核磁共振技术应用杂谈

nullnull中国药科大学药物科学研究院 沈文斌 2012.11 常州大学 核磁共振技术应用杂谈 null 定量核磁共振技术(QNMR)在药学领域中的应用 null*null*null*null*定量核磁共振（QNMR ）原理 1H-NMR谱上各信号峰强度之比，等于相应的质子数之比。信号峰强度一般用峰面积示。 峰面积（A）计算公式： 其中，N为待测物分子中被激发的原子数目，k为光谱常数（spectrometer constant），由于同一次测定中所有被激发原子的k均相同，故A ∝ N，可根据待测物信号强度确定其含量。null*减少误差的关键是测得准确的A值。 样品的准确称量和溶液的准确配制 准确的A值：提高灵敏度；减少测量误差 ★ 提高灵敏度——优化实验条件和准确处理图谱 灵敏度取决于激发态原子数（Nα）与基态原子数（Nβ）的比值，比值越高， 灵敏度就越高。其计算公式为： 实验条件优化：如提高磁场强度，采用低温探头等可提高灵敏度；增加样品浓度及采样次数等也可提高灵敏度； ★ 减少测量误差——足够的弛豫时间能确保已激发原子有充足时间回复到基态并再次激发，从而能多次采集信号并积累，提高准确度。 null* QNMR常用定量方法 绝对定量法 以含量已知的化合物为内标，与待测物制成混合溶液同时测定，通过两者峰面积的比值确定待测物的含量。适用于对照品难以获得的待测物（如新药）含量测定。 相对定量法 对含有两种或两种以上成分的混合物，比较其峰面积来确定其相对含量。主要用于复方制剂及中药中各成分相对含量测定、药物杂质限量检查等。null*对于待测物及内标，均应尽量选择含多个原子的孤立单峰作为定量峰，以保证有足够的积分范围；若化合物中多个峰均符合条件，最好全部采用，以减小测量误差。 内标应满足含量准确、化学性质稳定、溶解性好、其定量峰与待测物定量峰不重叠等要求。 常用内标： 芳环类：如1, 4-二硝基苯、香豆素、苯甲酸、 3, 4-二硝基甲苯、苯甲酸卞酯、马来酸等； 其他化合物：如 L-亮氨酸、异烟酰胺和咖啡因等。null* QNMR一般测定过程 根据QNMR的要求，初步选定实验参数后，通过优化实验参数，建立合适的实验条件，再进行待测物测定。 合适的图谱后处理（傅里叶变换、相位校正、基线校正和积分等），可在一定程度上改善峰型，减小积分误差，从而获得理想的测定结果。null*二、QNMR技术的应用 在含量测定方面的应用 在杂质检查方面的应用 在新药质量研究中的应用null* 在化学药物质量控制中，一般采用色谱法，并以含量已知的对照品对待测成分进行定量；若待测样品为无对照品的创新药，必须首先确定对照品含量。 原料药一般与新药对照品相似，待测成分含量高，故使用QNMR法同样能得到可靠的含量测定结果。 QNMR在含量测定方面的应用null*Application of nuclear magnetic resonance spectroscopy for quantitative analysis of miconazole, metronidazole and sulfamethoxazole in pharmaceutical and urine samples A.A. Salem，H.A. Mossa and B.N. Barsoum 应用核磁共振波谱法定量测定制剂及尿样中的咪康唑、甲硝唑和磺胺甲基异噁唑 J of Pharm Biomed Anal，41 (2006): 654-661null*Sulfamethoxazole 磺胺甲基异恶唑miconazole nitrate 咪康唑硝酸盐metronidazole benzoate 甲硝唑苯甲酸盐null*Amounts of miconazole, metronidazole or sulfamethoxazole per unit dose were calculated using the following equation: Adrug is the integral value for the drugs selected 1H NMR signals at 9.0, 8.06 or 7.5 pmm. Aint. stand is the integral value of the maleic acid absorbing 1H NMR signals at 6.26 ppm. Edrug is the formula weight of each drug divided by one absorbing protons in case of miconazole and metronidazole and divided by two in case of sulfamethoxazole. Eint. stand is the formula weight of maleic acid divided by the two absorbing protons (116.07/2 =58.04). Wint. stand is the milligram weight of maleic acid used in the assay .null*Regression equations: Y = 0.119X + 0.049（ authentic miconazle） Y = 0.209X + 0.031（ authentic metronidazole） Y = 0.234X − 0.124（ authentic sulfamethoxazole） Average recoveries: 97.54–101.10 （ authentic miconazle ） 98.06–100.46 （ authentic metronidazole ） 97.83–102.83 （ authentic sulfamethoxazole ） t检验结果表明QNMR法测得值与标示值间无显著性差异（P＞0.05）； F检验结果表明QNMR法与HPLC法测定结果间无显著性差异（P＞0.05）null* QNMR在杂质检查方面的应用 原料药与制剂的有关物质检查及稳定性考察中，均涉及到药物和杂质的含量测定，QNMR法的优势是可不经分离纯化而直接测定，并有可能提供药物中所有成分的整体信息。 在杂质检查方面，目前QNMR主要用于副产物和降解产物的含量测定， 如USP采用相对定量法测定奥芬那君柠檬酸盐的间位、对位异构体相对含量；在制剂的稳定性考察中，QNMR法用于溶出度与释放度测定的应用实例也在逐渐增多。 但不论是用于杂质检查还是稳定性考察，QNMR法目前仍不够成熟，尚有待改进。 null*肝素钠中的杂质检查 2008年2月，美国媒体报道了4位患者在使用百特公司生产的肝素钠后死亡的事件，引起世界关注，“肝素钠”事件爆发。 随后，部分西方主流媒体对死因具有争议的另81例患者进行了跟踪报导，引发国际社会的高度关注。 FDA称，百特公司使用的肝素钠原料药有一部分由美国SPL公司提供，而后者的生产基地为中国常州凯普生物化学有限公司。其技术人员利用两种先进的检测手段— CE 和 1H NMR技术已发现 “问题肝素钠注射剂” 中存在一种“类肝素样物质”。表明：“类肝素样物质” 约占总量的5%～20％。但到底是否是这种物质引起患者的严重不良反应，专家们尚无法肯定。 null*null*Heparin Sodium Identification 1H NMR Spectrum（See Nuclear Magnetic Resonance <761>） Standard solution: 精密称取USP Heparin Sodium Identification RS 适 量, 溶于含 0.02% (w/v) TSP-d4 （氘代三甲基硅烷基丙酸钠）的重水中，浓度不低于20 mg/mL System suitability solution: 溶解适量USP Oversulfated Chondroitin Sulfate RS （过硫酸化硫酸软骨素, OSCS）在液中，配成 1% (w/w) 的溶液 Sample solution: 精密称取肝素钠适量，溶于含 0.02% (w/v) TSP-d4 的重水中，浓度不低于 20 mg/mLPharmacopeial Forum Vol. 35(5) [Sept.–Oct. 2009] INTERIM REVISION ANNOUNCEMENTnull*signal 1 5.42 ppmsignal 2 5.21ppmsignal 3 3.28 ppmsignal 4 2.05 ppm ①，②，③号区间未知信号强度不得 高于信号1和信号2高度平均值的4%； ④号区间所有单个信号峰的强度不得 高于信号1和信号2高度平均值的200%①④②③TSP-d4的信号 0.00 ppmnull*合格样品图谱null*不合格样品图谱null* QNMR在新药质量研究中的应用 在创新药物的质量研究中，一般须先确定对照品（含量）。 新药对照品含量一般通过协作标定完成，首先用质量平衡法（分别测定其中挥发性物质、灰分、酸根和杂质含量）扣除对照品中的杂质；再用HPLC法和/或化学滴定法测定其含量。其中化学滴定法特异性差，色谱法中通常使用的归一化法，因其忽略了校正因子的差异而导致定量结果不够准确。 采用QNMR确定对照品含量，其特异性强，不受对照品限制，是其它方法的一种补充。 QNMR也可作为检验其它分析方法可靠性的手段之一。null*null*null*null*null*null* USP33采用绝对定量法，以亚硝酸异戊酯的α-亚甲基质子（化学位移为4.8 ppm）及内标苯甲酸卞酯中的亚甲基质子（化学位移为5.3 ppm）的信号峰为定量峰，测定亚硝酸异戊酯在原料药和制剂（如吸入剂）中的含量。 nullQNMR在新药对照品标化中的应用及流程 溶剂的选择 对照品（内标物）的选择 样品的配置 样品及对照品（内标物）定量峰的选择 仪器实验参数的选择（仪器方法学考察） 定量方法学考察 含量测定，并与其它方法比较*null溶剂的选择 CDCl3 DMSO-d6 DMSO-D6+D2O D2O*null对照品（内标物）的选择 文献报道常用的内标物存在的可能的缺点 与待测物相比，分子量小，带来称量的问题； 尖锐信号的卫星峰问题 建议 待测物与内标物分子量接近 用于定量的峰，待测物与内标物所选信号性质接近等 *null*null*null*null*null样品的配置 建议采用直接配置法，特别是方法学考察。*样品及对照品（内标物）定量峰的选择样品及对照品（内标物）定量峰的选择*null 样品及对照品（内标物）定量峰的选择 尽可能选用多个定量峰，取其平均值，以减少测定误差 *法学考察） 仪器实验参数的选择（仪器方法学考察） 法学考察） 仪器实验参数的选择（仪器方法学考察） *定量方法学考察定量方法学考察专属性 线性及范围 精密度 重复性 中间精密度 进样精密度 耐用性 稳定性 *null*依替米星 为我国自行研制开发的第三代氨基糖苷类抗生素。具有高效、广谱抗菌、无交叉耐药性等特点，不良反应低。nullnull 胺类样品成盐*null*null*null*null*null含 B 化 合 物 *null*null*null*null*null埃索美拉唑类*null*null*null*null*null*null*null*null*null*null*null*null*null*null*null普利类药物 群多普利*null*null*null*null*null*null*null*null*null关于DEPT谱*null*null*null关于新药结构确证资料 （新药申报9号资料）*药物结构确证研究注意事项 药物结构确证研究注意事项 1、结构确证测试项目选择的全面性 2、结构确证测试条件选择的合理性 3、结构确证综合解析的充分性 4、对测试样品、对照品方面的要求 本报告主要依据： 1、结构确证测试项目选择的全面性1、结构确证测试项目选择的全面性 研发者在进行结构确证研究时，测试项目的选择应依据：化合物结构特点、需要解决的结构问题、各种方法所能解决的结构问题、目前该化合物的已知信息等综合考虑。　　null通常我们关注药物平面结构的证明，而对于构型、晶型、结晶水/结晶溶剂的验证缺乏关注。 　　 例如：某化合物的有效晶型为A晶型，研究单位仅提供了四大光谱的详细数据和图谱，并与上市产品进行比较，但整个结构确证研究却没有晶型的数据和图谱，因此缺乏最重要的结构信息，该产品的结构也无法被完全、准确的确证。 　2、结构确证测试条件选择的合理性 　2、结构确证测试条件选择的合理性 获得真实可靠、清晰可辨、结论明确的测试图谱和数据是进行结构确证研究的基础和前提。特别是对于仿制药和国外已上市的新药，药物的结构确证可以通过与已上市药物的文献数据或是对照品的光谱数据进行对比推导。 因此在进行结构确证研究中合理选择测试条件需引起足够重视；测试条件的改变可以改变图谱的分辨率、也可以取得更多的结构数据和信息。2.1　红外光谱（基质的选择） 2.1　红外光谱（基质的选择） 目前红外光谱的测定方法有多种。例如，固态药物红外测试可采用压片法、糊状法、薄膜法；液态药物可采用液膜法测试；气态药物则可采用气体池测定。 　　 进行样品红外测试时应注意的是：部分含多晶型药物在研磨和压片过程中，其晶型也可能发生变化，此时可改用糊法测定，由于糊剂自身有吸收，因此应根据药物特点对糊剂的种类进行选择。 null 另外值得注意的是盐酸盐药物在采用KBr压片时可能会发生离子交换现象，应分别对氯化钾压片和溴化钾压片法测得的结果进行比较，并根据结果选择适宜的压片基质。2.2　核磁共振（溶剂的选择） 2.2　核磁共振（溶剂的选择） 溶剂峰或部分溶剂中的溶剂化水峰可能对药物部分信号会有干扰作用，在对比核磁共振（NMR）数据时，应注意溶剂峰对图谱解析的影响。因此选择适宜的溶剂或采用适宜的方法，以使药物所用信号得到充分显示，对药物结构解析有重要意义。　　null研发时测定NMR图谱过程中，研究人员除考虑溶剂对药物的溶解性，还要考虑到溶剂峰对图谱解析时产生的干扰和对化学位移的影响。因此对于有文献报道的药物，测定时建议研究者最好选择与文献中一致的溶剂，便于解析图谱时进行对比。 null如没有文献报道，在选择测定NMR的溶剂时，应尽量避免溶剂或部分溶剂中的溶剂化水峰对药物部分信号的干扰和掩蔽。并结合其它的图谱信息做出正确的判断。2.3　质谱（电离源的选择） 2.3　质谱（电离源的选择） 目前质谱常用的离子源有EI、CI、FAB、FD、FI等等。其中EI属于硬电离，其最易实现、图谱再现性好、有较多的碎片离子，但有些化合物得不到分子离子峰。其它属于软电离，较易得到丰度较大的准分子离子峰，但碎片离子峰较少。由于分子离子峰是确证化合物（药物）分子量、分子式的有力证据，应根据化合物（药物）自身结构特性选择适宜的离子源和强度，同时尽可能地获得分子离子峰和较多的、可反映出化合物（药物）结构特征的碎片峰，这是进行该项测试的关键。 3、结构确证综合解析的充分性3、结构确证综合解析的充分性在结构确证申报资料中存在的问题主要体现在：解析不充分，未对各项研究提供的数据和信息进行有机、深入、合理地综合分析，仅是机械式地罗列测试数据和图谱，没有综合解析过程，割裂了各种测试数据的联系，以致未达到对药物结构进行准确认识的目的，特别是在药物结构中的某些信息需多种方法相互结合才能作出准确判断或多种方法相互结合方可进一步深入了解药物结构信息的情况下，该现象表现得尤为明显。4、对测试样品、对照品方面的要求4、对测试样品、对照品方面的要求测试样品的处理:样品的精制方法和纯度情况对于结构确证结果的可靠性至关重要。 　 一般情况下，测试样品要采用和原料药制备中相同的精制方法、工艺条件进行精制；对于进行晶型分析、结晶水/结晶溶剂分析时尤其需要注意，因为不同的精制方法和工艺条件可能产生不同的晶型、结晶水/溶剂。null样品的纯度对结构研究具有非常重要的意义。供试样品的纯度需要进行一定的控制，使用纯度不够的样品进行结构研究有可能带来错误的结构信息。一般供试样品的纯度应大于99.0%；对于手性药物，应考虑增加对对映体、非对映体检查，光学纯度要求一般不低于99.5%。 对照品的合法来源对照品的合法来源 若使用对照品进行结构确证，需要说明对照品的合法来源。有的申报资料中，未选择上市原料药或其他合法对照品，而是采用自己单位精制的产品，这种“自身”对照的数据和图谱对于结构确证没有任何帮助。结构确证具体要求结构确证具体要求确证药物的分子量（MS） 确证药物分子式（HRMS, EA+MS 等） 确证药物的平面结构（NMR, IR, UV等）， 再由2D-NMR确证其各片断的连接方式 确证药物的晶型、结晶水等（IR, DSC, TG, PXRD） 立体结构（主要由旋光、CD谱、NOE等） 综合解析（见前述要求）nullEA：一般测定C,H,N,S，有时要测定卤素及P等的含量 UV：主要确证共轭体系 IR：主要验证各种特征基团，特别是化合物是否成盐。胺盐在3000~2000波数有特征吸收；羧酸盐在1600和1400波数有特征吸收 MS：主要用于确定分子量及碎片离子 HRMS：用于确定分子式（对于含量达不到99%以上、成盐、含结晶水的药物尤其重要）nullNMR(1D NMR, 2D-NMR)：确定药物结构及各片断的连接方式、空间构型等，并进行完整质子和C信号的归属 DSC：确定药物是否含结晶水、熔点（或熔融分解点）等，与晶型有关 TG：确定结晶水含量（如有）及样品分解温度 PXRD：确定药物晶型（或无定型） 旋光：与药物构型有关 综合解析：对药物整体结构进行合理解析实 例实 例下面结合实例，说明如何对NMR谱进行完整归属及对资料进行综合解析（个人观点，仅供参考） 1、首先由氢谱确定质子数是否与结构相符；由碳谱及 DEPT谱确定C数及种类是否与结构相符； 2、由氢谱（质子数、峰形、偶合常数等）、COSY谱结 果对明显的质子先进行归属，无法明确归属的质子再 结合其它2D谱的结果；null3、在质子明确归属的前提下，由HSQC/HMQC谱确定非季C归属； 4、由HMBC谱并结合C的化学位移值对季C进行归属，同时对不能明确的质子再进一步进行归属； 5、有时还需要借助NOE的结果进行归属； 6、对于复杂结构化合物，特别是有多个饱和环的化合物，如甾体类、生物碱等，就可能不能用前述常规方法进行质子信号归属，而须由C谱入手，并结合该类化合物的文献碳谱 数据进行归属； 7、如有文献值，可直接引用。null轮胎样品检测 *null*null*null*null*null*null*问题问题部分问题 我想作异核的乙酰氨基上的氢对羧基上的碳的NOE效应，选用zgcw 的脉冲程序将中心发射频率放在δ＝8.0处，发射功率PL2w为：13.28w，另一个Fid 发射功率PL2w为0来得到没有NOE的数据。其他条件一样。峰面积之比计算NOE的η值。 另外，能否用ZGIG程序来代替功率为零的程序来得到没有NOE效应的FID？ 能否降低SWH的值来只得到指定H的NOE效应 *null关于核磁管的清楚 关于核磁管无法取出 关于NOESY谱和ROESY谱的优、缺点？以及注意点？*null谢谢大家！