玉米总蛋白质提取技术和蛋白质样品浓度测定方法的比较

收稿日期: 2010- 09- 22 基金项目:国家重点基础研究发展计划 ( 973计划 )项目 ( 2006 CB 708206) :玉米奥帕克 �16( o 16)和果穗性状的达分析及 o16基因的克隆;贵州省农 业科学院专项资金项目 (黔农科院院专项 [ 2009 ] 032号 ) : 玉米奥帕克 �16突变的蛋白质表达分析; 贵州省科学技术基金 (黔科合 J字 [ 2010] 2082号 ):玉米奥帕克 �16突变的蛋白质表达分析。 作者简介:杨文鹏 ( 1957- ) ,男,研究员,博士,研究方向:玉米分子遗传学与育种; E�m ai:l yw pma ize@ 126. com。 玉米总蛋白质提取技术和蛋白质样品浓度测定方法的比较 杨文鹏 1, 2 � 王明春 1, � 杨留启 1, � 王 � 伟 1 ( 1. 贵州省旱粮研究所, � 贵阳 550006; � 2. 贵州省农业生物技术重点实验室, � 贵阳 550006) 摘要:玉米组织蛋白质的提取及其浓度测定是进行玉米蛋白质组学研究的关键步骤。本研究以玉米叶片和花丝为试材 , 从总蛋白提取数量和质量方面比较分析了磷酸缓冲液法、T ris法、改进 T ris法、TCA�ace tone(三氯醋酸�丙酮沉淀 )法、 P lant Tota l P ro te in Extraction K it试剂盒法及其改良法等 6种玉米总蛋白质提取方法。同时,又比较分析了 Bradford法、 2�D Quant K it试剂盒法和紫外分光光度法 (UV法 )等 3种方法测定蛋白质浓度的准确性。结果表明: ( 1)总蛋白提取数 量按大小顺序为:试剂盒法 >试剂盒改良法 >改进 T r is法 > T r is法 > TCA�acetone法 >磷酸缓冲液法; ( 2)总蛋白提取质 量依质量优劣为:试剂盒法 >试剂盒改良法 > TCA�acetone法 >改进 T r is法 > T r is法 >磷酸缓冲液法; ( 3) B radford法与 2�D Quant K it法测定的蛋白质浓度均是准确的,且没有显著差异; 但是 UV法测定的蛋白质浓度欠准确。经综合考虑 , 改进 T r is法用于 SDS�PAGE分析,试剂盒改良法用于 2�DE分析, Bradford法用于测定蛋白质浓度是经济有效的方法。这 对玉米蛋白质组学的研究具有参考价值。 关键词: � 蛋白质提取; 蛋白质浓度测定; 玉米 中图分类号: � S 513� � � 文献标志码: � A� � � 文章编号: � 1001- 4705( 2010) 12�0018�06 Comparison ofM ethods for the Ex traction and Concentration Determ ination o f Total Protein inM aize YANGW en�peng1, 2, WANGM ing�chun1, YANG L iu�qi1, WANG W ei1 ( 1. Guizhou Institute ofU pland Food C rops, Gu iyang 550006, Ch ina; 2. Gu izhouK ey Laboratory o fAgricu ltura lB io techno logy, Gu iyang 550006, Ch ina) Abstract: The ex traction and concen trat ion determ ination of to tal protein inm aize organs is a key step for pro� teom ic research. In this study. Usingma ize leaves and silks asmaterials, 6 methods for total prote in ex tract ion, .i e. Phosphate Buffer ( PB ), T ris, Improved T ris, TCA �acetone, P lant Total Protein Ex traction K it and its im� proved onew ere compared in respective ex tract ion quantity and quality; simultaneously, 3methods of Bradford, 2�D Quan tK it andUV were compared in accuracy o f prote in concentration determ inat ion. The results showed: 1. the amoun t of to ta lprotein extracted by the abovem ethodsw as P lantTota lProte in Ex traction K it> Improved P lant To ta lProtein Extraction K it> Improved T ris> Tris> TCA�acetone> PB; 2. The qua lity of tota l pro tein ex tracted w as Plant Tota l Pro te in Extract ion K it> Improved P lant Tota l Prote in Ex traction K it> TCA�acetone > Improved T ris> Tris> PB; 3. The prote in concentrations determ ined by bo th methods of B radford and 2�D Quant K itw ere accurate and no significant difference, how ever the one determ ined byUV method w as inaccu� rate. Taking one consideration w ith another, using Improved Tris for SDS�PAGE and Improved Plant Tota lPro� te in Ex traction K it for 2�DE analyses, and Brad fo rd for concentrat ion measuremen twould be efficien.t It should be a good reference for proteom ic research in ma ize. Key words: � prote in extraction; prote in concentrat ion determ ination; ma ize � � 现代生命科学涵盖了生物学、医学、农学等传统学 科,以及生物学、生物技术、环境科学、社会科学等其他 学科相互交叉渗透而产生的新型学科。在自然科学体 系中,生命科学已成为 21世纪的带头学科。生命科学 �18� 第 29卷 � 第 12期 � 2010年 12月 � � � � � � � � � � 种 � 子 � ( Seed) � � � � � � � � � � Vo.l 29� No. 12� Dec. � 2010 正从基因组学走向功能基因组学。蛋白质组学是功能 基因组学的研究热点之一, 其兴起影响与推动了生命 科学学科。在蛋白质组研究中, 从组织和细胞中提取 蛋白是最关键的一步,它影响蛋白的产率、生物活性和 特定目的蛋白结构的完整性。因此, 采用合适的蛋白 质提取方法是获得良好蛋白质组分析结果的必要条 件 [ 1, 2]。另外, 提取蛋白样品的准确定量对十二烷基 磺酸钠 �聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS�PAGE ), 尤其是双 向电泳 ( 2�DE )是非常重要的。 植物组织总蛋白质的提取方法较多,常用的方法 有 TCA�acetone(三氯醋酸�丙酮沉淀 )法 [ 3] , T ris法 [ 4]、 磷酸缓冲液 ( PB )法 [ 5]和试剂盒法等。另外, 蛋白质浓 度的测定方法有紫外分光光度法 ( UV法 ) [ 6]、B radfo rd 法 [ 7]、双缩脲 ( B iuret)法 [ 8]、BCA ( B icinchon in ic A cid) 法 [ 9]、Low ry法 [ 10]和试剂盒法等。 本研究以玉米叶片和花丝为, 对玉米组织蛋 白质提取方法,即 TCA�acetone法、T ris法、PB法、Plant To tal Pro tein Ex tract ion K it法, 以及改进的 Tris法和 P lantTotal Pro tein Extraction K it改良法进行比较分析。 同时, 又对紫外分光光度法、B radford法和 2�D Quant K it法等蛋白质浓度测定方法进行比较分析,目的是希 望筛选出经济有效的适用于 SDS�PAGE和 2�DE的蛋 白质提取和浓度测定的技术方法。 1� 材料与方法 1. 1� 材 � 料 玉米自交系 QCL 1065和 QCL 1094的叶片, 玉米 自交系 QCL 1010的花丝。 1. 2� 方 � 法 1. 2. 1� 总蛋白质提取方法 ( 1)磷酸缓冲液 ( PB )法: 取蛋白质提取液 [ 1M KH2 PO4 + K2HPO4,可于用前现加入 1mM PMSF( L�苯 甲基磺酰氟 ) ] 3. 5m l加入 5m l离心管中, 置于冰上。 称取 1 g组织样品放在研钵中用液氮研磨, 然后转入 离心管中混匀, 冰上静置 3~ 4 h。 4 条件下离心, 15 000 r /m in, 45m in。提取上清液, 再离心 1次, 取上 清, 4 保存备用或 - 80 保存。 ( 2) Tr is法:制备蛋白质提取液 [ 1M T ris�HC l( pH 8. 0) , 15m ;l G lycero l(甘油 ) , 25m ;l Po lyv iny lpo lypy rror� done(聚乙烯吡咯烷酮, PVP) , 2 g; 加超纯水定容至 100m l]。取 3. 5m l(可调 )加入 5m l离心管, 置于冰 上。称取 1 g组织样品放在研钵中用液氮研磨, 之后 转入离心管中混匀, 在冰上静置 3~ 4 h。 4 条件下 离心, 15 000 r /m in, 45m in。提取上清液,再离心 1次, 取上清, 4 保存备用或 - 80 保存。 ( 3)改进 Tris法:将上述 Tris法改进为: 取 3. 5m l (可调 )蛋白质提取液 (同 ( 2) )加入 5m l离心管,置于 冰上预冷。称取 1 g组织样品放入研钵中, 用液氮研 磨成粉末,再加入预冷提取液冰浴研磨成浆,之后转入 5m l离心管中混匀,在冰上静置 4 h至过夜。 4 条件 下离心, 15 000 r /m in, 45m in。提取上清液, 再离心 1 次,取上清, 4 保存备用或 - 80 保存。 ( 4) TCA�acetone(三氯醋酸 �丙酮沉淀 )法:称取 1 g 组织样品放入研钵中 (可加入 100mg PVP和少量石英 砂 ) ,用液氮研磨成粉末。再加入 - 20 预冷的 TCA / A cetone提取液 [含 10% TCA (三氯乙酸 )和 0. 07%的 ��ME( ��巯基乙醇 )的丙酮 ] 4 m ,l冰浴研磨成浆,转入 预冷 15m l离心管。涡漩振荡 0. 5~ 1 m in混匀, - 20 静置过夜 (至少 > 2 h)。 4 条件下离心, 15 000 r / m in(至少 > 8 000 r/m in), 1 h(至少 > 20m in), 弃上清。 加入 - 20 预冷的 4m l丙酮 (含 0. 07%的 ��ME ), 涡 漩振荡 0. 5~ 1m in,摇匀, - 20 静置 1 h; 4 离心, 15 000 r /m in (至少 > 8 000 r /m in) , 1 h (至少 > 20 m in),弃上清;重复 2~ 3次。加入 - 20 预冷的 80% 丙酮 (含 0. 07%的 ��ME ) 4m ,l涡漩振荡 15 s。 4 离 心, 15 000 r /m in, 25m in, 弃上清, - 20 静置 3 h以上 至过夜或者 (冷冻 )真空干燥沉淀。称重 (毛重�皮重 =蛋白干粉重 ), - 20 保存备用或 - 80 保存。称 取蛋白丙酮干粉 50mg于 2m l离心管中, 按每毫克 25 �l比例加入 1. 25m l裂解液 ( Lysis buffer A ) [ 9M 尿 素, 4% ( w /v) CHAPS( 3- [ ( 3�cholam idopropyl) dim eth� ylammonio] propanesulfonate) ,用灭菌超纯水定容;临用 前加入 0. 5% CA ( carrier ampholyte), 1!100蛋白酶抑 制剂混合物, 1% ( w /v) DTT (二硫苏糖醇 ) ], 涡漩振荡 2m in,室温放置 30m in以上至 2 h,其间间歇涡漩振荡 或连续温和摇动。 25 离心, 15 000 r/m in, 1 h, 取上 清,可临时 4 保存待用。用 Brad fo rd法定量蛋白, 之 后可用于电泳, 或 - 20 短期保存,或分装至 Eppen� dorf管里 - 80 保存。 ( 5)试剂盒法: 按 Plan t To tal Pro tein Ex tract ion K it ( Sigma�A ldrich, PE 0230) 说明操作。 ( 6)试剂盒改良法:在甲醇中不加蛋白酶抑制剂 混合物而改加 1mM的 PM SF, 裂解液用 Lysis bufferA 而不用 Type 2Working Solution溶液,其余与 Plant To� tal Prote in Ex tract ion K it说明相同。 1. 2. 2� 蛋白质浓度测定方法 ( 1) B radfo rd法: ( a)曲线的制作: 用超纯水配 制 1mg /m l标准 BSA(牛血清蛋白 )溶液。以超纯水作 为实验缓冲液, 分别取 0、2. 5、5、7. 5、10、12. 5、15、 �19� 研究 � � 杨文鹏 等: 玉米总蛋白质提取技术和蛋白质样品浓度测定方法的比较 表 1� 5种方法提取的玉米幼苗叶片总蛋白质 方法 材料 样重 ( g) 提取量 ( �g/� l) 材料 样重 ( g) 提取量 ( �g /� l) PB法 QCL 1065 1. 00 0. 782 QCL 1094 1. 00 0. 740 PB+ PM SF法 QCL 1065 1. 00 0. 799 QCL 1094 1. 00 0. 648 Tris法 QCL 1065 1. 00 1. 640 QCL 1094 1. 00 1. 410 TCA�acetone法 QCL 1065 1. 00 0. 809 QCL 1094 1. 00 0. 782 试剂盒法 QCL 1065 0. 25 0. 995 QCL 1094 0. 25 0. 579 表 2� 5种方法提取的玉米喇叭口期心叶总蛋白质 方法 材料 样重 ( g) 提取量 ( �g/� l) 材料 样重 ( g) 提取量 ( �g /� l) 磷酸缓冲液法 QCL 1065 1. 00 0. 620 QCL 1094 1. 00 0. 765 Tris法 QCL 1065 1. 00 1. 180 QCL 1094 1. 00 1. 370 改进 Tris法 QCL 1065 1. 00 1. 510 QCL 1094 1. 00 1. 700 TCA�acetone法 QCL 1065 1. 00 0. 893 QCL 1094 1. 00 0. 802 试剂盒法 QCL 1065 0. 25 1. 150 QCL 1094 0. 25 0. 735 17. 5、20 �l标准 BSA溶液, 分 别加入 100、97. 5、95、92. 5、 90、87. 5、85、82. 5、80 �l实验 缓冲液中,构成含蛋白质 0(作 参比 )、2. 5、5、7. 5、10、12. 5、 15、17. 5、20 �g的标准蛋白溶 液,除参比溶液外其他标准蛋 白溶液需重复 1次。每份标准 蛋白溶液中分别加入 1 m l B radford工作液 [ 85 m l超纯 水, 3m l 95%乙醇, 6m l88%磷 酸, 6 m l储存液 ( 10m l 95%乙 醇, 20 m l 88% 磷酸, 35 mg考 马斯亮蓝G�250) ] , 翻转摇匀, 3~ 5m in后, 依次测标 准样品的A595值, 每个标样重复 3次读数, 取其平均 值,以蛋白质浓度为横坐标 ( x, �g /�l) , 吸光度为纵坐 标 ( y, A595 ) ,作标准曲线, 建立回归方程。 ( b)样本蛋 白质浓度的测定:取 10 �l待测蛋白溶液,用超纯水稀 释至终体积 100 �l。加入 1 m l B radford工作液, 翻转 摇匀, 3~ 5m in后测样品的 A595值, 代入回归方程, 求 蛋白质浓度。 ( 2) 2�D Quant K it法: 按试剂盒 ( Amersham B io� sciences, lot 0508�06) 说明操作。 ( 3)紫外分光光度法 ( UV法 ) : ( 1)蛋白浓度 = (因子 1 ∀A280 ) - (因子 2 ∀A 260 )。用已知浓度的蛋 白溶液测量 260 nm和 280 nm下的光吸收值, 代入上 述公式得到一组联立方程, 解此方程得出两个因子的 数值。用 GeneQuantTM 1300( B iochrom, England)测样 品的 A280和 A 260值, 在 320 nm处进行背景校正,代入公 式计算得样品蛋白浓度。 ( 2 )或者用 GeneQuantTM 1300( B iochrom, Eng land)测样品的 A 260和 A 280值, 用 A 320进行背景校正。按 Christian�W arburg等式 (W ar� burg, O. andW. Christ ian ( 1942) Iso lation and crysta lli� zation o f eno lase. B iochem. Z. 310: 384�421. ): 蛋白质浓 度 ( �g /�l) = 1. 55 ∀A 280 - 0. 76 ∀A260进行计算。 2� 结果与分析 2. 1� 总蛋白提取量的比较分析 在田间取 QCL 1065和 QCL 1094幼苗叶片, 冰上 剪碎后置于 - 80 保存。称取适量冻干叶样,用 5种 方法提取总蛋白,用 Brad ford法测定蛋白质浓度,结果 列于表 1中。 从表 1可见, 5种方法中, 以试剂盒法提取的玉米 幼苗叶片总蛋白浓度最高, 是其他方法提取浓度的 1. 6~ 5倍,其次是 T ris法, 约是其余方法提取浓度的 2 倍; PB、PB+ PM SF、三氯醋酸�丙酮沉淀等 3种方法提 取的玉米幼苗叶片总蛋白浓度相当。 PB和 PB + PM SF两种方法提取的玉米幼苗叶片蛋白浓度没有明 显差异。 在田间取 QCL 1065和 QCL 1094喇叭口期心叶, 冰上剪碎后置于 - 80 保存。称取适量冻干叶样, 用 5种方法提取总蛋白, 用 B radford法测定蛋白质浓度, 结果见表 2。 由表 2可看出: 试剂盒法提取的玉米喇叭口期心 叶总蛋白浓度是其他方法提取浓度的 1. 7 ~ 7倍; T ris 法提取的玉米喇叭口期心叶总蛋白浓度约是 PB法提 取浓度的 2倍, 是三氯醋酸�丙酮沉淀法提取浓度的 1. 3~ 1. 7倍;改进 Tris法提取的玉米喇叭口期心叶总 蛋白浓度略高于 Tris法。 在田间取 QCL 1010果穗,在冰上剪碎花丝后置于 - 80 保存。称取适量冻干花丝样,用 3种方法提取 总蛋白,用 Bradford法测定蛋白质浓度 (表 3)。 表 3� 3种方法提取的玉米花丝总蛋白质 方法 材料 样重 ( g) 提取量 ( �g /� l) TCA�acetone法 QCL 1010 1. 00 0. 589 试剂盒法 QCL 1010 0. 30 1. 950 试剂盒改良法 QCL 1010 0. 30 1. 540 � � 由表 3可看出, 试剂盒法提取的玉米花丝总蛋白 浓度是三氯醋酸�丙酮沉淀法提取的 11倍; 试剂盒改 良法提取的玉米花丝总蛋白浓度, 是三氯醋酸�丙酮沉 淀法提取的 8. 7倍,但略低于试剂盒法提取的浓度。 2. 2� 总蛋白提取质量的比较分析 为了比较上述几种方法提取的蛋白质质量, 对提 取的总蛋白进行了 SDS�PAGE电泳分析。结果见图 1、2。 �20� 第 29卷 � 第 12期 � 2010年 12月 � � � � � � � � � � 种 � 子 � ( Seed) � � � � � � � � � � Vo.l 29� No. 12� Dec. � 2010 图 1� 5种方法提取玉米喇叭口期心叶 总蛋白的 SDS�PAGE电泳图 注:采用 5%积层胶和 12% 分离胶的不连续缓冲系统按分子量分离蛋 白组分。用 M in iGel(六一厂 ) 10孔胶上样电泳, 用 G elDocXR凝胶 成像系统 ( B io�R ad L aboratories, In c. , USA )成像。从左至右, 1泳 道:磷酸缓冲液法; 2泳道:分子量标准; 3和 4泳道: T ris法; 5和 6泳 道:改进 Tris法; 7和 8泳道:三氯醋酸 �丙酮沉淀法; 9和 10泳道:试 剂盒法。上样量分别为: 1和 2泳道: 10� ;l 3、5、7和 9泳道: 15�;l 4、 6、8和 10泳道: 20� l。 � � 从图 1可以看出,试剂盒法提取的总蛋白质质量 最好, 分子量从大到小的蛋白质组分都有,而且各组分 的量均匀。三氯醋酸 �丙酮沉淀法提取的总蛋白质质 量居其次,蛋白质组分完全, 各组分的量也比较均匀。 Tris法和改进 Tris法提取的总蛋白再次之, 蛋白质组 分是完全的,各组分的量也是比较均匀的;改进 Tris法 提取的总蛋白电泳条带比 T ris法提取的总蛋白电泳条 带要清楚。磷酸缓冲液法提取的总蛋白质质量较差, 蛋白质组分不完全,小分子量蛋白损失。 图 2� 两种方法提取玉米花丝总蛋白的 SDS�PAGE电泳图 注:采用 5%积层胶和 12% 分离胶的不连续缓冲系统按分子量分离蛋 白组分。用 M in iGel(六一厂 ) 15孔胶上样电泳, 用 G elDocXR凝胶 成像系统 ( B io�R ad L aboratories, In c. , USA )成像。从左至右, 1泳 道:分子量标准 ( 6� l) ; 2泳道: 试剂盒法 ( 15�g) ; 3泳道:试剂盒改 良法 ( 15 �g)。 � � 从图 2可见,试剂盒法和试剂盒改良法提取的总 蛋白质质量都很好, 蛋白质组分完全, 各组分的量均 匀。不过,试剂盒改良法提取的总蛋白中,大分子量蛋 白组分的量不如试剂盒法提取的, 小分子量蛋白组分 的量却好于试剂盒法提取的。 2. 3� 蛋白质浓度测定方法的比较分析 为了便于比较 B radford法和 2�D Quan tK it法测定 蛋白质浓度的准确性,在制作标准曲线时,用 Excel表 建立回归方程并计算 R2值 (表 4)。每种方法分别建 立了 3个回归方程, B radford法回归方程的 R2平均值 为 0, 9937; 2�D Quant K it法回归方程的 R2平均值为 0, 9962。可见,用两种方法测定蛋白质浓度都是准确 的,只不过用 B radford法测定的准确度不如用 2�D Quant K it法的高。 表 4� 两种蛋白质浓度测定方法的回归方程和 R2值 � � 方法 � � 回归方程 R2 值 B rad ford法 y = 0. 029 1 x + 0. 020 0. 9966 B rad ford法 y = 0. 029 6 x + 0. 014 0. 9958 B rad ford法 y = 0. 022 9 x - 0. 008 0. 9888 2�D Quan tK it法 y = - 0. 007 7 x+ 0. 8215 0. 9991 2�D Quan tK it法 y = - 0. 009 3 x+ 0. 8162 0. 9953 2�D Quan tK it法 y = - 0. 008 x + 0. 771 4 0. 9942 � � 表 5列出了用 2�D Q uant K it法测定的玉米样品 蛋白质浓度。将该结果与 2. 1中用 B radford法测定的 结果进行相关分析, 其相关系数为 0. 965。可见, 用 B radford法和 2�D Quant K it法测定的蛋白质浓度值没 有明显差异,前法比后法所测值略微偏高。 � � 表 6中列出了 UV法测定玉米幼苗叶片蛋白质浓 度的两次结果 (按 Christian�W arburg等式计算 )。与表 1结果对照分析可见,该法的测定值均较低, 而且有负 值出现。另外,试剂盒法提取的蛋白因测不出 A 260值 而不能计算。 3� 讨 � 论 采用 PB法提取总蛋白, 成本低, 速度快, 操作简 单,提取量较高。但是, 该法提取的总蛋白质质量差, 损失了小分子量蛋白; 而且, 杂质含量高,电泳时杂质 向泳道两侧扩散,挤压其他泳道 (图 1), 样品放置一段 时间后有明显的杂质沉淀。因此, 该法提取的总蛋白 不宜用于电泳分析。 Tris法是比较常用的方法, 成本低, 速度快, 操作 简单,提取量高。虽然采用该法提取的蛋白质组分是 完全的,但小分子量蛋白的量不如大分子量蛋白的。 经过改进后,虽有所改善,但仍不理想。不过, 采用改 进 Tris法提取总蛋白,进行 SDS�PAGE电泳分析,效果 �21� 研究报告 � � 杨文鹏 等: 玉米总蛋白质提取技术和蛋白质样品浓度测定方法的比较 表 5� 2�D Quant K it法测定的蛋白质浓度 方法 材料 样重 ( g) 提取量 ( �g/� l) 材料 样重 ( g) 提取量 ( �g /� l) PB法 QCL 1065 1. 00 0. 539 QCL 1094 1. 00 0. 526 Tris法 QCL 1065 1. 00 1. 136 QCL 1094 1. 00 1. 409 改进 Tris法 QCL 1065 1. 00 1. 461 QCL 1094 1. 00 1. 643 TCA�acetone法 QCL 1065 1. 00 0. 656 QCL 1094 1. 00 0. 435 试剂盒法 QCL 1065 0. 25 1. 045 QCL 1094 0. 25 0. 747 QCL 1010 0. 30 1. 594 试剂盒改良法 QCL 1010 0. 30 1. 054 � � 注: QCL 1065和 QCL 1094为喇叭口期心叶样; QCL 1010为花丝样。 表 6� UV法测定的玉米幼苗叶片蛋白质浓度 方法 材料 样重 ( g) 蛋白量 ( �g/� l) 材料 样重 ( g) 蛋白量 ( �g /� l) PB法 QCL 1065 1. 00 0. 42, 0. 40 QCL 1094 1. 00 - 0. 06, - 0. 01 PB + PM SF法 QCL 1065 1. 00 0. 36, 0. 40 QCL 1094 1. 00 - 0. 07, - 0. 08 Tris法 QCL 1065 1. 00 0. 83, 0. 81 QCL 1094 1. 00 0. 24, 0. 56 TCA�acetone法 QCL 1065 1. 00 0. 30, 0. 33 QCL 1094 1. 00 0. 31, 0. 36 试剂盒法 QCL 1065 0. 25 # , # QCL 1094 0. 25 # , # 良好 (图 3)。Tris碱虽可防止 蛋白的水解, 但由于引入盐离 子,会导致 IEF (等电点聚焦 ) 电压过低, 从而影响聚焦。因 此,用该法提取的总蛋白不宜 用于二维电泳 ( 2�DE )分析。 三氯醋酸 �丙酮沉淀法是 最为常用的总蛋白提取方法, 具有降低次生代谢物质干扰、 减少蛋白降解等优点 [ 5 ]。该 法所提取的蛋白,浓度较高,蛋 白质组分完全, 各组分的量较 均匀, 杂质少, 离子浓度小, 不 仅可 用于一 维电泳 ( SDS� PAGE )分析, 还可用于二维电 泳 ( 2�DE )分析。只不过该法成本较高, 较为耗时, 操 作也较为复杂。 Plan tTotal Pro tein Extraction K it试剂盒,是专门为 提取各种植物组织优质全蛋白样品, 以便用于植物生 物科学研究而的。用该法提取的总蛋白, 浓度高, 组分完全, 各组分均匀, 杂质少, 离子浓度小, 用于 SDS�PAGE和 2�DE分析效果好。但是, 操作复杂, 成 本高。为了降低成本,对此法进行了改良,主要是将蛋 白酶抑制剂混合物改为 PM SF; 虽然不如试剂盒的效 果好, 但仍能获得良好效果 (图 2)。 图 3� 改进 T ris法提取玉米幼苗叶片 总蛋白的 SDS�PAGE电泳图 注:采用 5%积层胶和 12% 分离胶的不连续缓冲系统按分子量分离蛋 白组分。用 M in iGel(六一厂 ) 15孔胶上样电泳, 用 G elDocXR凝胶 成像系统 ( B io�Rad Lab oratories, Inc. , USA )成像。从左至右, 1泳道: 分子量标准 ( 5 �l) ; 2 ~ 4泳道:玉米幼苗叶片总蛋白 ( 8 � l)。 由于不同蛋白质的氨基酸组成不同, 其 280 nm处 和 260 nm处的吸收值变化很大,因此特定的蛋白质有 其特定的吸收值。而提取的总蛋白样品中,蛋白质种 类是多样的,其氨基酸组成复杂。另外,样品中残留的 核酸和所含的试剂也会影响 280 nm处和 260 nm处吸 收值的测定 [ 11]。因此, 用 UV法测定的蛋白质浓度, 虽然不花成本,快速, 但欠准确。 B radford法是常用的测定蛋白质浓度的方法, 其 测定结果基本上准确, 而且花费低。不过当提取的蛋 白质样品含有变性剂、还原剂、解离剂和两性电解质 时,这些试剂可与考马斯亮蓝燃料结合,从而影响测定 结果,但影响不大。 2�D Quant K it法采用了定量沉淀蛋白的方法, 可 排除干扰物质的影响,所以其测定结果准确,但需购买 试剂盒,花费较高。 参考文献: [ 1] Fountoulakis M. P ro teom ics: Cu rrent techno1og ies and applica� tions in neuro log ica l diso rde rs and tox ico logy [ J ]. Am ino Ac ids, 2001, 21: 363- 381. [ 2] Fountou1akisM, Takacs B. Enrichment and pro teom ic ana lysis o f low�abundance bacte rial pro teins [ J] . M ethods Enzymo ,l 2002, 358: 288- 306. [ 3] Dam erval C, De V ienne D, Z ivy M, et a .l T echn ica l im prove� m ents in two�d im ensiona l e lectropho resis increase the level of genetic v ariation detected in wheat seedling prote ins [ J ]. E letropho resis, 1986, 7( 1): 52- 54. [ 4]谷瑞升, 刘群录,陈雪梅, 等.一种省时高效的木本植物蛋白 双向电泳分析方法 [ J] . 北京林业大学学报, 1999, 21( 5 ): 7- 10. �22� 第 29卷 � 第 12期 � 2010年 12月 � � � � � � � � � � 种 � 子 � ( Seed) � � � � � � � � � � Vo.l 29� No. 12� Dec. � 2010 [ 5] Baskir J. N. , H a tton T. A. , Su terU. W. . P ro tein partition ing in two�phase aqueous po lym er system [ J] . B iotechno l B ioeng, 1989, 34( 4): 541- 558. [ 6] Layne E. . Spec trophotom etr ic and Turb id ime tric M ethods for M easur ing P rote ins [ J ]. M ethods in Enzym o logy, 1957, 3: 447- 455. [ 7] Bradfo rd M. M. . A rapid and sens itive me thod for the quantita� tion o f m icrog ram quantities o f pro tein u tilizing the princ iple o f prote in�dye b ind ing [ J]. Analytical B iochem istry, 1976, 72: 248 - 254. [ 8] Gorna l,l A. G. , Bardaw ill C. S. and Dav idM. M. . Dete rm ina tion of serum pro tein by m eans of b iuret reaction [ J]. J. B io .l Chem. , 1949, 177: 751- 766. [ 9] Stoscheck, C. M. . Quantitation o f P ro tein [ J] . M ethods in En� zymo logy, 1990, 182: 50- 69. [ 10] Low ry O. H. , Rosebrough N. J. , F arr A. L. , Randall R. J. . P rote in m easurem ent w ith the fo lin phenol reagent [ J]. J. B i� o .l Chem. , 1951, 193: 265- 275. [ 11]W alke r J. M. . The P ro te in P ro toco ls H andbook. C lifton, New Je rsey: H um ana P ress. 1996, Part I, p3- 6. 收稿日期: 2010- 09- 09 基金项目:河南省教育厅自然科学基金项目 (编号: 2010 C 18002 )。 作者简介:李大红 ( 1969- ) ,男,安徽肥东人;博士,主要从事植物逆境生理研究。 NaCl对转 P 5CS基因水稻种子萌发的影响 李大红 1, � 刘喜平 1, � 甄萍萍 2 ( 1.黄淮学院农林科学系, � 河南 驻马店 463000; � 2.山东省临邑县农业局, � 山东 临邑 251500) 摘要:脯氨酸是植物体内非常重要的渗透调节化合物, 它的积累可增加植物对干旱、盐碱的耐受能力。P 5 CS ( 1 �吡咯 啉�5�羧基合成酶基因 )在植物中催化脯氨酸生物合成的前两部反应, 其活性受到脯氨酸含量的反馈抑制。本研究对转 P 5 CS基因的水稻 T 4代种子与对照在不同浓度的 NaC l胁迫下的萌发进行试验。结果表明, 随着 NaC l浓度的增高, 种 子萌发受到的抑制越大,但在 100 mm ol/L时转 P 5CS的种子萌发率、生理指标、ABA、脯氨酸和可溶性糖的含量显著高 于对照,但可溶性蛋白低于对照。说明转 P 5 CS基因的水稻有显著的耐 N aC l胁迫作用。 关键词: � 盐胁迫; P 5 CS; 种子萌发 中图分类号: � S 511� � � 文献标志码: � A� � � 文章编号: � 1001- 4705( 2010) 12�0023�04 The Effect of NaC l on Seed Germ ination of the T racgenicP 5CS R ice LIDa�hong1, LIU X i�ping1, ZHEN P ing�ping2 ( 1. Agronomy and Fo restry D epartmen t o fHuanghuaiUn iversity, Zhumad ian 463000, Ch ina; 2. L inyi County, Shandong Province Agriculture Bureau, L iny i 251500, Ch ina) Abstract: Proline ( Pro ) is one of the most important osmo ly tes in sa lin ity and w ater deficit conditions in plan ts. The synthesis of pro line is init iated from g lutam ate w hich is dehydrogenated to glutamy l sem ialdeh ide and spontaneously converted to !�py rroline�5�carboxy lic ac id. Both steps are cata lyzed by a bifunctional en� zyme pyrroline�5�carboxylate synthetase (P 5CS ) wh ich a lso behaves as a lim iting step in pro line biosynthe� sis. In th is paper, the seed of transgenic rice and the control w ere germ inated in different concentrations of NaC .l The results show ed that the seed germ ination w as inhibited w hen NaC l concentration increased. Howeve, in 100mmol /L NaC l treatmen,t the seed germ ination percentage, grow th index, ABA conten,t pro line con tent and so lub le sugar content of transgen ic rice w as sign ificantly h igher than that of the contro,l and the so lub le prote in content of transgenic rice obv iously low er than tha t of the contro.l Overal,l the transgen icP 5CS rice had an important ro le in resistance to N aC l stress. Key words: � sa lt stress; P 5CS; seed germ ination �23� 研究报告 � � 李大红 等: N aC l对转 P 5 CS基因水稻种子萌发的影响