示。 同样以水和无水乙醇溶液对供试菌进行空白试验，结果表明水和无水乙醇对各种供 试菌无抑制作用，直尺测量抑菌圈大小，其结果如下表所示: 表,(,桔霉索抑菌圈直径大小(滤纸片直径,,,,) ,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,) 注:“一”表示无抑菌效果。 从上表可以看出，桔霉素对细菌具有较强的抑制作用，对酵母菌抑制作用较弱，对 霉菌无抑制作用。桔霉素浓度越大，抑菌圈越大，这说明抑菌圈大小与桔霉素浓度成正 相关性。 取不同浓度的桔霉素溶液对枯草芽孢杆菌作最小抑菌浓度实验，结果如图,—,所示。 从图中可以看出桔霉素对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度是,(,,,』,,，,(,，即最小抑菌量为 ,(,,,(,。 ,, 第二,组曲色毋?桔霉素抻苗特性目,究 酗,,,桔霉秉最小抻茁浓度刚 ,?,,,,,,,,,，,,,,,, ;,,,,,,;,,,,,,;,,, ,,,, ,(,(,红曲色素与桔霉素抑菌特性,,鞍 红曲色素与桔霉素在抑菌性方面有差异。桔霉素抑茼范围广泛，对革兰氏阴性菌 (大肠杆菌)、酵母菌(啤酒酵母、热带假丝酵母)等微生物也有抑制作用，而红曲色 素对咀上苗种无抑制作用。从这里可以看出红曲色素与桔霉素在抑菌性方面是不同的。 ,,本章小节 本章主要是对红曲色素和桔霉素抑菌特性的研究。通过试验得出如下结论:红曲色 素对革兰氏阳性菊具有较强的抑制作用，对革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌无抑制作用: 红曲霉胞外发酵液和胞内浸提液均含有抑菌物质，且抑菌强度与色素浓度成正相关性: 桔霉素对细菌具有较强的抑制作用，对酵母菌抑制作用较弱，对霉菌无抑制作用，抑茁 性强弱与桔霉素浓度成正相关性，最小抑苗量为,(,,,,;红曲色索与桔霉素抑菌特征并 不相同。下一章将对桔霉素的检测方法进行研究，对所获得的红曲色素台桔霉素量进行 检测，最后对红曲色素成分进行分离并对抑菌活性物质的存在情况进行分析。 第四章桔霉素检测方法及红曲色素抑菌活性物质的研究 第四章桔霉素检测方法与红曲色素抑菌活性物质的研究 ,(,实验材料与方法 ,(,(,实验材料 ,(,(,(,实验菌种 购于中国工业微生物保藏中心 红曲霉,,,,(;,,,编号) 微生物教研室分离保藏 红曲霉,,,, ,(,(,(,实验试剂 名称纯度 生产厂家 桔霉素,,(,, ,,,,,公司 乙酸乙酯分析纯 公主岭市化学试剂厂 沈阳市试剂五厂 苯分析纯 氯仿分析纯 天津市科密欧化学试剂开发中心 丙酮分析纯 天津市广成化学试剂有限公司 甲苯分析纯 沈阳市试剂五厂 甲酸分析纯 天津市化学试剂一厂 甲醇色谱纯 天津市科密欧化学试剂开发中心 沈阳试剂厂 苯甲酸钠分析纯 ,(,(,(,实验仪器与设备 开封大河机电厂 煤电两用手提式消毒器 沈阳市第四十五中学电器厂 电热恒温培养箱 新华,号滤纸 大连沈联化学试剂公司 架盘药物天平 上海医疗器械八厂 上海市安亭电子仪器厂 三用紫外仪 海尔集团股份有限公司 冰箱 上海求情生化试剂仪器有限公司 微量进样器 第四章桔霉素检测方法及红曲色素抑菌活性物质的研究 薄层色谱展开缸 上海信谊仪器厂 硅胶板,,, 山东市先科仪器公司 硅胶板,,,,, 青岛海洋化工厂分厂 ,(,(,实验方法 ,(,(,(,红曲霉培养方法 同,(,(,(,方法，培养时间改为,天，其它条件不变。 ,(,(,。,薄层层析检测方法【,,， ,,】 (,)画线:在薄板上距薄板底边,(,;,处画一条直线，在线上画间距,(,;,的圆点， 在薄板顶部再画一条直线，作为层析终止线。 点样直径不 (,)点样:微量注射器或毛细管将样品溶液点在距薄板底边直线圆点上， 超过,,,,，原点直径过大会降低分辨率和分离度。 (,)展开:将点样后的薄板的底边置于盛有展开剂的薄层色谱展开缸中， 展开剂由薄 层下端借毛细管作用上升至画线处。 (,)检测:将展开完毕的薄板取出，置通风处使层析液挥干，在,,,,,紫外灯下观察 荧光点，记录展开距离。 ,(,(,(,展开材料的选择【,,, 本试验采用紫外显色法进行展开材料的选择。将配制好的桔霉素标准品和样品溶液 通过毛细管点在展开材料上，放入层析缸中展开，展开剂为苯:乙酸乙酯:甲酸(,:,:,)， 展开完毕，待溶剂挥干后，,,,,,紫外灯下检测，观察荧光情况。 ,(,(,(,展开剂的选择降, 本试验采用微量圆环法进行展开剂的选择。将欲分离物质的溶液间隔点在薄板上， 待溶剂挥干后，用吸满不同展开剂的毛细管点在不同样品点的中心，借毛细作用，展开 剂从圆心向外扩展，这样就出现了不同的圆心色谱，经过比较就可以找到最合适的展开 剂。 ,(,(,(,桔霉素的展开 将桔霉素标准品点板，展开，记录展开距离，计算,,值: ,, 第四章桔霉素检测方法及红曲色素抑菌活性物质的研究 。斑点中心与起始原点线距离州 起始原点线与层析终止线距离 ,(,(,(,红曲色素的展开 展开剂确定以后，将红曲色素和桔霉素标准品一同展开，观察红曲色素中桔霉素的 存在情况。 ,(,(,(,桔霉素,,,,测定方法,,,,, ,, 将浓度,(,,彬止桔霉素和红曲色素样品点于硅胶板上，层析展开分离，,(,,加(,处用小刀将硅胶铲下，溶于甲醇溶液中。大量收集，浓缩,,倍，,,,,,,,,,在,,值 离 心,,,,,,，取上清液过,(,,,,,滤膜，超声波脱气,,,,,,，,,,,测定桔霉素含量。 高效液相色谱仪:大连依利特 流动相:甲醇:水(,,:,,，,:,); 检测器:紫外检测器(波长,,,,,); 色谱柱:,,,,,,，,,,,,,,，,,,,，,,(,,,,,,, ,,; 流速:,(,,,,,,,,,; 柱温:,,?; 进样量:,,止。 ,(,(,(,红曲色素板层析分离方法 将浓缩的红曲色素样品点于硅胶板上，层析展开分离，根据色素颜色和荧光颜色， 用小刀将其分别铲下，溶于甲醇溶液中。大量收集，提取后，将溶液,,,,,,,,,,离心,,,,,,， 取上清液作抑菌试验。 ,(,(,(,抑菌试验方法 同,(,(,(,方法。 ,(,实验结果与讨论 ,(,(,桔霉素板层析方法的研究 ,(,(,(,展开材料的选择结果 ,, 第四章桔霉素检测方法及红曲色素抑菌活性物质的研究 本试验选择新华,号滤纸，硅胶板,,,,,和硅胶板,,,三种常用薄层层析材料进 行实验，其结果如下表所示: 表,?,不同材料桔霉素和红曲色素展开效果 ,,,,,—,—,——,—,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ;,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,, 从表,,,可以看出，硅胶板,,,相对于其他两种材料，桔霉素和红曲色素展开效 果均较好，所以选择硅胶板,,,作为薄层层析材料。 ,(,(,(,展开剂的选择结果 采用不同的展开剂和配比，对红曲色素样品进行实验，展开效果如下表所示: 表,(,不同展开剂对红曲色素的展开效果 ,,,一,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,;,,,,,,,,, 由上表可知，甲苯:乙酸乙酯:甲酸(,:,:,)展开效果最好，所以选择其为展开剂。 ,, 鼐?十,，符《性测,往,，,“曲也《忡?,性功赝日勺“, ,,,,桔霉素标准品的展开 选择硅胶板,,,,展不剂为甲苯:乙酸乙酶:甲酸(,:,:,)(对浓度为,,,(“,的 桔霉素标准品进行点样、展玎(点样量如图中数字标注，结果如下,冬,所示: 幽,,,桔霉囊展开情况剀(桔霉索浓度:,,岵，儿) ,,,,?,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,;,,,,,,,(;, ,,,,,,,,,;,,,,,:,，,,,,(,) 从图中,叮以看出，桔霉素斑点集中、清晰。展不效果较好。桔癣桑随点样鲭减少( 荧光强度减弱，点样浓度为,,,,时己观察不到黄绿色荧光存在，因此，用此种方法检测 桔霉索摄小检出量为,(,,(,。 采,,,桔霉紊艘不情况表 ,,,,,,,?,,,,,,,,,,,,,,,, ;,,,,,,, 点样封(,,,)荧光强度荧光点(;,)层忻渡前沿(;,),， ,,，，，，十,(,,(,,,,, ,…,,(,,(,,,,, ,…,(,,(,,,,, ,，十,(,,(,,,,, ,，,(,,(,,,,, ,,——,(,—— 注:“,”表示无荧光或无法汁掉。 第四章桔霉素检测方法及红曲色素抑菌活性物质的研究 从表,,,可以看出，桔霉素经板层析后，,,,(,,。 ,(,(,红曲色素的展开情况 以不同碳源培养红曲霉,,,,，提取胞内红曲色素与桔霉素一起点板层析，根据与桔 霉素层析,,值相同且同为黄绿色荧光可判断其中含有桔霉素，再根据荧光强度可判断 桔霉素含量相对大小，实验结果如下表所示: 表,,,不同碳源红曲色素层析结果 ,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,;,,,,,,,,, 表,(,不同氮源红曲色素层析结果 ,，,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,;,,,,,,,,, 氮源色价(,,,,,,)荧光强度 谷氨酸钠,,(,,一 酵母膏,,(,,，，，， 硝酸钠,,(,,一 酪蛋白,,(,,，， 蛋白胨,,(,,，，， 丙氨酸,,(,,一 ,,,丝氨酸,,(,,一 ,,,天门东氨酸,,(,,一 谷氨酰胺,,(,,一 酒石酸铵,,(,,十 注:“一”表示无荧光。 ,, 第州章秸霉常榆删古,强“曲色祟?茁话性物质的口『究 从表,,,可以看出，从以上几种红曲色索色价较高的碳源来看，可溶性淀粉利于桔 霉素的形成，而以葡萄糖、无水乙醇或丁醇为碳源不易形战桔霉素，可见以葡萄糖作为 碳源(安全性较高。 以不同氮源培养红曲霉,,,,，提取胞内红曲色素与桔霉素一起点板层析，实验结果 如表,—,所示，从表中可以看出，氮源不同(桔霉素的生成量变化很大，酵母膏、蛋白 胨等氮源，成分复杂，营养丰富，利于桔霉素和色素生成，而单一氨基酸类氮源只对色 素生成起到促进作用，不易生成桔霉素，因此以谷氨酸钠作为氮源比较合适。 咀葡萄糖作为碳源，谷氨酸钠作为氮源，培葬红曲霉,,,,，,,,,，将胞外发酵液和 胞内浸提液与桔霉索同时点样、层析(紫外灯下观察(结果如图所示: 鹦 露蚕瓣羁 鹣蝴 图,,,红曲色素与枯霉豢展开圈 ,,酣一,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,; ,,,,,,,,,,,,;,,,,,,, 红曲霉,,,,胞外发酵液(色价,,,,,,,,,，点样簧,,,) 红曲霉,,,,胞内浸提液(色价,,,,,,,,,,,(点样龉,, ,) 红曲霉,,,,胞外发酵液(色价,,埘,,,,,，点样鼙,,,,) 红曲霉,,,,胞内浸提液(笆价,,删,,,,,。点样姑,,,) 桔霉素标准品(浓度,,,?此，点样量,,,) 从圈,,可以看出，不同的红曲色素层析展开后，与桔霉素卧值相同处无明显黄 绿色斑点，这表明以葡萄糖作为碳源，谷氨酸钠作为氮源液体发酵培养红曲霉(其胞外 发酵液和胞内浸提液桔霉素含量低于最小检出量。 图,,,桔霉索标准品,,,,图 ,,,,(,,,,,,,,;,,,,,,; ,,,,,,, , 图,,,红曲霉,,,,胞外发酵液,,,,图 ,,胁,,,; ,,,,(,,,,,;;,,,,,,。,,,—;,, “,,,,, ,,,哪,,,,,？,,, ,, 第四章桔霉索检测方法及红曲色素抑菌活性物质的研究 ,(,(,桔霉素,,,,测定结果 为精确测定桔霉素含量，将桔霉素标准品和红曲色素样品层析，浓缩，富集处理后， ,,,,检测，结果如图,(,，,,,，,(,所示。 从图,(,可以看出，峰,为桔霉素标准品的吸收峰，保留时间为,(,,,,,。 ,,,,,,,, 图,,,红曲霉,,,,胞内浸提液,,,,图 ,,,,—,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,？,,,,,,,,,,;,,,,,, 表,(,桔霉素,,,,数据表 ,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, 嚣保留时,(,,,)峰高(,,)峰面积(,,(,,;)面积百分比(,)峰高百分比(,)( ,,(,,,,(,,,,,(,,,(,,,,,(,,,,, ,(,,,,,(,,,,, ,,(,,,,,(,, ,,(,, ,(,,,,,(,,,,, ,,(,,,,,(,, ,,(,, ,(,,,,,(,,,,, ,,(,,,,(,,,,,,(,, ,, 第四章桔霉素检测方法及红曲色素抑菌活性物质的研究 表,,,红曲霉,,,,胞内浸提液,,,,数据表 ,,,一,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,, ,,？,,,,,,,,,,;,,,,,, 从表,(,和表,,,可以看出，红曲色素各成分均不在桔霉素的保留时间,(,,,,,，这 表明红曲霉所产色素桔霉素含量低于,,,,最小检出量。桔霉素，,，,,,最小检出量为 ,(,,,,,，样品溶液浓缩,,倍，以每升发酵液可获得,,,红曲色素计算，红曲色素中桔 霉素含量低于,(,“,,,，符合日本厚生省,,,,年版的“日本食品添加剂标准:中的桔霉 素含量低于,(,鹏儋规定【,,】。 ,(,(,红曲色素抑菌活性物质的研究 ,(,(,(,红曲色素抑菌成分分析 ,, 第四章桔霉素检测方法及红曲色素抑菌活性物质的研究 表,,,红曲色素分离成分 ,,,,—,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,, ;,,,远,,,, 红曲色素点样层析后，根据其自然光下颜色和紫外灯下(入,,,,,,)的荧光颜色， 将其分为,部分，如表,,,所示。将以上成分收集，对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌 作抑菌实验，结果如下: 表,(,,红曲色素分离成分抑菌情况 ,,,,,,,,,,,,,,,删,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,, 从表,(,,可以看出，,,橙色素提取液对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有抑菌特 性，说明红曲色素中的抑菌物质存在于橙色素提取液中。 第四章桔露素榆铡方法及红曲色素抑苗活性物质的研究 ,,,,橙色素提取液与苯申酸钠抑菌强度比较 圉纩飞黪镯 洌 金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆苗 幽,《橙色囊提取液与苯甲酸钠溶液抻菌图 ,,,,石,,,,,,,,,;,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,？,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 橙色素提取液浓缩后加入甲醇适当稀释，与苯甲酸钠水溶液一同作抑菌实验，其结 果如图,,,所示。 表,,,，橙色素提取液与苯甲酸 ,,,,—,,,,,,,,,,,;,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,钠抑苗戤比较 ,,,,,？,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 浓度或色价加入量金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌 橙色素,,,,(，,,,,,,),,,,(，蛐,,,,,, 苯甲酸钠,,,，,,,此,,,,,,,,,嗍 从表,一,,可以看出，橙色素提取液与食品中常用的防腐剂苯甲酸钠对金黄色葡萄 球菌和枯草芽孢杆菌均有抑制作用，具有进一步开发为食品防腐剂产品的前景。 ,,本章小结 本章通过实验确定硅胶板,,,，展开剂甲苯:乙酸乙酯:甲酸(,:,:,)为桔霉素和 红曲色素的层折条件，并测得桔霉素,,,,,,，最小检出量,峙，以及碳、氮源对红曲 霉产桔霉素的影响。通过对最优培养基培养红曲霉所得红曲色素板层析和,,,,检测， 第四章桔霉素检测方法及红曲色素抑茵活性物质的研究 并经实验数据分析，所获得的红曲色素中桔霉素含量低于,(,嵋倌，符合日本厚生省,,,, 年版的“日本食品添加剂标准:中的有关规定。对色素成分进行分离并作抑菌实验，发 现红曲色素中的抑菌物质存在于橙色素提取液中，可能与橙色素有关。 第五章结论 第五章结论 ,(分离出一株红色红曲霉，暂定名为红曲霉,,,,。 ,(对红曲霉,,,,液态发酵工艺条件进行了研究，确定了最佳培养基配方为葡萄糖， ,,,,,;谷氨酸钠，,,,,;,,,,,。,,,,，,。,,,,;,,,,,，,(, ,,,;,,，,，,,,，,,,,; 壬?,,,，,,,,;,,,,,:,,,，,(,,,,;水，, ,,,,,。培养条件优化为培养温度 ,,,:,?，培养基起始,,为,(,，培养时间为,天。经工艺条件优化，红曲霉红色素 总色价达到,,(,,,,,,，比初始条件提高,,(,,，黄色素总色价达到,,(,,, ,,,，比 初始条件提高,,(,,。 ,(红曲色素对革兰氏阳性菌具有较强的抑制作用，对革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌无 抑制作用;红曲霉胞外发酵液和胞内浸提液均含有抑菌物质，且抑菌强度与色素含 量成正相关性;桔霉素对细菌具有较强的抑制作用，对酵母菌抑制作用较弱，对霉 菌无抑制作用，抑菌性强弱与桔霉素浓度成正相关性，最小抑菌量为,(,,,,。 ,(采用硅胶板,,,，以甲苯:乙酸乙酯:甲酸(,:,:,)为展开剂，可将桔霉素和红曲色 素成分分离开，并测得桔霉素,,,,(,,，最小检出量为,(,,,，以此方法检测，红曲 霉,,,,所产色素桔霉素含量低于最小检出量。 ,(,,,,分析红曲霉,,,,胞内浸提液和胞外发酵液桔霉素含量低于最小检出量，经数 据分析，所获得的红曲色素中桔霉素含量低于,(,,,,,，符合日本厚生省,,,,年版的 “日本食品添加剂标准:中的有关规定。 ,(对红曲霉,,,,色素成分进行分离并作抑菌实验，发现红曲色素中的抑菌物质存在于 橙色素提取液中，可能与橙色素有关。 ,, 参考文献 参考文献 ,,,傅金泉(中国红曲及其实用技术,,,(北京:中国轻工业出版社，,,,,:,,—,, ,,,许赣荣，傅金泉(红曲产品在欧洲的合法地位、菌种分类及有害物质桔霉素,,,(酿酒科技( ,,,,，,:,,,,,, ,,,贾波，周立平(红曲霉研究之现状及发展前景,,,(中国食品添加剂，,,,,，,:,,,,, ,,,雷萍，金宗濂(红曲中生物活性物质研究进展,,,(食品工业科技，,,,,，,,(,):,,,,,, ,,,毛宁，陈松生(红曲霉有效生理活性物质及其应用,,,(中国调味品，,,,,，,:,—,, ,,,陈义光，彭德娇，田宏现(红曲及红曲霉的研究与应用,,,(湖北农学院学报，,,,,，,,(,):,,,,,,, ,,,常华，王元太(红曲霉的生理活性物质及应用前景分析,趵(山西食品工业，,,,,，,:,曲,, ,,,,,,,,,,，,,,,，,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,, ,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,, ,,,,，,,,,，,,:,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,(,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,, ,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,(,,,,,, ,，,,,,，,,:,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,，;,,,(,,,,,,;,,,,，,,,,,,?,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,,,,(,,,,,,,,;,,,(， ,,,,，,,(,):,,, ,,,,黄梅丽，姜汝焘，江小梅编(食品色香味化学,,,(北京:,,,,郭东川，吴诚华，李钟庆(红曲色素的两种新结构,,,(真菌学报，,,,,，,,(,):,,轻工业出版社，,,,,:,?, —,, ,,,,童群义，高孔荣，周正宏(红曲色素抑菌作用的研究,,,(食品工业科技，,,,,，,:,,,, ,,,,王柏琴，杨洁彬，刘克(红曲色素、乳酸链球菌素、山梨酸钾对肉毒梭状芽孢杆菌的影响,,】(食品 与发酵工业，,,,,，,:,,,,, ,,,,王柏琴，杨洁彬，刘克(红曲色素、乳酸链球菌素、山梨酸钾对乳酸菌株的影响(,,(食品与发酵工 业，,,,,，,:” ,,,】王柏琴，杨洁彬，刘克(红曲色素在发酵香肠中代替亚硝酸盐发色的应用,,】(食品与发酵工业， ,,,,(,:,阻击, ,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,，,,,,,,,(,,,,,,,;,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,, ,,,,,;,,,,,(,,,,,,;,,,,, ,，,,,,，,,(,):,,, 【,,,宫慧梅，赵树欣(红曲中橙色素的研究,,,。食品研究与开发，,,,,，,,,):,,,,, ,,,,,,,,,,，,,,,(,,,,,,;,,,,,,,,;,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,, ,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,。,,,,;,,,, ,,,,。,,,,，,,(,):,,, 孓,,,, ,,,,,,,,;,,，,,,,,,;,,，,,,,。,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,;,,邪;,,,,,,,们( ，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,，,,,,，,,(,,,):,,,,,,,, ,,