头孢西丁耐药的葡萄球菌mecA基因检测及耐药性分析

头孢西丁耐药的葡萄球菌mecA基因检测及耐药性 头孢西丁耐药的葡萄球菌mecA基因检测及耐药 性分析 作者:陈颖，宋明胜，周建党，徐令清，伍勇 【摘要】 目的 对头孢西丁纸片扩散法检测耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)的可靠性进行，并分析头孢西丁耐药的葡萄球菌即MRS感染及耐药性情况，以指导临床合理用药。方法 临床分离葡萄球菌310株，以PCR检测葡萄球菌mec,基因为判断MRS的，按美国国家临床实验室标准化研究所(CLSI/NCCLS)标准操作规程进行头孢西丁、苯唑西林纸片扩散法(KB法)药敏试验检测MRS，同时检测MRS及甲氧西林敏感葡萄球菌(MSS)对10种常用抗生素的耐药性。结果 在310株葡萄球菌中金黄色葡萄球菌198株，凝固酶阴性葡萄球菌112株，经mec,基因检测，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)为57.1%(113/198)，耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)为62.5%(70/112);头孢西丁纸片扩散法检测MRSA的敏感性和特异性均为100%，检测MRCNS敏感性为98.6%，特异性为100%;除复方新诺明和万古霉素外，MRS对其余8种抗生素的耐药率明显高于MSS，差异具有统计学意义(P<0.01)。结论 头孢西丁纸片扩散法操作简便，结果可靠，可作为临床实验室检测MRS的常规方法;MRS的感染发生率及耐药性较高，且对各类抗生素多重耐药，需加强其耐药性监测。 【关键词】 头孢西丁;葡萄球菌;耐药性分析;mecA基因 葡萄球菌是引起医院感染的常见病原菌，其中耐甲氧西林葡萄球菌(methicillinresistant staphylococcus, MRS)有逐渐上升的趋势，并 具有多重耐药性，所造成的医院感染一直是临床普遍关注的问题。为及时准确地掌握MRS的感染率及耐药率，我们采用PCR方法检测葡萄球菌mecA基因为判断MRS的标准，按照美国国家临床实验室标准化研究所(CLSI/NCCLS)标准操作规程进行头孢西丁、苯唑西林纸片扩散法(KB法)药敏试验检测了310株葡萄球菌，同时检测了其对10种常用抗生素的耐药性，并且进行了统计分析，现将结果如下。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株 我院2006年1月至2006年6月临床分离葡萄球菌310株，其中金黄色葡萄球菌198株、表皮葡萄球菌47株、腐生葡萄球菌36株、溶血葡萄球菌29株，标准菌株为湖南省临检中心提供的金黄色葡萄球菌ATCC25923。 1.1.2 试剂 苯唑西林(OX)、头孢西丁(FOX)、头孢唑啉(CZO)、氨苄西林(AMP)、红霉素(ERY)、克林霉素(CLI)、万古霉素(VA)、复方新诺明(SXT)、阿米卡星(AMK)、利福平(RA)、环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LVX)纸片以及药敏培养基(MH琼脂)均购自OXOID公司;PCR扩增所需试剂均为上海生工工程公司产品，上游引物P1:5′TGGCTATCGTGTCACAATCG3′，下游引物P2:5′CTGGAACTTGTTGAGCAGAG3′，扩增片段为310bp。 1.1.3 仪器 BioRad icycler荧光定量PCR系统。 1.2 方法 1.2.1 纸片扩散法 按CLSI/NCCLS标准操作规程进行，检测各菌株对每种药敏纸片的敏感性，以ATCC25923为标准质控菌株，药敏结果依据CLSI/NCCLS(2006 年)判断。 1.2.2 mecA基因检测(PCR) ?模板的制备:将液体培养基中适量的指数生长期细菌(最多可达1×109CFU/mL)，离心后彻底弃净上清液，用上海生工细菌基因组DNA抽提试剂盒提取DNA作为PCR的模板。?反应体系:总体积25μL，其中含10×PCR buffer 2.5μL、25mmol/L Mg2+ 2.5μL、10mmol/L dNTP 0.5μL、Taq DNA酶2.5u、25pmol/L的引物1和引物2各1μL、DNA模板5μL、无菌双蒸水12μL。?反应条件:94? 5min预变性，94? 30s，57? 30s，72? 100s循环30次，72?延伸5min。扩增时以ATCC25923作为阴性对照。?结果判断:5μL PCR产物点入含EB的20g/L琼脂糖凝胶，0.5×TBE为电泳缓冲液，用水平式电泳槽稳压100V，电泳4min，凝胶成像系统观察结果、成像。 1.2.3 统计学处理 采用WHONET5软件统计葡萄球菌对10种抗生素的耐药率，比较采用SPSS13.0软件进行χ2检验，以P<0.01为差异具有统计学意义。 2 结 果 2.1 mecA基因的检测结果 临床分离的葡萄球菌310株，经mecA基因检测，其中耐甲氧西林 金黄色葡萄球菌(MRSA)为57.1%(113/198)，耐甲氧西林的凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)为62.5%(70/112)。mecA基因检测结果见图1。 2.2 苯唑西林、头孢西丁纸片扩散法检测MRS与mecA基因检测的比较 198株金黄色葡萄球菌mec,基因阳性为113株;苯唑西林纸片扩散法阳性112株，阳性检出率为99.1%(112/113) ，假阴性率为0.88%(1/113);头孢西丁纸片扩散法阳性率为100%(113/113);阴性检出率两种纸片扩散法均为100%(85/85)。112株凝固酶阴性葡萄球菌mecA基因阳性为70株;苯唑西林纸片扩散法阳性68株，阳性检出率为97.1%(68/70)，假阴性率为2.86%(2/70);头孢西丁纸片扩散法阳性69株，阳性检出率为98.6%(69/70)，假阴性率为1.43%(1/70);苯唑西林纸片扩散法阴性41株，阴性检出率为97.6%(41/42)，假阳性率为2.38%(1/42);头孢西丁纸片扩散法阴性检出率为100%(42/42)。 2.3 葡萄球菌对10种抗生素的耐药性分析 按照mec,基因检测结果，310株葡萄球菌分为耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)(183株)和甲氧西林敏感葡萄球菌(MSS)(127株)两组进行分析、比较。310株葡萄球菌对万古霉素全部敏感，MRS对其余9种抗生素的耐药率均在50%以上，对β内酰胺类药物耐药率最高，为100%;MSS对于除氨苄西林、红霉素以外的抗生素耐药率均在50%以下。除复方新诺明和万古霉素外，MRS对其余8种抗生素的耐药率明显高于MSS，具有统计学意义(P<0.01，表1)。表1 310株葡萄球菌对10种抗生素的耐药率(略) 3 讨论 MRS的检测可使临床及时选择治疗有效的药物，迅速控制其所造成的感染。mecA基因的PCR检测虽被公认为判断MRS的“金标准”，但因其费力、耗时，成本较高，在临床实验室难以常规开展[1]。CLSI/NCCLS2004 年推荐用头孢西丁纸片扩散法检测MRS [2]，以取代苯唑西林纸片扩散法。 本组研究资料显示，苯唑西林纸片扩散法检测MRSA的敏感性和特异性分别为99.1%(112/113)和100%，头孢西丁纸片扩散法则均为100%。一株mecA阳性而苯唑西林表型敏感的金黄色葡萄球菌，头孢西丁纸片扩散法结果与mecA基因检测法一致，进一步证实了头孢西丁纸片扩散法的优越性。国内外相关研究结果证实，头孢西丁纸片扩散试验可用于检测各种表型的MRSA，尤其对低水平、异质性耐药的MRSA，其敏感性(100%)高于其他筛选试验[3]。 苯唑西林纸片扩散法对于MRCNS检测的敏感性和特异性分别为97.1%(68/70)、97.9%(42/43)，较头孢西丁纸片扩散法低，后者敏感性为98.6%(69/70)，特异性为100%，较前者与mecA基因检测的结果有更高的一致性，为99.1%(111/112)。本实验中，两株mecA阳性而苯唑西林表型敏感的CNS菌株，其中一株头孢西丁表型也敏感，可能是由于异质性耐药的MRS，培养条件和所使用的抗生素的浓度和种类影响了耐药性的表型[4];一株mecA阴性的CNS，头孢西丁纸片扩散法也显示为MSCNS，但苯唑西林表型耐药。这可能是由于青霉素结合蛋白(PBPs)的基因有突变，或者是β内酰胺酶过度的表达。头孢西丁抑菌圈直径与mecA基因的表达 有很好的相关性。这可能是头孢西丁与PBP2a及其他各种PBPs相互作用的结果[5]。头孢西丁纸片扩散法操作简便，成本低廉，其敏感性和特异性都较苯唑西林纸片扩散法高，是临床检测MRS的可靠方法。 本组资料中万古霉素对所有菌株均敏感，MRS特点为多重耐药性，对β内酰胺类药物如头孢唑啉、氨苄西林均不敏感，对其余7种抗生素的耐药率均在50%以上，应引起临床高度重视。MSS只对氨苄西林和红霉素高度耐药，其余8种抗生素的耐药率均在50%以下，其中复方新诺明、克林霉素、环丙沙星、左氧氟沙星中度耐药，利福平、头孢唑啉、阿米卡星轻度耐药。MRS和MSS对复方新诺明的耐药率无明显差异(P>0.05)，MRS对其余8种抗生素的耐药率明显高于MSS，具有统计学意义(P<0.01)。MRS的多重耐药性除与产生β内酰胺酶有关外,可能还与产生新的内酰胺酶类低亲合力PBP2a改变抗菌药物作用靶位、产生修饰酶、膜通透性降低及主动外流泵等机制有关[6]。因此,准确检测MRS,对于指导临床用药有重要参考意义。 快速鉴定出携带mecA基因的MRS，可使临床及时选择治疗有效的药物，迅速控制以多重耐药为特点的MRS所造成的感染，限制其播散。同时，也可以减少抗生素的滥用。总之，根据耐药性的变迁,有地将抗生素分期、分批交替使用，可能对减少MRS有一定作用。 【参考文献】 [1]Francois P, Pittet D, Bento M, et al. Rapid detection of methicillinresistance staphylococcus aureus divectly from sterile or nonsterile clinical samples by a new molecular assay [J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(1):254260. [2]Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; fourteenth informational supplement [S]. NCCLS, 2004, M100S14, 47. [3]张险峰，王琳. 头孢西丁纸片法筛查耐甲氧西林葡萄球菌的评价 [J]. 苏州大学学报(医学版), 2008, 28(1):142143. [4]杜宗敏，杨瑞馥，郭兆彪，等. 金黄色葡萄球菌及其甲氧苯青霉 素耐药性的MALDITOF MS鉴定 [J]. 分析测试学报, 2003, 22(1):6366. [5]Katayama Y, Zhang HZ, Chambers HF. PBP 2a mutations producing veryhighlevel resistance to betalactams [J]. Antimicrob Agents chemother, 2004, 48(2):453459. [6]李晓芳，范昕建. 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因与耐药 性关系 [J]. 中国抗生素杂志, 2006, 31(3):140143.