精子畸形试验

石河子大学续页 （内容与进程） 实习六 小鼠精子畸形试验 一、目 的 精子畸形试验是受试化学毒物能否破坏哺乳动物精于正常形态的实验。通过该实验，学习和掌握小鼠精子畸形试验的原理和步骤。 二、原 理 精子畸形是指精子的形状异常和异常稿子数量的增多。生殖系统对化学毒物的作用十分敏感，在其它系统还未出现毒性反应之前，生殖系统可能已出现了损害作用。正常情况下，哺乳动物的精液中也存在少量的畸形精子，但在某些化学毒物的作用下，特别是在可引起生殖细胞遗传性损伤的化学毒物作用下，哺乳动物睾丸产生的畸形精子数量可大量增加。因此，可以用检查雄性动物接触化学毒物后精子畸形率的高低，来反映该化学毒物的生殖毒性相对生殖细胞潜在的致突变性。 化学毒物引起精子畸形的机制尚未完全清楚。正常情况下，精子的成熟和正常形态发生过程受多种基因调控，一旦这些基因中的一个或多个在化学毒物的作用下发生突变，就会导致畸形精子数量的大量增加。一般认为，常染色体上的基因控制精子畸形，Y—性连锁基因控制畸形精子的表现。某些特异的染色体重排，如性、常染色体易位，是化学毒物诱发哺乳动物精子畸形率增高的主要机制。 三、器材和试剂 （一）器材 眼科手术剪、眼科镊子、玻璃平皿、显微镜、擦镜纸、带橡皮头吸管。 （二）试剂 磷酸盐缓冲液(称取Nacl 8g、Kcl0.2克、KH2PO40.12g、Na2HPO40.91g，用蒸馏水溶解并定容至lL)、生理盐水、甲醇(分析纯)、甲基磺酸甲酯或甲基磺酸乙酯或环磷酰胺、2％伊红水溶液。 四、操作步骤 （一）动物选择 成熟的大鼠、小鼠均可使用。一般采用雄性小鼠，年龄宜在6—8周。因小鼠较为经济，且有大量实验证实小鼠在该试验系统中对化学毒物员为敏感。 （二）剂量与分组 试验至少应设3个以上剂量组，并同时设立阳性对照组和阴性对照组。接触 石河子大学教案续页 （内容与进程） 化学毒物后每组至少应存活5只动物。最高剂量组5天总剂量应能使部分动物死亡。 一般可采用LD50的2—4倍剂量，或预先做5天给予化学毒物的LD50。，以求得最高总剂量，然后以它的l/2(或1／5、1／10)作为下一剂量组的接触剂量，依此类推。 阳性对照可用环磷酰胺20mg/kg或甲基磺酸甲酯75mg／kg或甲基磺酸乙酯60mg/kg进行腹腔注射，每天一次，连续5天。阴性对照选用与受试化学毒物相同体积的溶剂。 对于不稳定或稳定性不详的受试化学毒物，应每天新鲜配制。 (三)染毒与采样 可采用一次或每天一次连续5天的方法进行染毒。染毒途径多用腹腔注射，也可采用与人体实际接触化学毒物相同的途径，如经口、吸入和皮肤接触等。 一般认为精原细胞后期或初级精母细胞早期对化学诱变剂较为敏感、在接触化学毒物后4—5周精子畸形率最高，故选择在第—次染毒后第35天进行采样。也可在染毒后第l、第4和第10周分三次采样，或者在染毒后每周采样一次，连续进行动态观察，直至精子形态恢复正常。 (四)制片 用颈椎脱臼法处死小鼠，剪开腹腔，分离并摘取双侧附睾，将附睾放入盛有约3ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的小平皿中。以眼科剪将附睾尾剪成小块，用吸管将悬浮液轻轻吹打5—6次，静置3—5min，用四层擦镜纸滤除组织碎片，吸取此精子悬液滴于清洁载玻片上，均匀推片，待被片晾干后用甲醇固定5min，干燥后即可镜检观察精子形态。也可用2％的伊红水溶液染色1—2h后再作镜检。 (五)阅片 在高倍镜下检查精子形态，可加上蓝色或绿色滤光片。每只小鼠检查完整的精子200—500条，每个剂量组至少检查1000条精子。 1. 正常精子的形态 正常精子似蝌蚪状，由头、体、尾三部分构成。 （1）.头部略扁，呈卵圆形，轮廓规则，顶体清楚，顶体帽覆盖头部表面的l/3以上，在精子头部前端呈透亮区。头长3～5um，宽2～3um，长宽比为1.5～2:1，长宽比值是判断精子形态是否正常的重要数据之一。 （2）.体中段细长，不到头宽的 l/3，轮廓直而规则，与头纵轴成一直线， 石河子大学教案续页 （内容与进程） 长约5～7um，宽 lum。 （3）.尾部细长，外观规则而不卷曲，一般长50～60um。 HE染色，顶体呈淡红色，核位于顶体基部，呈紫红色，尾部呈淡紫红色。改良巴氏染色，顶体呈淡绿色，核呈紫红色，尾部呈绿色。 2.精子畸形主要表现在精子的头部，可分为：无钩、香蕉形、无定形、双头、胖头、尾折叠及双尾等形态。 3.注意事项 在镜检时．要持别注意区分两条精子部分重叠所造成的假双头或假双尾精子、头部重叠或全部重叠的精于、无尾精子不进行计数。 五. 结果分析与评价 分别计算各剂量组的稿子畸形发生率。各剂量组的稿子畸形率与阴性对照组之间的差异分析采用秩和检验。 由于不同品系小鼠的精子畸形率本底值差异较大，且影响的因素也较多，故在结果分析时，应首先观察阳性和阴性对照组的试验结果。阳性对照组精于畸形率的增高应在本实验宰的历史范围之内，并与阴性对照组有显著性差异(p 石河子大学教案续页 （内容与进程） ＜0.01)、阴性对照组的畸形精子率也随与自己实验室的历史记录相接近，否则所得结果不可靠、试验应重做。 出现可重复的剂量反应关系时，可判断试验结果为阳性。即要约定某一化学毒物为精子畸形诱变剂，至少应该有两个相邻剂量组的精子畸形率比阴性对照组显著增高（P＜0.01）或达到阴性对照组的2倍或2倍以上，并且试验结果能够重复，则也可认为试验结果阳性。如果试验组的染毒剂量已使动物发生死亡，而精子畸形仍未见增加，则可判定试验结果为阴性。在受试化学毒物的毒性作用较低而不至于引起动物死亡时，应当记录最大的染毒剂量。 精子畸形试验还可进行畸变类型分析，不同部位的畸形对精子的活动能力及使卵子受孕的能力有不同的影响。可以结合精子计数、精子运动能力试验等对化学毒物对雄性生殖系统的毒性作用做进一步的检测。 六、注意事项 1. 在该试验过程中，虽然将精子悬液采用离心等方法除去组织残渣后再制片效果会更佳，但这使制片过程变得复杂化且更易造成人为误差。 2. 在镜检时要注意鉴别制片过程中人为造成的精子损伤。特别要注意由于精子重叠和交叉所造成的如多头、双头、双尾及多尾畸形等假象。 3. 在结果判定时，要注意排除机体某些如缺血、变态反应、感染和体温增高等可能导致精子畸形率增高的因素，以免造成假阳性结果。 PAGE 1 第 页